המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטות ניתוח עבור הרגל הבוגרת של Drosophila. טכניקה זו מסירה חלק מהקציקט, וחושפת את הרקמה הבסיסית באופן המשמר את ארכיטקטורת העצב והשרירים. הליך זה מאפשר לנו לאפיין את הצומת הנוירו-שרירי עבור ארבורים נוירונים מוטוריים מזוהים, באמצעות טכניקות כימיות אימונוציטיות סטנדרטיות.
הניתוח שימושי במיוחד לחקר שינויים ניווניים איטיים המתרחשים לאורך פרקי זמן ארוכים יחסית. היבט הזמן הוא שיקול חשוב, כי הצומת הנוירו-שרירי המאופיין היטב של זחלי Drosophila יציב במשך כחמישה עד שבעה ימים לפני תחילת מטמורפוזה. לעומת זאת, הנוירונים הבוגרים נוכחים לאורך כל חייו של זבוב מבוגר, כ -90 יום עבור סוג פראי, מעבדה גדל Drosophila melanogaster.
הטכניקה גמישה וניתן ליישמה במגוון גנוטיפים למודלים שונים של מחלות, ולהשתמש במגוון נוגדנים הזמינים עבור Drosophila כמערכת מודל. המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים שיטות ניתוח עבור הרגל הבוגרת של Drosophila. טכניקה זו מסירה חלק מהקציקל, וחושפת את הרקמה הבסיסית באופן המשמר את הארכיטקטורה העצבית והשרירית.
בעזרת מברשת צבע, מעבירים זבובים למתנול קר בבאר זכוכית או צלחת במשך כ-30 שניות עד דקה. המתנול מטביע את הפחמימנים החתוך, וכעת ניתן לשקוע בזבובים ולא לצוף בפתרונות מימיים. עם מלקחיים, בזהירות להעביר זבובים PBS.
יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBS קר כקרח כדי להסיר מתנול עודף, ולשמור זבובים ב-PBS על קרח עד לניתח לקיבעון. בשלב זה, זבובים צריכים להיות ניתחו ותיקון בתוך הזמן הקצר ביותר האפשרי, רצוי פחות מ 30 דקות. מעבירים זבובים לצלחת חיטוי אלסטומר מלאה ב-PBS קר.
הסר את הרגליים המטה-תותוריות בקוקסה באמצעות שני זוגות של מלקחיים דומונט מספר חמש, או לחתוך את הרגליים עם מספריים Vannas. מעבירים את הרגליים לבאר בפלסטיק, 24 צלחת היטב מלאה במיל אחד של PBS, ושומרים את הצלחת על הקרח עד שכל הרגליים מוסרות ומועברות לבארות. אנחנו בדרך כלל משתמשים 20 רגליים לבאר.
החלף את פתרון PBS בפתרון FA מיליליטר אחד, וסובב על מטור במשך 30 דקות. יש להגדיר את הגדרת המטורף במהירות בינונית. ודא שהרגליים שקועות לחלוטין בתמיסה במהלך תקופה זו.
כדי להסיר את פתרון FA, לשטוף במיליון PBS אחד שלוש פעמים במהירות, ואחריו שלוש כביסות נוספות במשך חמש דקות כל אחד במיל PBS אחד. החזק רקמות במיליון PBS על קרח, לפני ובמהלך שלבי הניתוח. כדי לספק סקירה קצרה של האנטומיה של רגל Drosophila, מקטעי הרגליים מסומנים, כולל קוקסה, trochanter, עצם הירך, השוקה, וחמישה מקטעי טרסל.
כאן אנו רואים מבט אחורי על הרגל, המוכר על ידי נוכחות של זיפים חושיים בניגוד לחיתוך עירום נוכח בצד האחורי. הכיוון של הציר הפרוקסימלי-דיסטלי וציר הגחון-גחון מצוין גם הוא. הליך ניתוח זה מסיר חתיכה קטנה של חתך עצם הירך הפרוקסימלית, כך ארבורים אקסון, אשר פרויקטים דורי, innervating שריר מנוף השוקה, ניתן ללמוד.
העבודה הקודמת שלנו התמקדה בארבור המצוין, שמקורו בשושלת עיניים נוירובלסט משוערת. בחלק זה של ההליך, אנו מסירים חתך מהצד הצידי של עצם הירך. המלקחיים הניתוחים הם קריטיים להצלחה, ומצאנו כי הצגת עיקול קל בסוף מספר חמש מלקחיים סופר עדינים מספקת שיפוע המאפשר לתפוס את הקיטור באופן שטחי, ולא להידחף, מה שיכול להרוס את הרקמה.
מעבירים את הרגליים לצלחת אלסטומר סיליקון ב-PBS לצורך ניתוח. בעזרת זוג מלקחיים אחד, הצמידו את מקטע השוקה לצלחת אלסטומר הסיליקון כפי שמוצג כאן בצד ימין. באמצעות המלקחיים האחרים החזיק צד משופע כלפי מטה, לתפוס חתיכת חתך בקצה הדיסטלי של עצם הירך ולמשוך בכיוון הפרוקסימלי לכיוון trochanter.
שמור באופן שיטתי הסרת חתך עד השריר העירום נראה לאורך הקצה הפרוקסימלי של עצם הירך. לאחר שכל הרגליים נותחו, החליפו את PBS בתמיסת FA לרגליים פוסטפיקס במשך 30 דקות עם רעד על nutator במהירות בינונית. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות במיליון PBS אחד במשך שלוש פעמים מהר, ולאחר מכן שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד בפתרון PBT.
