זהו הפרוטוקול הראשון המדגים את ההדבקה המשותפת המוצלחת של מערכת הקורטיקוספינלית בחולדות ילודים. הוא מספק תוכנית מדויקת כדי לחקור כיצד תת-אוכלוסיות בודדות של תאים ביונקים צעירים תורמות להחלמה מפגיעה בחוט השדרה. כמו טכניקות וקטור ויראליות כפולות אחרות, שיטה זו מאפשרת למשתמש להתמר במדויק תת-אוכלוסיות ספציפיות של נוירונים, בתורו, ומאפשר לחוקרים לזהות את היעילות של טכניקות כימוגנטיות שונות בקידום ההתאוששות.
היינו מצפים מחוקרים שאינם מכירים את הטכניקה הזו להיאבק באיתור האנטומיה הנכונה של עמוד השדרה. ולכן אנו ממליצים לך לספור ללא הרף את מקטעי החוליות לעתים קרובות ותמיד לחזור לציוני הדרך שלך. לאחר אישור עומק ההרדמה בגור ספראג דאולי ילודים, זהה את האזור בו יבוצע החתך על ידי לחיצה על המלקחיים בקו האמצע בחלק העליון של הקרקפת, תחושה לתפר הסגיטלי.
החזקת העור מתוח כדי להבטיח חתך נקי, ישר ומדויק, בצע חתך של סנטימטר אחד לאורך מישור התפר הסגיטלי החל מיד מעל קו I. לאחר מכן, זהה את הברגמה על ידי בדיקה עדינה של המלקחיים לאורך פני השטח של הגולגולת, תוך שימת לב לקווי התפר ולכניסה הנגרמת על ידי המלקחיים העוברים לאורך העצמות הקודקודיות והמצחיות. שמרו על הפתח על ידי הפעלת ווים משוקללים בצד העניין.
נקה את האפונורוזיס באמצעות שילוב של קצוות כותנה ומספריים זעירים כדי למקסם את החשיפה של הברגרמה לדיוק מוגבר. ודא שהתפר הכתר נמצא בראייה ברורה מספיק לרוחב כדי לספק תבנית גסה להזרקות הבאות. בעזרת המיקרו-מספריים, חותכים חתך של כשלושה על שני מילימטרים של עצם הגולגולת הקדמית השמאלית הסמוכה לברגמה.
נקה כל פסולת, נוזל מוחי ודם בעזרת קצוות כותנה. כדי להזריק את הנגיף, הניחו את המחט במקומה ותכנתו את המזרק להזריק מיקרוליטר אחד בקצב של 250 ננוליטר לדקה. עם השלמת ההזרקה, לאפשר למחט לנוח בקליפת המוח במשך שלוש דקות.
חזור על הזריקות בקואורדינטות האחרות בסך הכל שלוש זריקות לאורך קליפת המוח ביחס לברגמה, כולן בעומק של 0.6 מילימטרים. לאחר השלמת ההזרקות, תפרו את הקרקפת והעבירו את החיה לשולחן הניתוחים השני לכריתת צוואר הרחם. למשש את בסיס הגולגולת באמצעות אצבעות כדי לזהות את אתר החתך.
החזיקו את העור מתוח על ידי הפעלת מתח עם האגודל והאצבע המורה. באמצעות להב מספר 11, מתחילים את החתך בקו האמצע אחד עד שני מילימטרים אחוריים לבסיס הגולגולת ומאריכים את החתך סנטימטר אחד אחורי כדי לחשוף את השריר השטחי. באמצעות הנקודה החדה של הלהב, בעדינות לבצע סדרה של חתכים לאורך קו האמצע של השריר השטחי כדי לחשוף את חלל עמוד השדרה ואת שרירי עמוד השדרה העמוקים.
