מכשירים אלקטרוניים אורגניים גמישים לטיפול בשדה חשמלי פועם של גליובלסטומה

פרוטוקול זה מאפשר העברת שדות חשמליים דופקים על ידי אלקטרוניקה גמישה כדי לחקור את ההשפעות הטיפוליות שלהם על גליובלסטומה. אנו עושים זאת על ידי הדמיה של מיקרו-סביבת הגידול in vivo באמצעות הדמיה. הביואלקטרוניקה משתלבת בפרוטוקול זה באמצעות מספר מודלים שונים של מורכבות הולכת וגוברת על מנת לחקור את ההשפעה של שדות פועמים על סרטן.

טכניקות המיקרו-פבריקציה המוצגות בעבודה זו יכולות להיבדק גם כאמצעי לטיפול בסוגים אחרים של סרטן, כולל xenografts שמקורם בחולה. זה נע לקראת הרעיון של רפואה מדויקת המותאמת לכל מטופל בנפרד. בדיקות אלה מיוצרות בטכניקות מיקרו-פבריקציה סטנדרטיות, כך שהייצור פשוט וכל מי שיש לו חדר נקי יכול לייצר אותן.

עבור דפוס אלקטרודות זהב, הפקידו שכבה של שלושה מיקרומטר של פארילן C עם מערכת שיקוע פארילן על ידי הצבת שקופיות הזכוכית הנקייה בתא התצהיר. שוקלים שישה גרם של פארילן C בסירת אלומיניום, מניחים אותו בכבשן, מפנים את המכונה ומתחילים את התצהיר עם הפרמטרים המתוארים בכתב היד. כאשר התצהיר הסתיים וטמפרטורת הוופורייזר נמוכה מ -40 מעלות צלזיוס, כבה את הצ'ילר, הוופורייזר, הכבשן.

אווררו את המכונה ואספו את הדגימות. סובב לצפות את הדגימות שטופלו פלזמה עם photoresist שלילי ב 1, 000 פעמים G במשך 40 שניות. חשוף את photoresist דרך מסיכה הכוללת את עיצוב האלקטרודה הבין-ספרתית.

לאחר מכן טבלו דגימות במפתח ללא יוני מתכת למשך שלוש דקות כדי להסיר את התנגדות האור שאינה חשופה. כדי להפקיד שכבת הדבקה של כרום בגודל 20 ננומטר ושכבת זהב של 300 ננומטר עם מאייד תרמי, אווררו את מכונת המאייד והדביקו את הדגימות על הצלחת העגולה העליונה באמצעות ברגי מתכת. מלאו את כורי ההיתוך הייעודיים בהתאמה בכרום ובזהב.

אטמו ופנו את המכונה והתחילו בסיבוב של מחזיק הדגימה. בחר את כור ההיתוך המכיל כרום והגדל לאט את הזרם עד שקצב השקיעה מגיע ל -0.2 אנגסטרום לשנייה. פתחו את התריס, המתינו עד לשקיעה של 20 ננומטר כרום, סגרו את התריס והורידו לאט לאט את הזרם עד אפס מיליאמפר.

בחר את הזהב המכיל כור היתוך והגדל לאט את הזרם עד לקצב שיקוע של 0.2 אנגסטרום לשנייה. פתחו את התריס כדי לאדות את הזהב, המתינו עד לשקיעה של 10 ננומטר זהב, ואז הגדילו את קצב השקיעה ל-1.5 אנגסטרומים לשנייה עד לכ-300 ננומטר. סגרו את התריס והגבירו באיטיות את הזרם לאפס מיליאמפר.

לטבול את הדגימות בתוך המכילה אצטון. לאחר מכן לשטוף את הדגימות עם isopropanol ולייבש אותם עם אקדח אוויר. יש לסובב ארבע שכבות של תמיסת PEDOT:PSS במהירות של 150 פעמים G למשך 35 שניות.

הסר את שכבת parylene C קורבן על ידי טבילת הדגימות במים. טבלו את הדגימות במים שעברו דה-יוניזציה למשך 30 דקות כדי להסיר את שאריות הסבון והתרכובות בעלות המשקל המולקולרי הנמוך בסרט PEDOT:PSS ולנתק את הדגימות ממצע הזכוכית. מוסיפים 75 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז מותכת 1% בכל באר של צלחת 96 באר בזהירות ולתת לו להתמצק במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

נתק את תאי הגליובלסטומה המומרים שהתקבלו במהלך יצירת קו התא היציב. הוסף 10, 000 תאי גליובלסטומה לבאר והשלם את הנפח הכולל ל -150 מיקרוליטר לבאר באמצעות DMEM המכיל גרם אחד לליטר גלוקוז, L-גלוטמין, נתרן פירובט ונתרן ביקרבונט, 10% נסיוב בקר עוברי, 100 יחידות למיקרוליטר פניצילין, ו -100 מיקרוגרם למיקרוליטר סטרפטומיצין. החליפו מחצית מהמדיה במדיה טרייה כל יומיים עד לניסויים נוספים תוך שמירה על קצה הפיפטה בחלק העליון של הבאר כדי למנוע נזק לאגרוז או לספרואיד עצמו.

מניחים את הביצים המופרות של שליו יפני, Coturnix japonica, באינקובטור על מגשים עם מסובב אוטומטי שהופך ביצים כל שעתיים. יום זה נחשב ליום אפס עוברי. ביום השלישי העוברי, פתחו בעדינות את הביציות באמצעות פינצטה עם קצוות דקים שטופים מראש עם 70% אתנול.

