פרוטוקול זה מכמת גרורות ריאות, שהוא גורם אגרסיבי ונפוץ למוות הקשור לסרטן השד, עם דיוק ויעילות מוגברים במודל סרטן שד פרה-קליני. בהשוואה לטכניקה המקורית, פרוטוקול זה נותן לחוקרים תוצאות מהירות ועקביות יותר. זה מקל על טעות ספירה אנושית באמצעות טכנולוגיית מחשב קלה לשימוש.
טכניקה זו בהחלט ניתן להאריך למחקר פרה-קליני לחקור את ההשפעות של טיפולים בסרטן השד על גרורות ריאות על ידי מתן אפשרות לחוקרים להדגים נטל גרורתי ירד לאחר טיפול מוצלח. התחל על ידי תיוג צינור חרוט 15 מיליליטר עבור מדגם הרקמה. לאחר מכן מוסיפים 2.5 מיליליטר של תערובת קולגן מסוג 4 ו -30 יחידות של אלסטאז לצינור.
להעביר את הריאה נקי 1X HBSS היטב מערבולת אותו עם ממטרים כדי להסיר את כל הדם שנותר, ולאחר מכן להעביר אותו צלחת ריקה 3.5 סנטימטר רקמת רקמות. טחון את הריאה עם מספריים, ולאחר מכן לשטוף את הצלחת עם 2.5 מיליליטר של HBSS ולהעביר את HBSS עם חתיכות הריאות לתוך צינור חרוט מוכן 15 מיליליטר עם קולגן וקוקטייל אלסטאז. דגירה הצינור במשך 75 דקות בארבע מעלות צלזיוס על נדנדה או גלגל מסתובב.
בינתיים, תייג צינור צנטריפוגה אחד של 50 מיליליטר ולוחית תרבות רקמה אחת של 10 ס"מ לכל עכבר. אם עושים דילול, לתייג מספיק צלחות רקמה לדילול. להביא את נפח הצינור עד 10 מיליליטר עם 1X HBSS, ואז לשפוך את התוכן על מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך הצינור חרוט 50 מיליליטר.
השתמש הבוכנה של מזרק מיליליטר אחד כדי לטחון בעדינות את המדגם דרך מסננת. צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 350 פעמים G ולהשליך את supernatant, ולאחר מכן לשטוף את גלולה פעמיים עם 10 מיליליטר של 1X HBSS. תן מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של 60 מיקרומולרי 6-thioguanine להשלים את המדיה התרבותית, צלחת הדגימות 10 ס"מ צלחות תרבות התא באמצעות ערכת דילול אם תרצה.
הדגירה את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך חמישה ימים. יוצקים מדיה תרבותית מהצלחות לתוך מיכל הפסולת המתאים. כדי לתקן את התאים, להוסיף חמישה מיליליטר של מתנול לא מזוהה לכל צלחת דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הקפדה על מערבולת מתנול כך שהוא מכסה את הצלחת כולה.
יוצקים את מתנול מהצלחות לתוך מיכל הפסולת המתאים, ולאחר מכן לשטוף כל צלחת עם חמישה מיליליטר של מים מזוקקים. הוסיפו חמישה מיליליטר של 0.03% מתילן כחול לצלחת והדקרו אותה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, ודאגו לסובב את הפתרון הכחול של המתילן כך שיכסה את הצלחת כולה. יוצקים את כחול המתילן לתוך מיכל הפסולת המתאים ושטיפת כל צלחת שוב עם חמישה מיליליטר של מים מזוקקים.
הופכים את הצלחת ומנפחים אותה על מגבת נייר כדי להסיר נוזל עודף. מניחים את הצלחת על המכסה שלה ולתת לו אוויר יבש לילה. מושבות גרורתיות יהיו כחולות.
לאחר שהצלחות התייבשו, ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן. הסר את המכסים המסווים מהצלחות, תוך הקפדה על זיהוי ברור של הדגימות. בשורה את כל לוחות הריאות מוכתמים על משטח נקי וקל.
