זהו הדו"ח הראשון המוכיח כי הזרקה תוך-שרירית מלעורית מונחית אקוקרדיוגרפיה של קרדיומיוציטים משפרת באופן משמעותי את המאפיין המתקן של קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPS אנושי. שיטה זו אפשרית, משביעת רצון, חוזרת על עצמה הליך פחות פולשני ויעיל למתן טיפול קרדיומיוציטים הנגזרים מ- iPS אנושי. אנו מאמינים כי מתן תוך שריר הלב מלעורית היא שיטה בטוחה ויעילה למתן תרופות מקומיות למחלות כולל מחלת לב איסכמית, אוטם שריר הלב ואי ספיקת לב.
פרויקט זה מפוקח על ידי פרופסור ג'ינפו יאנג ופרופסור ג'ון פנג. הדגמת ההליך תהיה שון וו, קייל צ'ין וקון שיאנג, MD PhDs מהמעבדה שלי ודי וואנג, דוקטורט ממעבדת המפתח המחוזית של הונאן לחקר הלב וכלי הדם. בתור התחלה, ואקום שואפים את הסופרנאטנט התרבותי מתרבות של 60 יום של hiPSC-CMs.
שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים. לאחר מכן נתקו את hiPSC-CMs לתאים בודדים באמצעות תערובת אנזימי ניתוק התא בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאסוף את התאים בצינור 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של RPMI בתוספת B27 בינוני ולערבב.
ספור את התאים וחשב את מספר התאים הכולל. צנטריפוגו את מתלה התא ב-300G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה במדיום התמיכה בקרדיומיוציטים לריכוז של 6X10 מהתאים ה-4 למיקרוליטר.
מניחים את הצינורית על 37 מעלות צלזיוס עד שלב ההזרקה. לאחר העכבר הוא מורדם מספיק, לתקן את הגפיים ואת הזנב עם קלטת. לאחר מכן, תקן את חותכות העכבר עם חוט משי 2/0 קלטת.
לעקר את הצוואר החציוני ואת החזה השמאלי עם שלושה סיבובים לסירוגין של בטאין ואחריו אלכוהול. בצע חתך צוואר חציוני באמצעות מספריים אנטומיים עדינים ומלקחיים מנתחים עדינים. חתכו כמה שרירי צוואר הרחם הקדמיים כדי לייצב ולחשוף באופן מלא את קנה הנשימה.
הכנס מחט ניקוב צנתר 20 מד כצינור קנה הנשימה דרך הפה. חבר את צינור קנה הנשימה למכונת ההנשמה ובדוק את תנועת בית החזה כדי לוודא ששתי הריאות מאווררות היטב. התאימו את פרמטרי הנשימה.
לאחר מכן, תקן את הגפה האחורית השמאלית לצד הימני התחתון ושחרר את הסרט סביב הגפה העליונה השמאלית. בעזרת מספריים ומלקחיים מנתחים עדינים, בצעו כריתת בית החזה בחלל הבין-קוסטלי של בית החזה השמאלי. בעזרת מלקחיים, מקלפים את קרום הלב ומאתרים את העורק הכלילי היורד הקדמי השמאלי.
השתמש בחוט משי 6/0 כדי לקשור את הקצה הפרוקסימלי של העורק. כדי להבטיח שמודל אוטם שריר הלב החריף יוקם, יש להמתין עד שהצד הדיסטלי של העורק באתר הקשירה ישתנה מאדום ללבן. סגור את החזה שכבה אחר שכבה ותפר את העור בחוט 4/0.
עבור קבוצת בעלי החיים המזויפים, בצע את כל ההליכים הכירורגיים למעט קשירה. בשבועיים הראשונים לאחר אוטם שריר הלב, יש להכניס את העכברים לקופסת הרדמה המחוברת לאיזופלואורן 5% ולבצע אינטובציה בקנה הנשימה. שלושה ימים לפני מתן hiPSC-CMs, להזריק cyclosporine A לתוך חלל intraperitoneal במינון של 10 מיליגרם לק"ג ליום.
הסר את השיער מן החזה ואת הבטן העליונה של העכבר עם קרם depilatory. ספק איזופלואורן שאיפה עד שקצב הלב נשמר על 400 עד 500 פעימות לדקה. תקן את גפיים וזנב העכבר עם סרט על קונסולת האיתור ולהגדיר את טמפרטורת הפלטפורמה על 37 מעלות צלזיוס.
החל את ג'לי אולטרסאונד על הבטן העליונה. באמצעות בדיקת אולטרסאונד וטרינרית ברזולוציה גבוהה, להשיג תמונות כבד עכבר. באמצעות מזרק מיקרו חמישה מיקרוליטר, לצייר כ 3 x 10 כדי hiPSC-CMs 5.
החזק את המזרק והכנס מחט שלושה מילימטר בתהליך הפרקסיפואיד השמאלי. תחת הנחיית אולטרסאונד, עקוב אחר הקצה העליון של הסרעפת. שימו לב לקצב הנשימה ולטווח.
הזן את קרום הלב בסוף מעגל expiratory, הימנעות נזק לכבד ולריאות. לאחר מכן לרכוש את תמונת הציר הארוך parasternal של לב העכבר על ידי אקוקרדיוגרפיה במצב B. תחת הנחיה קולית, להזריק 1 x 10 לתאי hiPSC-CMs 5th לתוך כל אחד משלושת האזורים השוליים של אתר האוטם.
הסר את בדיקת האולטרסאונד ושטוף את הג'לי. גמלו את העכבר מההרדמה והחזירו אותו לכלוב. להזריק cyclosporine A ברציפות במשך חודש לאחר ההשתלה.
אקו לב של החדר השמאלי הראה כי הפציעות עקב אוטם שריר הלב היו הפוכות בקבוצת המינון המרובים. השתלת hiPSC-CMs הביאה גם להגדלת מקטע הפליטה והתקצרות השברים. מדידת פרמטרים לבביים באמצעות צביעת סיריוס אדום וירוק מהיר הראתה כי גודל האוטם ומקטע נפח הקולגן ירדו, בעוד שעובי דופן החדר השמאלי הקדמי גדל לאחר ההשתלה.
תיוג עבור אלפא אקטין לא ספציפי בירוק, DAPI בכחול, וטרופונין T ספציפי לאדם באדום הראה נוכחות של תאים מושתלים באוטם ובאזור אוטם שולי. מספר התאים המושתלים ושיעורם היו גבוהים יותר בקבוצת המנות המרובות בהשוואה למנה בודדת. 28 ימים לאחר אוטם שריר הלב, קבוצת המינונים המרובים הראתה עלייה במספר התאים המבטאים את סמן תאי האנדותל, I-B4.
צביעת אגלוטינין של נבט חיטה וצביעת אלפא אקטינין סרקומרית על קרדיומיוציטים הראתה ירידה בקוטר הסיבים המינימלי. מספר נמוך יותר של גרעיני קרדיומיוציטים חיוביים בקבוצת המינונים המרובים הצביע על אפופטוזיס מופחת. בדיקת PCR זיהתה את הדנ"א המיטוכונדריאלי האנושי רק בלב, והראתה השתלה ספציפית.
בעת החדרת המחט, יש לוודא שהיא נכנסת לחלל קרום הלב יחד עם השוליים העליונים של הסרעפת ובקצה מעגל התפוגה כדי למנוע פגיעה בכבד או בריאה.