כדי לחסום רקמות, החלף PBT מיל אחד עם פתרון חסימה המורכב אחד מיל 5% סרום עז נורמלי מדולל PBT. דגירה רגליים ניתחו במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר, או לילה בארבע מעלות צלזיוס. הסר פתרון חסימה והחלף בנוגדן ראשי אשר מדולל בחסימת פתרון.
כאן, אנו משתמשים אנטי דיסקים גדולים 1 עד 200 דילול. מחזירים את הצלחות לשייקר ודגרים בארבע מעלות בלילה. לאחר הדגירה העיקרית של הנוגדנים, יש לשטוף נוגדנים ראשוניים במיל' PBT למשך שלוש פעמים לזמן קצר, ולאחר מכן שלוש פעמים במשך 15 דקות כל אחד.
לחסום רקמות שוב בטחינה אחת 5% סרום עז נורמלי לפחות שעתיים בטמפרטורת החדר, או לילה בארבע מעלות צלזיוס. הסר את פתרון החסימה והוסף 300 מיקרוליטרים של הנוגדנים המשניים המודללים המתאימים. בנוסף, להוסיף אחד עד 2000 דילול של פלואורסצנטיות מול פאלואידין תווית שריר.
כדי לדגור, לאטום בארות עם סרט איטום מעבדה מכסה. כמו כן, לעטוף צלחות בנייר אלומיניום כדי להגן על פלואורופורים מפני אור. דגירה במשך שש עד שמונה שעות בטמפרטורת החדר, או לילה בארבע מעלות צלזיוס.
כדי להסיר נוגדן משני לא מאוגד, לבצע שטיפות עם PBT באופן דומה שתואר בעבר בעת שטיפת נוגדן ראשוני. לאחר שלב זה, הדגימות מוכנות כעת להתקן ולתמונה. מסדרים את הרגליים בצד למעלה, ומכסים עם מדיית הרכבה נוספת במידת הצורך.
מגרדים בעדינות את פינות הכיסוי על פני כדור חימר. החימר המתקבל ישמש כמרווח בין השקופית למשטח הכיסוי, כך שהרקמות לא יימחצו. לחץ על החלקה עד שהוא נוגע בחלק העליון של הרגליים.
לאטום את הקצוות עם לק ולאחסן בארבע מעלות עד הדמיה. תמונה על-ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות פרמטרי הדמיה המתוארים בסעיף ארבע של הפרוטוקול הכתוב. כדי לסייע באמת פרוטוקול הניתוח, אנו מדמים תחילה את רגלינו לפי מיקרוסקופיה ניגודית פאזה בהגדלה נמוכה.
הנה דוגמה בפאנל A של ניתוח טוב בצד שמאל, וניתוח רע בצד ימין שבו סיבי שריר שובשו. פאנל C מציג תמונה קונגוקל של ניתוח טוב שבו השריר לא הופרע. לעומת זאת, פאנל D מראה רגל פגועה במהלך הניתוח, שבו סיבי שריר חסרים, כפי שצוין על ידי החץ.
כאן, הכתמנו רגליים תדמיתיות עם peroxidase אנטי חזרת כדי לזהות תהליכים עצביים, המוצגים כאן בירוק, אנטי דיסקים גדולים, אשר מקל על קיבוץ קולטן גלוטמט postsynaptic, מוצג באדום, ו פאלואידין לתייג שריר, מוצג בכחול. כאשר נלכד בהגדלה של פי 20 עם ערוץ אור משודר, קל לראות את האזור נותח. שים לב כי נוגדנים לחדור חלקית לאזורים לא מזוהים, וניתן לראות דרך החתך כפי שצוין על ידי החץ הלבן.
כל אחד מהנוירונים המוטוריים של הרגל מבצע תחזיות סטריאוטיפיות בעת השריר הפנימי. העבודה שלנו מתמקדת בנוירונים מוטוריים המ innervating שריר מנוף השוקה, המוצג כאן כאזור הקופסה ומצוין על ידי החץ הלבן. בהגדלה גבוהה יותר 60X עם זום פי 2 בצד ימין למעלה, אנו יכולים לדמיין ביעילות זרי פרחים, המוצגים בירוק, ו- DLG שמסביב מוצג באדום.
הגדלת הזום עוד יותר, או צעד למטרה 100X, מאפשר כימות של גודל בוטון ומורפולוגיה כפי שמוצג בימין התחתון. באמצעות טכניקת ניתוח זו בשילוב עם אימונוציטוכימיה, מצאנו כי יש נפיחות בוטון תלוי H במודל מוטציה sod1 של ALS, המוצג כאן ברגליים H71Y מיושנות, לעומת פקדי סוג בר כפי שצוין על ידי החצים. גדלי בוטון מנוטרלים בחלקת נחיל דבורים מימין.
מצאנו גם ירידה בסמן האזור הפעיל Bruchpilot, המוצג באדום, בתוך אקסונים HRP מוכתמים חלשים, המוצגים בירוק, של מוטציות H71Y. כדי לחקור ניוון עצבי, אגרגטים חלבון בכל מקום מזוהים לעתים קרובות על ידי הנוגדן FK2, ומוצג כאן כמו FK2 חיובי puncta, האקסונים והשרירים של זבובי H71 זדקנים בצד ימין, המצוין על ידי החצים. לבסוף, המיטוכונדריה יכולה להיות חזותית על ידי אימונוציטוכימיה באמצעות נוגדן חד שבטי נגד ATP5a, כפי שמוצג כאן באדום בתוך שריר מנוף השוקה.
גילינו שהמיטוכונדריה גדלה עם הגיל במוטנטים של H71Y. לאחר שליטה, הכנת הרגל ניתח וכתמים נוגדנים הקשורים יאפשר לך לנתח שינויים מולקולריים בצומת neuromuscular למבוגרים עבור המוטציה המועדפת עליך בנקודות זמן שונות.