צלם תמונה של אוסף הצלחות באזור מואר היטב, הקפד למזער השתקפויות. השתקפויות בצלחות ישפיעו על ניתוח התמונה ויש להימנע מהן. שימו לב לתמונות שצולמו וצילמו מספר תמונות מכמה זוויות.
לאחר צילום הצלחות, חותכים את התמונה כדי לא לכלול את המכסים או כל דבר ברקע. פתח את התמונה ב- Fiji ImageJ ושנה אותה לשחור-לבן על-ידי לחיצה על סף תמונה, התאמה וצבע. לאחר מכן בחרו באפשרות 'ברירת מחדל' לשיטת סף, בשחור-לבן לצבע סף ובמעבדה למרחב צבע.
ודא שתיבת הרקע הכהה לא נבחרה. התמונה צריכה להיות עכשיו שחור ולבן. שחור מייצג את רקע האור, ולבן מייצג את המושבות גרורתיות כחולות.
השתמש בכלי עיגול כדי לבחור את האזור שיש לנתח. ציירו עיגול אחד לשימוש עבור כל הלוחות כדי להבטיח שכל לוח ינותח עבור אותו אזור בגודל. בחר גודל המגדיל את האזור שנותח על הלוחות תוך מזעור רעשי הרקע המופיעים בקצה הלוחות.
הגודל מופיע בסרגל הכלים בעת ציורו. נתח את העיגול הנבחר כדי לקבוע את אחוז האזור הלבן. לחץ על לנתח ולנתח חלקיקים, ולאחר מכן לבחור אפס עד אינסוף לגודל, אפס לאחד עבור מעגליות, ושום דבר להצגה.
בדוק את התיבה המסוכמת ופגע בסדר. הזז את העיגול לצלחת הבאה בתמונה על-ידי תפיסתה במרכז וחזרה על הניתוח. העתק והדבק את התוצאה בגיליון אלקטרוני.
אזור האחוזים, שהוא האחוז מהאזור שנבחר שהוא לבן, מייצג את הנטל גרורתי. לאחר שניתחו את כל הלוחות והתמונות, ממוצע תוצאות אזור האחוזים בין תמונות שונות עבור כל לוח כדי לצמצם את חוסר העקביות בין התמונות. ניתוח פיג'י ImageJ הושווה לספירה ידנית וניתוח היסטופתולוגי.
כאשר שלושה חוקרים נפרדים ספרו באופן ידני מושבות גרורתיות, התוצאות לא היו עקביות בין מונים. תוצאות פיג'י ImageJ היו עקביות בין מונים עבור כל אחת משלוש התמונות. התוצאות משלוש התמונות ושלושת המונים שולבו עבור כל צלחת ריאות.
התוצאות היו ממוצעות עבור כל לוח כדי להסביר את הווריאציות בין התמונות, אשר סיפק תוצאות עקביות בין מונים. כאשר דירוג הצלחות מרוב למטה-סטטי לפחות, ספירה ידנית הסכימה על הצלחת הנפוצה ביותר, אך כל השורות הבאות לא היו עקביות. השורות מהתוצאות הממוצעות של פיג'י ImageJ היו הרבה יותר עקביות בין מונים.
כדי להדגים את החשיבות של הימנעות השתקפויות בתמונות, תמונה עם השתקפות של יד וניתוח פיג'י ImageJ הבאים שלה מוצג יחד עם תמונה של אותו לוח ללא השתקפות. פגמים כהים ממשטח רקע מלוכלך או שאריות דגימת דם על הצלחות יכולים גם להשפיע לרעה על ניתוח פיג'י ImageJ. לוחית דם זו כוללת רק שתי מושבות גרורתיות, אך השאריות הכהות גרמו לפיג'י ImageJ לשקול זאת כ-31.6% גרורתי.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור לבחון בקפידה תמונות להשתקפות, להשתמש באותו עיגול גודל עבור כל לוח בתמונה, ולתזמן את התוצאות עבור כל לוח בין שלוש תמונות נפרדות לפחות.