לאחר מכן השתמש זוג מלקחיים כדי לפתוח את השריר ולדמיין את חלון הניתוח. לאחר חשיפת שרירי עמוד השדרה העמוקים, הכנס רטרקטורים לחלון הניתוח והחזיר את חלון הניתוח לרוחב של שבעה עד שמונה מילימטרים, מה שמאפשר מבט ללא הפרעה על עמוד השדרה. זהה את החוליה הצווארית השנייה על ידי התהליך הסיבובי הבולט שלה המקרין באופן דורסני ועוטף שריר גדול בצורת כיפה.
בעזרת הקצה השטוח של מגרד עצם, יש לגרד בעדינות את שריר עמוד השדרה העמוק לצדדים כדי לחשוף את חוליות C3 ל-C7. התחילו מדיאלית וגרדו לרוחב לאורך הכיוון המקביל ללמינאה של החוליה כדי להבטיח חשיפה נכונה, מה שמאפשר הבחנה ברורה של הלמינה החולייתית. לשלוט על כל דימום עם קצוות כותנה.
שימוש ב- C2 כמדריך בעת ספירת רמות החוליות, חותכים בזהירות את הקצוות הצדדיים של הלמינה הסחוסית ב- C6 ו- C7 באמצעות זוג מספריים זעירים. באמצעות זוג מלקחיים עדינים, הסר בזהירות את החלק המנותק של הלמינה כדי לחשוף את חוט השדרה, וודא כי חלון עמוד השדרה גדול מספיק כדי להתאים לאתר ההזרקה הרצוי. הניחו את החיה במחזיק הגולגולת הסטריאוטקסי והניחו חתיכת גזה מגולגלת מתחת לגזע החיה כדי להגביה את רבעיה האחוריים.
לפני תחילת הזריקות, נקה את חלון עמוד השדרה מכל דם או נוזל מוחי על ידי החלת קצוות כותנה ומשולשי סוגי לאזור, תוך הקפדה שלא להעליב את חוט השדרה. יתר על כן, ליצור מחסום סביב היקף החלון על ידי הצבת חתיכה קטנה של כותנה נספגת בחלקים הצדדיים של חלון עמוד השדרה כדי למנוע חסימה של אתר ההזרקה על ידי דימום מתמשך או דליפת CSF. להזרקות ישירות לחוט השדרה, השתמש בקצה מחט הזרקת הזכוכית כדי להעריך את קו האמצע של חוט השדרה על ידי זיהוי עורק עמוד השדרה.
לאחר מכן, הנח את המחט רק אחורית ללמינה C5 בקו האמצע המשוער והשתמש בה כנקודת הייחוס. לאחר מכן, באמצעות מיקרו מניפולטור, להזיז את המחט לרוחב ימינה על ידי 0.3 מילימטרים ולהוריד את המחט עד שהוא רק נוגע פני השטח של חוט השדרה. מעומק זה, צללו את המחט.
0.6 מילימטרים לתוך חוט השדרה. הזריקו מיקרוליטר אחד של הנגיף הקשור לרטרו אדנו שניים הנושאים את הגן Cre recombinase במהירות של 250 ננוליטר לדקה. לאחר מכן המתן שתי דקות עד שהנגיף יתפזר לתוך חוט השדרה לפני שתמשוך לאט את המחט.
התיוג של נוירונים בשכבה חמש של דרכי הקורטיקוספינליות בקליפת המוח המוטורית של חתך קורונל מוחי המבטא DREADDs תלויי Cre mCherry יחד עם הזרקת עמוד שדרה קונטרלטרלית של רטרו Cre מוצג כאן. היכולת להתמקד באוכלוסיות נוירונים ספציפיות תסייע להגדיר את הניואנסים המניעים את ההתאוששות ולספק דיוק רב יותר לטיפול בפגיעה הבסיסית בחוט השדרה במערכת העצבים המתפתחת. שיטה זו סללה לנו את הדרך לחקור את הכדאיות של שימוש ב-DREADDs מעוררים כאמצעי לטיפול בפגיעה בחוט השדרה בחולדות צעירות.
