פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש באורגנואידים שמקורם בביופסיה ובטכנולוגיית איברים על שבב כדי ליצור שבב מעי רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לחזות פרמקוקינטיקה ואינטראקציה בין תרופות ותרופות ולחקור תפקוד לקוי של מחסום אפיתל במעיים. איחוד אורגנואידים בטכנולוגיית איבר על שבב מאפשרים לנו לשחזר את המורכבות של אפיתל המעי. בנוסף, הוא מאפשר שליטה ניסיונית רבה יותר ברמזים המכניים, בהתפלגות הזרימה ובשיפועים הביוכימיים.
שיטה זו מחקה את הפיזיולוגיה המורכבת של המעי האנושי, ומעניקה הבנה טובה יותר של הבסיס התאי והמולקולרי של תפקודי מעיים תקינים ופתולוגיים. זה עוזר לחזות טוב יותר פרמקוקינטיקה ופרמקודינמיקה ומועמדים פוטנציאליים לתרופות כדי למנוע נזק דלקתי. זריעה היא שלב קריטי בפרוטוקול.
פיצול מוגזם או צפיפות זריעה לא מדויקת של שברי האורגנואיד במעיים עלולים לפגוע בהתפתחות ובהבחנה של מחסום האפיתל. כדי להתחיל, לשאוף את המדיום מן התרבות האורגנואידית הסטטית. לשחזר מדיה ממספיק בארות כדי להשיג צפיפות זריעה סופית של שמונה מיליון תאים למיליליטר.
הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת דיסוציאציה של BMM קר כקרח לכל באר וחברו את ה-BMM המסולסל מפני השטח של הבאר. לאסוף את ההשעיה לתוך צינור קשירה חלבון נמוך 15 מיליליטר ומניחים אותו על קרח. יש לנער בעדינות את השפופרת כל 15 דקות למשך שעה.
צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לקבל גלולה אורגנואידית. אם שכבת ג'ל שקופה נצפתה מעל הכדור, לשאוף פתרון מן הצינור. השהה את הכדור והוסף נפח שווה של תמיסת דיסוציאציה BMM.
לדגור על קרח במשך 10 דקות צנטריפוגה. יש לחזור על הפעולה עד שלא יהיו שאריות BMM מסיסות. לאחר מכן להשליך את supernatant ולתלות מחדש את הכדור בשני מיליליטר של תמיסת עיכול אורגנואידים.
דגרו את הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שלוש דקות והוסיפו שמונה מיליליטר של DMEM F12 מתקדם כדי לעצור את התגובה האנזימטית. צנטריפוגה והחייאת הכדור במדיום גידול אורגנואידי שלם כדי להשיג שמונה מיליון תאים למיליליטר. Aliquot 360 microliters בצינורות סטריליים 1.5 מיליליטר נמוך חלבון קשירה.
לאחר מכן, להסיר את המדיום מן הערוץ העליון של שבבים מצופים ולהוסיף 30 microliters של ההשעיה התא. דגירה של השבבים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה כדי להדביק את שברי האורגנואידים לממברנה. הוסף שלושה מיליליטרים של מדיום גדילה אורגנואידי שלם טרום שיווי משקל למאגר הכניסה העליון ושלושה מיליליטרים של מדיום צמיחת תאי אנדותל טרום שיווי משקל במאגר הכניסה התחתון.
הוסף 300 מיקרוליטרים של אותה מדיה במאגרי היציאה העליונים והתחתונים בהתאמה. העבר את המגש הנושא את המודולים הניידים למודול התרבית. על מודול התרבית, הפעל שוב ושוב את מחזור הפריים עד שייווצרו טיפות מספיקות לחיבור מוצלח של השבבים.
לאחר מכן החלק את נושאת השבבים לתוך המודול הנייד. לאחר מכן התחל את מחזור הוויסות בן השעתיים כדי ללחוץ על מדיית התרבות במודול הנייד ובשבב ולאחר מכן התנאים המתוכנתים יתחדשו. לאחר מכן, שנה את הגדרות המתיחה והפעל את מודול התרבות.
לאחר 24 שעות, חזור על המחזור עם 10% מתיחה ואת אותו תדירות. כדי להכין מדיית מינון או בקרת רכב, דלל את פתרונות מלאי ה-CYP או DMSO במדיום גדילה אורגנואידי שלם ובמדיום צמיחת תאי אנדותל. השהה את מודול התרבית והבא את המגשים לארון הבטיחות הביולוגית.
החלף את המדיה בכל מאגרי הכניסה והיציאה בשני מיליליטר של מדיית מינון עם משרנים או בקרת רכב. החזר את המודולים הניידים בחזרה למודול התרבית והפעל מחדש את הזרימה במהירות של 30 מיקרוליטר לשעה. החלף את המדיה בתמיסת השראה טרייה כל 24 שעות והמשך את התרבות במשך 48 עד 72 שעות.
לאחר מכן הביאו את המגשים לארון הבטיחות הביולוגית ושאפו את מדיום המינון מכל המאגרים. יש לשטוף ולהחליף את מאגר הכניסה העליון במדיום DMEM F12 מתקדם וחם ואת המאגר התחתון במדיום צמיחת תאי אנדותל. החלף את מדיום הכביסה במיליליטר אחד של תמיסת מצע בדיקה.
