עבודה זו ממומנת על ידי סיורים פרויקט האיחוד האירופי (כלים מעוגנים פיזיולוגית עבור סיכון ננו מציאותי aSsessment) ומשרד הבריאות, הרווחה והספורט ההולנדי (פרויקט V/050012). ברצוננו להודות לד"ר איבון סטאל וד"ר יאן ואן בנת'ם על הביקורתיים שכתבו את כתב היד.

<ol>
	<li>Geiser, M., Jeannet, N., Fierz, M., Burtscher, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+Adverse+Effects+of+Inhaled+Nanoparticles+by+Realistic+In+Vitro+Technology.">Evaluating Adverse Effects of Inhaled Nanoparticles by Realistic In Vitro Technology.</a> Nanomaterials (Basel). 7 (2), 49 (2017).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mimicking+exposures+to+acute+and+lifetime+concentrations+of+inhaled+silver+nanoparticles+by+two+different+in+vitro+approaches.">Mimicking exposures to acute and lifetime concentrations of inhaled silver nanoparticles by two different in vitro approaches.</a> The Beilstein Journal of Nanotechnology. 5, 1357-1370 (2014).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dose-controlled+system+for+air-liquid+interface+cell+exposure+and+application+to+zinc+oxide+nanoparticles.">A dose-controlled system for air-liquid interface cell exposure and application to zinc oxide nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 6, 32 (2009).</li><li>Paur, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+cell+exposure+studies+for+the+assessment+of+nanoparticle+toxicity+in+the+lung-A+dialog+between+aerosol+science+and+biology.">In-vitro cell exposure studies for the assessment of nanoparticle toxicity in the lung-A dialog between aerosol science and biology.</a> Journal of Aerosol Science. 42 (10), 668-692 (2011).</li><li>Lacroix, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-Liquid+Interface+In+Vitro+Models+for+Respiratory+Toxicology+Research:+Consensus+Workshop+and+Recommendations.">Air-Liquid Interface In Vitro Models for Respiratory Toxicology Research: Consensus Workshop and Recommendations.</a> Applied in vitro Toxicology. 4 (2), 91-106 (2018).</li><li>Loret, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-liquid+interface+exposure+to+aerosols+of+poorly+soluble+nanomaterials+induces+different+biological+activation+levels+compared+to+exposure+to+suspensions.">Air-liquid interface exposure to aerosols of poorly soluble nanomaterials induces different biological activation levels compared to exposure to suspensions.</a> Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 58 (2016).</li><li>Zhu, Y., Chidekel, A., Shaffer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultured+human+airway+epithelial+cells+(calu-3):+a+model+of+human+respiratory+function,+structure,+and+inflammatory+responses.">Cultured human airway epithelial cells (calu-3): a model of human respiratory function, structure, and inflammatory responses.</a> Critical Care Research and Practice. 2010, (2010).</li><li>Braakhuis, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+future+of+in+vitro+models+to+study+translocation+of+nanoparticles.">Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles.</a> Archives in Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).</li><li>Ren, H., Birch, N. P., Suresh, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Optimised+Human+Cell+Culture+Model+for+Alveolar+Epithelial+Transport.">An Optimised Human Cell Culture Model for Alveolar Epithelial Transport.</a> PLoS One. 11 (10), 0165225 (2016).</li><li>Srinivasan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEER+measurement+techniques+for+in+vitro+barrier+model+systems.">TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems.</a> Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).</li><li>Papazian, D., Wurtzen, P. A., Hansen, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+Airway+Epithelial+Models+for+Immunological+Co-Culture+Studies.">Polarized Airway Epithelial Models for Immunological Co-Culture Studies.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 170 (1), 1-21 (2016).</li><li>Jeong, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+for+predicting+acute+inhalation+toxicity+by+using+a+Calu-3+epithelium+cytotoxicity+assay.">In vitro model for predicting acute inhalation toxicity by using a Calu-3 epithelium cytotoxicity assay.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 98, 106576 (2019).</li><li>Grainger, C. I., Greenwell, L. L., Lockley, D. J., Martin, G. P., Forbes, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+Calu-3+cells+at+the+air+interface+provides+a+representative+model+of+the+airway+epithelial+barrier.">Culture of Calu-3 cells at the air interface provides a representative model of the airway epithelial barrier.</a> Pharmacology Research. 23 (7), 1482-1490 (2006).</li><li>Harcourt, J. L., Caidi, H., Anderson, L. J., Haynes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Calu-3+cell+line+as+a+model+of+in+vitro+respiratory+syncytial+virus+infection.">Evaluation of the Calu-3 cell line as a model of in vitro respiratory syncytial virus infection.