תאי גזע שריר נשארים קשורים לנישה האנדוגנית שלהם וניתן לתמרן אותם בקלות, למשל, באמצעות טרנספקטציה של siRNA. שיטה זו מאפשרת לנתח תאי גזע שריריים בתרבית בסביבה הדומה למצב in-vivo מקרוב יותר מאשר מודלים סטנדרטיים של תרבות דו-ממדית על ידי שמירה על הנישה. התחל על ידי חיתוך פיפטות פסטר סטריליות עם עט יהלום.
עבור כל עכבר, להשתמש פיפטה משעמם אחד גדול עם פתיחה של כ 0.3 ס"מ ואורך של כ 10 עד 12 ס"מ ו pipette זכוכית שנייה עם פתח קטן של כ 0.1 ס"מ ואורך של כ 22 ס"מ. החלקת הקצוות של שני הפיפטות על ידי החזקת קצות הפיפטה בלהבה של מבער בונזן במשך חמש עד 10 שניות בתנועה עדינה. מיד לפני השימוש, מצפים את שני הפיפטות בסרום סוס סטרילי על ידי מילוי כל הפיפטה ב-2 מיליליטר של סרום סוס למשך חמש דקות, ואז מזריקים את סרום הסוס ומאפשרים לפיפטות להתייבש במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
לרסס את כל הציוד ואת הגפיים האחוריות של העכבר עם 70% אתנול. השתמש במספריים מעוקלים דקים וקשים ובמלקחיים עדינים כדי להסיר את העור ולחשוף את השרירים הבסיסיים. הסר את fascia שמסביב עם מלקחיים מעוקלים בסדר מבלי לפגוע בשרירים הבסיסיים.
כדי להסיר את tibialis קהורי או ת"א, לתפוס את גיד TA דיסטל עם מלקחיים לחתוך אותו עם מספריים עדינים. תוך כדי החזקת הת"א בגיד, משכו אותה לכיוון הברך וחתכו את השריר קרוב לברך כדי לחשוף את שריר ה-EDL. הרימו את גיד ה-EDL הדיסטלי עם מלקחיים מעוקלים וחתכו עם מספריים משובחים של ואנס.
לחשוף את גיד EDL הפרוקסימלי על ידי משיכה בזהירות EDL לכיוון הברך. ואז לחתוך את הגיד הפרוקסימלי עם מספריים. לדגור על שרירי EDL בצינור התגובה ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במחזור.
עצור את העיכול כאשר השרירים להשתחרר סיבי קילומטר אחד נראים. עבודה תחת מיקרוסקופ משקפת סטרילי המצויד בצלחת חימום שטפה את השרירים במדיום בידוד חם באמצעות פיפטה גדולה. לנתק את השרירים עם פיפטה נשא גדול עד המספר הרצוי של myofibers צף בחופשיות בפתרון.
כדי לשטוף את הפסולת, השתמש בצינור זכוכית נשא קטן כדי להעביר myofibers שאינם נדבקו לשני מלא מדיום בידוד. לאחר מכן העבר 50 עד 100 myofibers שאינם נדבקו לבאר אחת של צלחת 24 היטב מלאה במדיום תרבות myofiber. לדגור על myofibers ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 72 עד 96 שעות.
תדביקו תאי גזע שריריים הקשורים לתעלת שרירים ארבע שעות לאחר בידוד מיופיבר. שלב 25 מיקרוליטרים של Opti-MEM עם הנפח המתאים של siRNA עם 25 מיקרוליטרים Opti-MEM המכילים 1.5 מיקרוליטרים של ריאגנט transfection. לדגור את תערובת התגובה במשך חמש דקות ולהוסיף אותו לתאים בצלחת 24 היטב.
ואז לדגור על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לכבוד הזמן. רק צעדים קריטיים של פרוטוקול הכתמת האימונופלואורסצנטית מוצגים כאן. בזהירות, להשליך את מדיום תרבות myofiber תוך השארת פתרון כלשהו בבאר.
הוסף 500 מיקרוליטרים של 2%paraformaldehyde כדי לתקן את myofibers עם תאי גזע השריר הסמוכים שלהם. לדגור על הצלחת במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant בזהירות לשטוף את myofibers שלוש פעמים עם PBS.
מכסים את הצלחת בנייר כסף במהלך שלבי הדגירה לאחר הדגירה בנוגדנים משניים. השתמש בעט הידרופובי כדי לצייר עיגול על שקופית זכוכית מיקרוסקופית. לאחר מכן העבר את myofibers בנפח הקטן ביותר האפשרי לשקופית ולפזר אותם.
הסר את הנוזל שיורית עם פיפטה פסטר משעמם קטן או 200 pipette מיקרוליטר. השתמש בשתי טיפות של מדיום הרכבה מימית לכסות את myofibers עם פתק כיסוי. לאחר מכן אפשר לשקופיות להתייבש ולאחסן אותן בארבע מעלות צלזיוס בחושך ואחריו ניתוח מיקרוסקופי.
פרוטוקול זה מדגים נגזרת ותרבות של מיופיברים בודדים משרירי EDL מורין. כתמים אימונופלואורסצנטיים עבור Pax7 שימש לזיהוי גרעינים של תאי גזע שרירים. האזור המוגדל חושף את מיופיבר עם תא גזע השריר הסמוך שלו ומדגים את אות האימונופלואורסצנטיות PAX7 בגרעין של תא גזע שרירי.
התקדמות מיוגנית של תאי גזע שרירים ניתן לנתח על ידי ביטוי סמן. נוכחות של Pax7 והיעדר ביטוי MyoD קשורה לתאי גזע שרירים של myofibers מבודדים טריים. ביטוי MyoD ניתן לראות בתאי גזע שריר מתרבים.
לאחר 72 שעות, תאי גזע שרירים יוצרים אשכולות של צאצאים עם מצבים מיוגניים שונים, אשר מקביל על ידי ביטוי של סמנים מיוגניים שונים. Pax7 רק תאים הם תאי גזע המתחדשים בעצמם. פאקס7 ו-MyoD תאים חיוביים כפולים מתרבים.
בעוד שליו D רק תאים מבדילים תאים. טרנספקטציה siRNA של תאי גזע שריר הראה הצטברות של siRNA ציטופלסמי בצורה פרטנית המצביעה על ספיגה יעילה. כימות של תאים חיוביים Pax7 transfected לכל myofiber גילה כי מספר התאים transfected גדל עד 74%לאחר 30 שעות ללא השפעה שלילית על מספרי תאי גזע שריר.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, יש חשיבות עליונה לנתח בקפידה את EDL מבלי לגרום נזק. בנוסף להדבקת siRNA, ניתוח של בעלי חיים מהונדסים או הדגירה עם חלבונים רקומביננטיים אפשרי לניתוחים פונקציונליים נוספים של תאי גזע שריריים על המיופיברים הסמוכים שלהם.
