פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה גמישה של PCR של טיפת מולטיפלקס המאפשרת ספירת לויקוציט דיפרנציאלית מדויקת המבוססת על סמני מתילציה אפיגנטיים. גמישות זו עשויה להקל על התרגום של mdPCR לשימוש קליני. שיטה זו מספקת תוצאות כי שאילתה הדוק לאלה שהושגו באמצעות שיטות מכתים immunofluorescent.
שלא כמו כתמים immunofluorescent, עם זאת, שיטה זו אינה דורשת דגימות דם טריות או נוגדנים יקרים. באבחון המטולוגי, לויקוציט דיפרנציאלי יכול לשמש אינדיקטורים עבור ספקטרום של מחלות, כולל זיהום, דלקת, אנמיה ולוקמיה, והוא נחשב סמן ביולוגי פרוגנוסטי מוקדם. הפגנת ההליך עם עבד אלרחמן אלמנזלאווי תהיה כריסטינה נאסיף, קצינה טכנית מהצוות שלנו במרכז לחקר מכשור רפואי של NRC.
התחל על ידי ערבוב יסודי 20 microliters של חלבון קינאז K ו 400 microliters של חיץ קשירה תזה המכיל חרוזים מגנטיים עם תאים חד-גרעיניים דם היקפיים אנושיים מופשרים טריים ב 100 microliters של PBS. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, מניחים את הצינור על מתלה מגנטי במשך דקה עד שתי דקות לפני הסרת העל-טבעי. עם הצינור הוסר מן המגנט, להשעות מחדש את קומפלקס חרוזים DNA ב 600 microliters של חיץ לשטוף אחד כדי להסיר את כל חרוזים שאינם קשורים במיוחד.
מניחים את הצינור בחזרה על המגנט כדי לאפשר הסרה של supernatant, לפני שטיפת התאים 600 microliters של חיץ לשטוף שני כפי שהודגם רק. לאחר הסרת העל-טבעי, אפשר לצינור להתייבש באוויר על המגנט למשך דקה אחת לפני הוספת 100 מיקרוליטרים של מאגר אלוטיון לצינור עם ערבוב יסודי. לאחר מכן, מניחים את הצינור על המדף המגנטי למשך שעה עד שתי דקות כדי להפריד את חרוזים מגנטיים מן ה-DNA רמז, ולהעביר את פתרון DNA מטוהרים לצינור חדש.
להמרה ביסולפית של ה-DNA המטוהר, להעביר 20 microliters של דגימת DNA רמז לצינור PCR, ולהוסיף 130 microliters של reagent המרה לצינור. לאחר ערבוב יסודי, לזמן קצר לסובב את תכולת הצינור להגביר את ה-DNA על רוכב אופניים תרמי. בסוף המחזור, להוסיף 600 microliters של מאגר מחייב לעמודה כרומטוגרפיה יון להציב בצינור איסוף, ולהוסיף את ה-DNA לעמודה.
להפוך את הצינור מספר פעמים לערבב, צנטריפוגה במשך 30 שניות במלוא המהירות. השלך את הזרימה שנאספה דרך, והוסף 100 microliters של מאגר לשטוף לעמודה. צנטריפוגה העמודה ולזרוק את הזרימה דרך שוב כפי שהוכח.
הוסף 200 microliters של מאגר Desulfonation לעמודה עבור דגירה 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר, לפני צנטריפוגה המדגם והשליכת זרימה דרך כפי שהוכח. לאחר מכן, לשטוף את הטור פעמיים עם 200 microliters של חיץ לשטוף לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, להעביר את העמודה לצינור איסוף חדש 1.5 מיליליטר, ולהוסיף 100 microliters של מים כיתה PCR לממברנה של העמוד.
לאחר מכן, לחמק ה-DNA על ידי צנטריפוגה של הטור במשך דקה אחת במלוא המהירות. עבור ייצור טיפות, יש לערבב מיקרוליטר אחד של דנ"א מומר ביסולפי עם תערובת ראשית של בדיקה שהוכנה זה לזה בצינור PCR, ולאסוף את הדגימה עם צנטריפוגה קצרה. השתמשו באביזרים שיא לחיבור צינורות נוזליים חד פעמיים לשני מזרקי זכוכית מדויקים בנפח 250 מיקרוליטר.