</a> Journal of Virological Methods. 174 (1-2), 144-149 (2011).</li><li>. Vitrocell&#174; Automated Exposure Station Available from: <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/automated-exposure-station1</a> (2019)</li><li>M&#252;lhopt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+combustion+aerosols+at+the+air-liquid+interface+with+a+self-contained+and+easy-to-use+exposure+system.">Toxicity testing of combustion aerosols at the air-liquid interface with a self-contained and easy-to-use exposure system.</a> Journal of Aerosol Science. 96, 38-55 (2016).</li><li>. VITROCELL&#174; Cloud for the exposure to liquid aerosols Available from: <a target="_blank" href="https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system">https://www.vitrocell.com/inhalation-toxicology/exposure-systems/vitrocell-cloud-system</a> (2019)</li><li>Endes, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+testing+strategy+towards+mimicking+the+inhalation+of+high+aspect+ratio+nanoparticles.">An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), 40 (2014).</li><li>Lenz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+bioactive+delivery+of+aerosolized+drugs+to+human+pulmonary+epithelial+cells+cultured+in+air-liquid+interface+conditions.">Efficient bioactive delivery of aerosolized drugs to human pulmonary epithelial cells cultured in air-liquid interface conditions.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (4), 526-535 (2014).</li><li>Borm, P. J., Tran, L., Donaldson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+carcinogenic+action+of+crystalline+silica:+a+review+of+the+evidence+supporting+secondary+inflammation-driven+genotoxicity+as+a+principal+mechanism.">The carcinogenic action of crystalline silica: a review of the evidence supporting secondary inflammation-driven genotoxicity as a principal mechanism.</a> Critical Reviews in Toxicology. 41 (9), 756-770 (2011).</li><li>Borm, P. J. A., Fowler, P., Kirkland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+review+of+the+genotoxicity+of+respirable+crystalline+silica.">An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+review+of+silica-induced+inhalation+toxicity.">A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity.</a> Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).</li><li>Sayes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+the+dose+metric+for+inhalation+toxicity+studies:+short-term+study+in+rats+with+engineered+aerosolized+amorphous+silica+nanoparticles.">Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles.</a> Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).</li><li>Driscoll, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+response+to+inhaled+silica+or+titanium+dioxide.">Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).</li><li>Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+lung+lesions+in+rat+after+chronic+exposure+to+crystalline+silica.">Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica.</a> Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, 27-29 (1995).</li><li>Peeters, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-induced+NLRP3+inflammasome+activation+in+vitro+and+in+rat+lungs.">Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).</li><li>Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subchronic+inhalation+toxicity+of+amorphous+silicas+and+quartz+dust+in+rats.">Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats.</a> Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).</li><li>Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months.">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+induced+by+intratracheal+instillation+of+ultrafine+amorphous+silica+particles.">Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles.</a> Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+silver-nanoparticles+and+silver-ions+to+lung+cells+in+vitro+at+the+air-liquid+interface.">Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface.</a> Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).</li><li>M&#252;lhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement.">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).</li><li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties:+nano-TiO(2),+pigmentary+TiO(2)+and+quartz.">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li><li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats.">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

מאמר זה מתאר שיטה ליצירת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים תחת ALI וחשיפת מודל הסימפונות הזה לתרסיסים או גזים. היתרון של שימוש בתאי Calu-3 הוא שהם יוצרים צמתים הדוקים, נשארים מונולאייר, מסוגלים לעמוד בזרימת האוויר, וניתן לתרבת במשך שבועות ב- ALI, בניגוד לסוגי תאים רבים אחרים (למשל, 16HBE, H292 ו- BEAS-2B). שימוש בתחנת החשיפה האוטומטית® VITROCELL (AES) יש את היתרון כי התאים יכולים להיחשף בתנאים מציאותיים ורלוונטיים כמו ריכוזים נמוכים ניתן להחיל באמצעות זרימת אוויר רציפה.
