פרוטוקול זה מאפשר שחזור תלת-ממדי של אברונים בצורה פשוטה וחזקה, תוך שהוא נגיש למעבדות שאין להן כיום מיקרוסקופים של אלקטרונים בנפח מומחה. טכניקה זו גמישה ביותר, ומספקת רזולוציית X/Y מצוינת, תוך היכולת לצלם מחדש דגימות במידת הצורך. הוא גם תואם לטומוגרפיה של הטיה כאשר נדרשת רזולוציית Z גבוהה מאוד.
טכניקה זו מאפשרת חקירות של מורפולוגיה אברונית בהקשר בין-אברוני. לכן, ניתן להרחיב אותו כדי לבחון כל מצב פתולוגי עם פגמים אברוניים. גישה זו יכולה לספק תובנה לגבי אינטראקציות אברונים ואירועי סחר בתאים.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על רקמות אחרות, מודלים אורגנואידים, ומערכות תרביות תאים, בנוסף hepatocytes. משתמשים בפעם הראשונה עשויים למצוא חתך סדרתי ולהרים מאתגרים ללא אובדן. מומלץ להיות בקיאים בחתך דק במיוחד רגיל לפני החלת פרוטוקול זה על מדגם יקר ערך.
התחל על ידי חיתוך קפדני של הרקמה המוטבעת בשרף באמצעות סכין גילוח כאשר הדגימה נעולה במתאם הזמירה. העבר את תיבת הדגימה יחד עם הצ'אק והדגימה לזרוע הדגימה של המיקרוטום ומיקם את ארון הדגימה כך שטווח הנסיעה של התיבה יעבור מלמעלה למטה. מניחים ונועלים את סכין היהלום במחזיק הסכין, ומבטיחים שזווית החיתוך של הסכין מוגדרת כראוי.
נעל את מחזיק הסכינים לתוך הבמה בצורה מאובטחת. כבו את תאורת הבמה, הפעילו את תאורת הבמה, הזיזו בזהירות את הסכין לכיוון הדגימה, תוך כוונון מתמיד של הזווית הצידית של הסכין, הטיית הדגימה וסיבוב הדגימה על ידי התאמת הידיות הרלוונטיות עד שפני הבלוק מיושרים לקצה הסכין. הגדר את החלק העליון והתחתון של חלון החיתוך של זרוע הדגימה והשאר את הדגימה ממש מתחת לקצה הסכין.
מלאו את סירת הסכינים במים נקיים ומזוקקים פעמיים וודאו כי פני המים מתואמים עם קצה הסכין וקעורים מעט. לאחר מכן, התחל לחתוך חלקים. עצרו את החיתוך רגע אחרי שהדגימה עברה את קצה הסכין.
השתמש ברשת חריצים ריקה כדי להעריך את מספר המקטעים שיש לאסוף בכל רשת. באמצעות ריסים בכל יד, חלקו בעדינות את הסרט לסרטים קטנים יותר שיכולים להתאים לאורך רשת החריצים. רשום הערה מנטלית של מיקומם היחסי בתוך המדגם.
באמצעות מוט אפליקטור מזכוכית, רחפו טיפה של כלורופורם מעל החלקים כדי לשטח אותם החוצה. הרימו את רשת החריצים הריקה הראשונה עם המלקחיים הממוספרים הראשונים וטבלו אותה בעדינות בטריטון X-100 ולאחר מכן פעמיים במים המזוקקים. השתמש בפיסת נייר סינון כדי להסיר את עודפי המים מקצה המלקחיים.
באמצעות מלקחיים, הורידו בעדינות כ-2/3 מרשת החריצים המצופה בפורמבר לתוך המים של סירת הסכינים. ודאו שצד הפורמבר פונה כלפי מטה והקצה הימני הארוך של החריץ נמצא על פני המים ומקביל לשפת המים. סובבו בעדינות את הרשת במים לכיוון הסרטים, כך שעם השבץ החוזר, המקטעים נסחפים לכיוון הרשת.
המשך לעשות זאת בתנועות קטנות יותר ויותר, עד שהקצה הימני של הסרט יתיישר עם הקצה הימני של החריץ. לאחר מכן, עם ה-waft האחרון, העלו בעדינות את הרשת למעלה כדי לאסוף את החלקים לרשת החריץ. הניחו מספר כדורים של נתרן הידרוקסיד מתחת למכסה צלחת פטרי כדי לספק סביבה נטולת פחמן דו-חמצני.