למזג את השבבים בקצב זרימה גבוה של 1, 000 microliters לשעה במשך חמש דקות ולשאוף הן מאגרי מוצא העליון והתחתון. החזירו את השבבים למודול התרבית ודגרו במשך שעה אחת תחת זרימה קבועה של 300 מיקרוליטר לשעה. לאחר שעה של טיפול, עצרו את הזרימה והביאו את המגשים לארון הבטיחות הביולוגית.
אספו 100 מיקרוליטרים של שפכים ממאגר היציאה העליון והוסיפו אותם לצינור המכיל 200 מיקרוליטרים של תמיסת עצירה. מניחים את הצינורות מיד על קרח יבש ומאחסנים את הדגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס. לשטוף את שני הערוצים עם 200 microliters של DPBS סטרילי.
לאחר מכן חסום את שקע הערוץ התחתון עם קצה פיפטה מסנן של 200 מיקרוליטר. מחלחלים 50 מיקרוליטרים של תמיסת הדיסוציאציה דרך התעלה התחתונה ודוגרים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. ודא ניתוק מלא של תאי האנדותל ולהסיר את פתרון הדיסוציאציה מן הערוץ על ידי פיפטינג.
יש לחזור על הכביסה. לאחר מכן, לחסום את מוצא הערוץ העליון ו perfuse 75 microliters של חלבון lysis buffer. משאירים את קצה הפיפטה מוכנס ודוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לאסוף את התא lysates בצינור 1.5 מיליליטר על ידי pipetting חמש עד 10 פעמים. חזור על זילוף ואיסוף כדי לקבל ניתוק מלא של תאים ולאחסן את הליזטים במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הניתוח. עבור תזה של RNA, בצע את אותו הליך תוך שימוש ב-150 מיקרוליטרים של מאגר RNA lysis.
ראשית, הכינו תמיסת מינון אינטרפרון גמא על ידי דילול תמיסות המלאי במדיום צמיחת תאי אנדותל ללא גז. בארון biosafety, הסר את המדיום ממאגרי הכניסה בתעלה התחתונה והחלף אותו בשלושה מיליליטר של תמיסת המינון היומית. לאחר מכן מכניסים את המגשים למודול התרבות ומכניסים את השבבים בקצב זרימה גבוה של 1, 000 מיקרוליטר לשעה למשך חמש דקות.
החלף את קצב הזרימה ל -60 מיקרוליטר לשעה והמשך את התרבית הנוזלית. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של DPBS לכל באר לצלחת בעלת דופן שחורה של 96 בארות. באמצעות פיפטה רב ערוצית, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של הקולחים מכל המאגרים לבארות המתאימות.
כדי להכין עקומה סטנדרטית, בצע דילול פי שלושה של המדיום המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של שלושה קילודלטון דקסטרן מפל כחול ב- DPBS. לאחר מכן בצע הזיות סדרתיות באמצעות דילול משולש של מדיום צמיחת תאי אנדותל ב- DPBS. מאפיינים מורפולוגיים מובהקים של שבבי התריסריון והמעי הגס הודגשו על ידי נוכחותן של תצורות דמויות וילי בשבב התריסריון המייצגות את הארכיטקטורה של המעי הדק.
בשבב התריסריון שנחשף לציטוכרום P450 משרה rifampicin וויטמין D3, היה ביטוי גבוה של גנים mRNA עבור התרופה מטבוליזם אנזים ציטוכרום P450 3A4 ופעילות קטליטית משופרת של אנזים ציטוכרום P450, מה שמצביע על תגובות אינדוקציה מתאימות בין כל שלושת התורמים האורגנואידים. לאחר טיפול מונולאייר אפיתל של שבב המעי הגס עם אינטרפרון גמא, מורפולוגיה התא נפגע ואובדן אפיתל columnar נצפו. כמו כן, הטיפול באינטרפרון גמא הוביל לאות ציטופלסמי מוגבר של חלבוני צומת הדוקים ודבקים בהשוואה לבקרת הרכב, והראה תזוזה של סמני צומת הדוקים ZO-1 וקלודין 4 והפנמה של occludin ו- E-cadherin.
עלייה משמעותית בחדירות הפארא-תאית האפיתליאלית נצפתה לאחר 48 שעות של גירוי אינטרפרון גמא על שבבי המעי הגס. באופן דומה, אינטרפרון גמא משרה הפעלה של אפופטוזיס המצוין על ידי עלייה בתכולה התוך תאית של Caspase 3 נבקע. אינטרפרון גמא גרם להפרשה מקוטבת של מולקולות מעודדות דלקת בשבב המעי הגס כפי שמוצג על ידי ההפרשה הבזולטרלית של VCAM-1 ואינטרלוקין-6 וההפרשה האפיקלית של ICAM-1 וחלבון עמילואיד בסרום A.לתרבית שבבי מעיים מוצלחת, יש להשתמש באורגנואידים לא מובחנים ולעקוב אחר הוראות הפיצול וצפיפות הזריעה.
לאחר התבססות מוצלחת של שבב המעי, אנו יכולים לחקור את הספיגה, ההובלה והמטבוליזם במעיים, רמות חומרי מזון והפרשת הורמוני מעיים, אינטראקציות בין פתוגנים של חיידקים מארחים, בטיחות ויעילות של תרופות, מנגנוני מחלה ספציפיים למטופל ותגובות לטיפולים.