יוצקים את העובר לסירת שקילה מפלסטיק, מכסים אותו בסירת שקילה נוספת ומניחים אותו באינקובטור לח סטנדרטי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. ביום העובר השישי, לעשות חתך קטן בקרום chorioallantoic עם מחט 23 מד. מניחים ספרואיד של שבעה ימים על החתך באמצעות פיפטה ומחזירים את העובר לאינקובטור למשך שלושה ימים עד לניסויים נוספים.

מניחים טיפה של DPBS כדי לכסות את craniotomy. הנח את האלקטרודה הגמישה על טיפת DPBS והנח בעדינות את החלק האחורי של הגשושית עם רפידות המגע על גב העכבר. לספוג את טיפת DPBS עם פיסת נייר קטנה עד שהגשושית יכולה לשכב שטוחה על הדורה ולעקוב אחר העקמומיות של המוח, להבטיח שהשכבה הקטנה של מי מלח תישאר מתחת לאלקטרודות כדי לשמש מחסום מפני זליגת דבק.

הניחו טיפה קטנה של דבק סיליקון על הגשושית וכסו אותה בזכוכית כיסוי עגולה בקוטר חמישה מ"מ. דחפו את זכוכית הכיסוי כלפי מטה עד שהסיליקון מפוזר באופן שווה והמרחק בין זכוכית הכיסוי לבדיקה הוא מינימלי. לאחר מכן המתינו 30 שניות עד שהסיליקון יתמצק.

כדי לאבטח את זכוכית הכיסוי, מרחו במהירות דבק-על על צדדיו ודחפו אותו כלפי מטה עד שהדבק יתמצק. מרחו דבק-על על צוואר הגשושית באמצעות קיסם, ודאגו שדבק העל יישאב מתחת לצוואר כדי לספק תמיכה יציבה. כסו את הגולגולת במלט דנטלי לבניית כובע כרוני והקפידו במיוחד לכסות את שולי זכוכית הכיסוי בלבד.

הרימו את החלק האחורי של הגשושית ומרחו מלט מתחת לצוואר הבדיקה. שאר הבדיקה על המלט לפני שהוא נרפא. דחפו מטה את צוואר הגשושית בעדינות כדי למקם את פני השטח שלה באותה רמה כמו זכוכית הכיסוי ולא בדרך של מטרת המיקרוסקופ במהלך הניסוי.

כסו את החלק העליון של צוואר הבדיקה בלא יותר מ -1.5 מילימטרים של שכבת מלט דנטלי כדי להשיג אחיזה איתנה בבדיקה. בנו באר צמנט המציגה רכס של 1.5 מילימטר במילימטר עד שני מילימטרים סביב זכוכית הכיסוי כדי ליצור אגן לנוזל הטבילה עבור שני הדמיית הפוטון. לאחר שהמלט נרפא, יש לבצע שיכוך כאבים לאחר הניתוח ולשמור על חום החיה עד להחלמה על ידי עטיפתה במגבת נייר והצבתה קרוב לנורת אינפרא אדום.

האלקטרודות מצופות PEDOT:PSS מציגות את האזורים הנשלטים הקיבוליים וההתנגדותיים האופייניים המופרדים בתדר חיתוך, בעוד שהאלקטרודות הלא מצופות מציגות התנהגות קיבולית בלבד. צמיחת הספרואידים שנצפתה במיקרוסקופ שדה בהיר גילתה כי נדרשים לפחות יומיים או שלושה כדי להשיג ספרואידים כדוריים וצפופים בהתאם לקו התא ומספר התאים שנזרעו. במודל in ovo, ניתן להעריך את השתל של ספרואידים בקרום הכוריאואלנטואי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי מכיוון שבתאים חיים יש סידן תוך תאי וניתן להעריך את כלי הדם של הגידול על ידי הזרקת צבע פלואורסצנטי לכלי הדם.

בהשוואה לעכבה בתמיסת מלח, צפויה עלייה של העכבה in vivo בתדרים מעל 100 הרץ עקב נוכחות של סביבה ביולוגית. ניתן לצפות ולאפיין את הפרנכימה העצבית של כלי הדם ואת חדירת הגידול דרך המצע השקוף במשך שבועות על ידי שני מיקרוסקופ פוטונים. השימוש בבעלי חיים טרנסגניים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בתאים בעלי עניין יכול להדגים את התהליך הדלקתי המינימלי המושרה על ידי השתלת אלקטרודות בלבד.

זה יכול להראות נוכחות של מיקרוגליה ומונוציטים 26 ימים לאחר ההשתלה פולסים שדות חשמליים אלקטרודה מגורה. הן מונוציטים היקפיים שמקורם והן תאי מיקרוגליאה בעלי תהודה מוחית נמצאו סביב הגידול ובתוכו. הנקודה הקריטית להצלחה בהליך ההשתלה היא הבטחת האיטום והשטיחות של חלון הגולגולת ואופטימיזציה של איכות המגע עם הבדיקה.

בנוסף להדמיה התוך-חיונית, מה יכול לשקול לשלב את הפרוטוקול שלנו עם מדדים וטכניקות אחרות כמו דגימות ומדדים של עבודת דם עבור ציטוקינים, מצב חיסוני על ידי ציטומטריה זרימה, או אפילו ניתוח התנהגותי. עבודה זו סוללת את הדרך לשימוש במכשירים מושתלים גמישים לסרטן ופותחת אפשרויות חדשות לשימוש ברפואה ביואלקטרונית למחלה כרונית זו.