שיטת qRT-PCR זו יכולה לענות על שאלות הקשורות ליצירת פרופיל ביטוי מיקרו-רנ"א בסרום של עכברים במצבים כגון פגיעה כלייתית תלוית גיל. הטכניקה מאפשרת זיהוי ביטוי מיקרו רנ"א בדיוק וברגישות גבוהים על ידי תהליך פשוט החוסך זמן ומונע טעויות טכניות. כדי להתחיל, לחדור את העור של הבטן באמצעות פינצטה ומספריים כירורגיים.
חותכים את השרירים בקרום הצפק משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות. הרם את קרום הצפק באמצעות פינצטה, ולעשות חתך לרוחב בקצה העליון עם מספריים כירורגיים. ממשיכים את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות.
זהה את הווריד הנבוב התחתון באמצעות שני מקלוני צמר גפן לחים PBS. הכנס מחט של 30 גרם המחוברת למזרק של 1 מיליליטר לתוך הווריד הנבוב התחתון, ומשוך את המזרק. לאט לאט למשוך את המחט החוצה כדי למנוע המוליזה.
מעבירים את הדם לצינור שפיץ של מיליליטר אחד עם הפרין, ומערבבים על ידי היפוך. צנטריפוגה של צינור spitz במשך 10 דקות ב 3000 פעמים G בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.
קח 200 מיקרוליטר של דגימת סרום, והוסף 1, 000 מיקרוליטר של מגיב ליזה על בסיס פנול / גואנידין. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות, ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם, ומערבבים על ידי היפוך הצינור 15 פעמים.
דגירה של הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה. מבלי להפריע לכדור, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 450 מיקרוליטרים של 100% אתנול, ומערבבים את הצינור למשך 5 שניות.
לאחר מכן טען 700 מיקרוליטרים של הדגימה על עמוד ספין מעוגן ממברנה, וצנטריפוגה אותו. השליכו את הזרימה, והוסיפו 700 מיקרוליטרים של Wash Buffer 1 המסופקים בערכה. צנטריפוגה שוב, ולהשליך את הזרימה.
חזור על לשטוף עם 500 microliters של Wash Buffer 2 כדי להסיר מלחי קורט. הוסף 500 מיקרוליטרים של 80% אתנול, צנטריפוגה, והשלך את הזרימה דרך צינור האיסוף. צנטריפוגה עמודת ספין שוב, ולהעביר את הטור לצינור איסוף טרי 1.5 מיליליטר.
לאחר מכן מוסיפים 14 מיקרוליטרים של מים ללא RNase, ודוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו את העמודה שוב במשך דקה אחת ב-15000 פעמים G בטמפרטורת החדר. הכינו תמיסת תערובת מאסטר, והוסיפו 8 מיקרוליטרים לבאר בצינור רצועה של 8 בארות.
הוסיפו 12 מיקרוליטרים של הרנ"א הכולל המופק בכל צינור, וצנטריפוגה של הצינור למשך 15 שניות ב-2000 פעמים G בטמפרטורת החדר. מניחים את הצינור במחזור תרמי, ומתחילים את הדגירה כדי לסנתז את ה-cDNA. לאחר הדגירה, העבירו את ה-cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.
יש לדלל את ה-cDNA פי עשרה במים מזוקקים. ואז מערבולת, ואחריה צנטריפוגה במשך 5 שניות ב 2000 פעמים G בטמפרטורת החדר. בצינור מיקרוצנטריפוגה, הכינו את תמיסת תערובת האב כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ומערבבים את הפתרון.
הוסיפו 22.5 מיקרוליטרים בכל באר של צלחת בת 96 בארות, ואחריהם 2.5 מיקרוליטרים של cDNA. אטמו את הצלחת באמצעות סרט דבק, וסובבו את הצלחת למשך 30 שניות במהירות של 1000 פעמים G.הניחו את הצלחת במערכת ה-PCR בזמן אמת. שנה את ההגדרות על-ידי מתן שם לניסוי.
לאחר מכן בחר 96-well 0.2 מיליליטר כסוג הניסוי, CT השוואתי כשיטת הכמות, סטנדרטי כמצב הפעלת המערכת, וריאגנטים ירוקים SYBR כריאגנטים לזיהוי רצף המטרה. ספק שמות לדגימה ול-miRNA היעד בכל באר. הקצה דגימות כפולות, בחר דגימת ייחוס ופקד אנדוגני, ובחר ללא עבור הצבע שישמש כהפניה הפסיבית.
כדי למנוע זיהום צולב מגיב, הגדר טרנסקריפטאז הפוך שלילי ובקרה שאינה תבנית לביטוי miRNA. לאחר מכן יש לוודא שנפח התגובה מוגדר ל-20 מיקרוליטרים, ותנאי מחזור ה-PCR נקבעים על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לאחר השלמת התהליך, לחץ על ניתוח כדי לנתח את נתוני qRT-PCR.
ודא ששורת הסף שנבחרה באופן אוטומטי על-ידי התוכנית מתאימה לכל באר. בדוק את ערך מחזור הסף של הבקרה האנדוגנית ו- miRNAs היעד שנותחו בכל דגימה. קבע את ערכי ה- CT לפי ההצטלבות של עקומת ההגברה וקו הסף.
נתוני miRNA qRT-PCR עבור מודל הפגיעה הכלייתית תלוית הגיל הראו כי בהשוואה לעכברי בקרה SAMR1, רמת הכליות של miRNA-7219-5p עלתה באופן משמעותי בעכברים ניסיוניים SAMP1, בעוד שרמת הכליות של miRNA-7218-5p ירדה. רמות הביטוי של miRNA-223-3p לא השתנו באף אחד מהזנים. רמות ה-miRNA-7219-5p וה-miRNA-7218-5p בסרום עלו במידה ניכרת בעכברי SAMP1, בעוד שרמות ה-miRNA-223-3p לא השתנו.
אתה צריך להכניס את המחט לתוך הווריד הנבוב נחות ולחלץ דם מבלי לחדור את כלי השיט. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בפרופיל ביטוי מיקרו-רנ"א בסרום עכברים עבור מגוון רחב של מצבים פתולוגיים.
