פרוטוקול זה מאפשר כימות של האזור, ההיקף והצורה של מבנה תאי מהתמונה הדו-ממדית שלו. טכניקה זו מהירה וקלה, דורשת רק הגדרות מעבדה סטנדרטיות ומיקרוסקופ קונפוקל ומשתמשת בתוכנת opensource. הפגנת ההליך תהיה אנה Balcerak, דוקטורנט מהמעבדה שלי.
התחל על ידי זריעת ארבע פעמים 10 לתאים החמישיים ב 0.5 מיליליטר של תרבות בינונית לגם בשקופית תא מצופה ארבע באר אחד לתרבות של 24 שעות ביממה ב 37 מעלות צלזיוס וחמש מעלות פחמן דו חמצני אינקובטור. למחרת בבוקר, השתמש במיקרוסקופ אופטי הפוך כדי לאמת נוכחות של לפחות 90% מונוליאר קונפלונט ולהשתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי להשיג תמונות בודדות של פרוסת Z. לניתוח הידבקות מוקד, פתחו את התמונות ב-ImageJ ובחרו לנתח, להגדיר קנה מידה, להסיר קנה מידה וגלובלי כדי להגדיר את סולם התמונה בפיקסלים.
כדי לכלול את שם הקובץ ואת האזור של אזור העניין באפשרויות המדידה, לחץ על נתח והגדר מידות ובדוק את אפשרויות האזור והצג תוויות. לחסר את הרקע, בחרו 'עבד' ו'חיסור רקע'. הגדר את רדיוס הכדור המתגלגל ל- 50 פיקסלים ובדוק פרבולואיד הזזה.
כדי לקבוע את האזור של האזור הקטן ביותר של עניין, מתאר את ההיתוך המוקד הבודד הקטן ביותר ולחץ לנתח ולמדוד כדי למדוד את האזור. כאשר לפחות 20 אזורי עניין נבחרו ונמדדו, חשב ושמור את ממוצע התוצאות שהתקבלו. הגדר את הגבול העליון ל- 25% מאזור תא טיפוסי.
כדי להעניק את התמונה לתמונה בינארית, לחץ על תמונה, התאם סף ובדוק את ברירת המחדל, רקע שחור-לבן ורקע כהה. כדי למדוד את המספר ואת האזורים של אזורי העניין, בחר לנתח ולנתח חלקיקים ובדוק יחידות פיקסלים, הצג תוצאות, נקה תוצאות וסכם. העבר את נתוני הגודל הממוצע של הפרוסה, הספירה והגודל הממוצע הכולל מחלון הסיכום לתוכנית ניהול הנתונים הרצויה.
עבור כימות הידבקות מוקד, פתח את המאקרו ImageJ הידבקות המוקד ולהיכנס לאזור של האזור הקטן ביותר של עניין כאזור של האזור הקטן ביותר של פרמטר עניין. הגדר את ערך סוג הסף כידני או אוטומטי ושמור את השינויים. לאחר מכן התקשר למאקרו מתוך ImageJ ובחר את התמונה לעיבוד.
לניתוח ידני של צורת תא, פתח תמונה בתוכנה מתאימה לעיבוד תמונה ובחר את הפרמטרים שיש למדוד. השתמש בכלי הבחירה ביד חופשית כדי לסמן ידנית את גבולות התא כפי שהם מסומנים בחלבוני הצומת הנבחרים. הפרמטרים שנבחרו יחושבו באופן אוטומטי עבור כל תא.
לאחר חלוקה לרמות של כל התאים, בחר עריכה, בחירה והוספה למנהל. יש לבחור רק תאים גלויים לחלוטין עם גבולות ללא הפרעה. כדי לבצע את המדידה, סמן את כל המספרים המופיעים בתיבה הימנית של מנהל אזור העניין ולחץ על מידה.
התוצאות יופיעו בתיבת התוצאות ו ניתן לייבא אותן לגיליון האלקטרוני של הבחירה. ניתוח תאים אוטומטי מאפשר כימות של מספר התאים הגדול. עבור כל סוג תא חדש, הפעל תחילה את המאקרו כדי ליצור פרמטרים.
לאחר סיום המאקרו, בחר הגדר גבולות גודל תא. לחץ על התווית של התאים הקטנים והגדולים ביותר ולחץ על מידה. הגדר את הערך של התא הקטן ביותר ומשתני התא הגדולים ביותר ושמור את השינויים.
סגור את כל חלונות המאקרו ובחר את התמונה לעיבוד בגווני אפור. לאחר מכן הפעל שוב את המאקרו. המאקרו יספק טבלה של התוצאות הכוללות את נתוני הרשימה אינדקס צורת תא, יחס גובה-רוחב ואזורים של בחירות עניין.
כאן, תמונות מייצגות של הידבקויות מוקד נספר עם ImageJ כולל קווי המתאר ממוספרים הסופיים ואת שכבות העל של קווי התווה הידבקות המוקד עם התמונה המקורית עבור שני קווי תא שליטה ו knockdown ניתן לראות. כפי שמודגם בניתוח זה, תאי ההפלה הדגימו מספר גבוה יותר של הידבקויות לכל תא, כמו גם הידבקויות שגודלן גדול יותר בהשוואה לתאי קו הבקרה. בתמונות אלה, אזורים מייצגים של מונואירים תאים לא מטופלים וכימותרפיים מוצגים.
תאי החלוקה לרמות התאפיינו על פי ערכי מדד צורת התא שלהם, למשל בניתוח זה המראים עלייה בסל האחרון ושיטוח הפסגות העיקריות של התאים המטופלים בתרופה בהשוואה לפקדים לא מטופלים. לאחר מכן ניתן ליצור התפלגות תדירות והתפלגות מצטברת עבור כל תרבות תאים. הדמיה בגווני אפור של המונו-שכבות כפי שהוכח אפשרה ניתוח וכימות של 512 תאים מ-12 שדות תצוגה שחשפו התפלגות תדרים יחסית של אינדקס צורת התא.
כדי שפרוטוקול זה יפעל, חשוב להשתמש בתמונות באיכות הטובה ביותר האפשרית. זריעת תאים נכונה, כתמים והדמיה צריכים להבטיח תמונות באיכות ניסיונית מספקת.