לאחר מכן, בזהירות פיפטה 40-מיקרוליטר טיפות של ציטראט עופרת של ריינולד על הפרפילם, טיפה אחת לכל רשת. הופכים כל רשת על טיפת העופרת ציטראט ומשאירים מוגנים על ידי מכסה צלחת פטרי למשך 7 עד 10 דקות. בזמן שהרשתות מכתימות, הניחו חמש טיפות של מים מזוקקים בערך 300 מיקרוליטר לכל רשת על הפרפילם.
בסוף הדגירה של עופרת ציטראט, מעבירים כל רשת לטיפת מים מזוקקים כדי לשטוף אותה במשך דקה אחת מבלי לנשום ישירות ברשתות. חזור על כך ארבע פעמים נוספות. השתמש במלקחיים מוצלבים ממוספרים כדי להרים את הרשת הראשונה.
גע בקצה הרשת כדי לסנן נייר כדי לפתות את רוב המים ולאפשר לייבש את המלקחיים במשך 20 דקות לפחות. חזור על פעולה זו עבור כל רשת. בהגדלה נמוכה, שימו לב לסדר, למיקום ולמיקום של המקטעים הטוריים.
נווט אל החלק האמצעי של הסדרה ברשת. עיין במדגם וזהה אזור עניין. לאחר מכן, התבונן במדגם בהגדלה הרצויה.
שקול לאסוף את הסדרה בהגדלה מעט נמוכה יותר, מכיוון שלעתים קרובות החלקים אינם מיושרים בצורה מושלמת, וייתכן שיהיה צורך לחתוך תמונות מאוחר יותר. לאחר מכן, צלם תמונות הפניה בהגדלה נמוכה יותר. זה יעזור להעריך את ההקשר של אזור העניין, זה מיקום גס בהגדלות שונות ביחס לגבולות המקטע, ותכונות ציון דרך בתוך המדגם.
השתמש בהם כדי לסמן את אזור העניין בסעיפים אחרים. עבור הפניה למסך, השתמש במרק דבק רב-פעמי, במדבקות או בפיסת נייר מקרן תקורה המודבקת על המסך כדי להציב טושים זמניים על המסך. זה יאפשר לדמיין מחדש באופן שגרתי את אותן תכונות של אזור העניין במרכז התמונה לאורך כל מערך הנתונים.
פתחו את מחסנית התמונות, ציינו את מדידות הווקסל ובחרו בכרטיסיה 'סגמנטציה' כדי להתחיל בסגמנטציה. לחץ על חדש בחלונית עורך הפילוח כדי להגדיר אובייקטים חדשים ברשימת החומרים. לחץ לחיצה ימנית כדי לשנות את צבע האובייקט ולחץ פעמיים כדי לשנות את שם האובייקט.
עבור סגמנטציה ידנית, בחר בכלי הפילוח שמתחת לרשימת החומרים ובחר בכלי המברשת המוגדר כברירת מחדל כדי להדגיש את הפיקסלים. תמונת מיקרוסקופיית האלקטרונים של שני הפטוציטים מנוגדים מוצגת כאן. הדמיית הגדלה גבוהה יותר מאפשרת תצפית על הפרטים המורפולוגיים של האברונים השונים ברזולוציה ננומטרית.
התמונה הייצוגית מציגה את הגרסה המקוטעת של אותה טומוגרמה, עקבות של הרשתית האנדופלסמית, המיטוכונדריה והמגעים הבין-ממדיים בין ה-ER למיטוכונדריה של מרחבים שונים מוצגים כאן. התמונה הייצוגית מציגה שכבת אורתו-פרוסה מוטה עם עקבות סגמנטציה ומיקומה היחסי בתוך המיטוכונדריה כולה. שחזור תלת-ממדי של האברונים המפולחים והמגעים האנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בזוויות שונות מוצגים כאן.
מכיוון שפרוטוקול זה תואם לטומוגרפיה של הטיה כאשר נדרשת רזולוציית Z גבוהה מאוד, הוא מסייע לפתור מבנים קטנים או מפותלים. טכניקה זו מושלמת להערכה ראשונית של הקשר המרחבי בין אברונים שונים, ולכן שימושית במיוחד בתחום המתקדם של מגעי ממברנה בהומאוסטזיס של הממברנה.