ומלאו מראש מזרק זכוכית מדויק אחד עם 250 מיקרוליטרים של שמן נושא המכילים חומר שטח 5%flouro, ומזרק זכוכית מדויק אחד עם 50 מיקרוליטרים של שמן נושא. כאשר שני המזרקים נטענו, לטעון 100 microliters של PCR לערבב לתוך המזרק של שמן נושאת, ולה מניחים מכשיר microfluidic טיפה על הבמה של מיקרוסקופ אור זקוף מצויד במצלמה במהירות גבוהה. לתצפית והקלטה של היווצרות טיפות בזמן אמת, מניחים את המזרקים שמולאים מראש על משאבת מזרק ניתנת לתיוכנת, ולהשתמש באיחוד שיא עם אביזרים כדי לחבר את צינורות המזרקים לאקוסיבות של ערוצי המזרק המתאימים של המכשיר microfluidic טיפה.
מניחים את הצינור מהשקע של גנרטור טיפה אל החלק הפנימי של צינור PCR 0.5 מיליליטר, ולהתאים את קצב זרימת משאבת המזרק לשני microliters לדקה, כדי לאפשר את גודל טיפה להתייצב לפני איסוף אמולסיה וכתוצאה מכך. לאט ובזהירות לאסוף את אמולסיה מהחלק העליון של הצינור, ולהעביר 75 microliters של הפתרון צינור PCR 200 microliter עבור רכיבה תרמית. לאחר מכן, לאשר כי תוכן השמן בצינור PCR תואם באופן הדוק את נפח השלב המפוזר, כדי למנוע התמזגות של טיפות במהלך רכיבה תרמית, ולמקם את הצינור 200 microliter לתוך האופניים התרמיים.
להדמיית פלואורסצנטיות של הדגימה הממולאת, העבר את אמולסיית ה- PCR לצינור נימי בורוסיליט עמוק של 50 מיקרומטר עם פרופיל מלבני, כדי לאפשר סידור של טיפות למונוליאר ארוז קרוב להדמיה. לאחר תיקון ואיטום נימים על מגלשת מיקרוסקופ, לטעון את השקופית על הבמה של מיקרוסקופ הפוך. ובתוכנות הדמיית מיקרוסקופ, בחר לרכוש ולחיות מהר, כדי להתחיל רכישת מצלמה בזמן אמת.
לאחר מכן, יש להתבונן בדגימה תחת שדה בהיר ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. לאחר ייצור טיפות ורכיבה תרמית, ניתן להציג את ה טיפות לתוך נימי זכוכית עם רוחב של מילימטר אחד וגובה של 50 מיקרומטר. כדי להשיג התפלגות monolayer של טיפות כי הוא אידיאלי עבור רכישת תמונה פלואורסצנטי, תמונות אז ניתן להקליט עבור כל אורך גל.
לאחר ניתוח תמונה, ניתן לתכנן את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל טיפות הפלואורופורים המתאימים שלהן כדי לקבוע את הסף של טיפות חיוביות ושליליות. לאחר זיהוי וספירה, ניתן לחשב את העותקים לכל ערכי droplet, ואת אחוז CD3 + T-תאים, ו CD4 +25 + תאי T רגולטוריים ניתן לקבוע בהתבסס על עותקי CD3Z ו FOXP3 מתילציה בהתאמה, ביחס עותקים לכל טיפה של התאים הכולל או גן C-less. לאחר מכן ניתן להשוות את ערכי האחוז לאלה המתקבלים באמצעות הדמיה immunofluorescence באמצעות הנוגדנים המתאימים.
אני חושב שהיציבות של אמולסיה מדור הירידה דרך רכיבה תרמית וצעדי הדמיה סופיים של טיפות היא חיונית להשגת תוצאות כימות מדויקות, אמינות ותרבותיות. התאמה אישית של MD PCR באמצעות ניסוח תערובת PCR מותאם אישית יכולה לשמש עבור מספר יישומים כולל חקר הסרטן, אבחון מחלות זיהומיות וניתוח ברמת התא הבודד.