מערכות זרימה מתמשכות, כגון AES, יש יתרונות לעומת שימוש במערכות ענן3,32, אשר משתמשים ערפילית אחת של השעיה. הזרימה הרציפה מציאותית יותר ומשתנים רבים כמו קצב זרימה, לחות וטמפרטורה נשלטים. בנוסף, ניתן לשפר את התצהיר באמצעות שדה חשמלי. לבסוף, מאפייני תרסיס כמו גודל, ריכוז מספרים ומסה מנוטרים באינטרנט. החיסרון הוא שמערכות זרימה מתמשכות מורכבות יותר בהשוואה למערכות ענן. לכן, חשוב להפעיל ניסויי הכנה המתמקדים במאפייני החלקיקים של התרסיס והמינון המועבר על הכנס. ריכוז ההתחלה הראשוני של החלקיקים והגדרות AES לאחר מכן ניתן להתאים כדי להשיג את המינון הרצוי על התאים33. בהתאם לסוג החלקיקים הנבדקים, שיטת ייצור התרסיס יכולה להיות שונה. השימוש בתצהיר אלקטרוסטטי תלוי בסוג החלקיקים ופועל בצורה הטובה ביותר עבור חלקיקים מתכתיים. עבור חלקיקים עם מטען משטח חיובי שדה אלקטרוסטטי שלילי צריך להיות מיושם ולהיפך.
בחירת ריכוזי חשיפה יכולה להיות קשה עבור כל ניסוי חשיפה לנוזל אוויר. עבור חשיפות DQ12, המטרה הייתה להשיג מינון מצטבר כולל של 1 מיקרוגרם / ס"מ2 לאחר 3 שבועות חשיפה, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ליום. מינון זה דומה מינונים שגרמו השפעה vivo21,25,27,32,33. בעת ביצוע החשיפות, הייתה שונות מסוימת בין ימי חשיפה שונים. למרות המינון שהופקד בפועל של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2 הוא גבוה יותר מאשר 1 מיקרוגרם / ס"מ2 כי היה מיועד, המינון יכול להיות נמוך מדי כדי לצפות בהשפעות במודל Calu-3. רק הבדלים קלים בתגובת TEER, הכדאיות והציטוקינים נצפו בין החשיפה לאוויר נקי לחשיפה ל-DQ12, והבדלים אלה לא היו מובהקים סטטיסטית. הסבר לתצפית כי חשיפה DQ12 במשך 3 שבועות לא לגרום השפעות משמעותיות בתאי Calu-3 היא כי מקרופאגים היו חסרים ממודל Calu-3. ייתכן, לאחר DQ12 ספיגת מקרופאגים לייצר ציטוקינים proinflammatory שעלולים להשפיע על תאים Calu-3. הסבר נוסף הוא כי אצווה DQ12 ששימש לניסויים לא היה תגובתי כצפוי. בעת שימוש ב- LPS כחומר בקרה חיובי, Calu-3 מראה תגובה, כפי שנמדד על ידי עלייה במהדורת LDH ועלייה במהדורת TNF-α. הדבר מצביע על כך שהמודל יכול לזהות רעילות.
מודל התא Calu-3 יש יתרונות רבים, כפי שנדון בסעיף התוצאות. יתר על כן, כאשר תרבותי במשך זמן רב יותר ב ALI, התאים Calu-3 יכול לגדול מבנים דמויי ריסים / ריסים13 לייצר ריר11,12,13. למרות יתרונות אלה, למודל יש מגבלות ביחס לרלוונטיות הפיזיולוגית שלו. קווי התא Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה, ואילו 16HBE ו BEAS-2B מקורם רקמה בריאה. למרבה הצער, השניים האחרונים אינם מתאימים לחשיפה חוזרת ונשנית של ALI מכיוון שהם אינם נשארים מונולייר יציב לאורך זמן. מגבלה נוספת של מודל Calu-3 היא שהוא מייצג רק סוג תא יחיד. בריאה האנושית קיימים סוגי תאים מרובים המקיימים אינטראקציה ומגיבים באופן שונה לחשיפה. חלקיקים בשאיפה יפקידו באזורים שונים של הריאות בהתאם לגודל האווירודינמי שלהם. כאן החלקיקים יוצרים קשר עם מחסום תא האפיתל, כפי שמחקה מודל קאלו-3. בריאה האנושית, מקרופאגים מכתשיים נמשכים לחלקיקים, בולעים אותם ומנקים אותם מהריאות. מקרופאגים גם ממלאים תפקיד חיוני בתגובה הדלקתית לחשיפה לחלקיקים. לכן, נעשים מאמצים להרחיב את מודל Calu-3 על ידי הוספת מקרופאגים ראשוניים כדי לחקות את מחסום הריאות מקרוב יותר. החיסרון של מקרופאגים הוא שהם נשארים קיימא רק במשך כ 7 ימים כאשר תרבותי על גבי תאים Calu-3 ב ALI. לכן, יש לקרוא מקרופאגים מדי שבוע כדי להפוך את מודל Calu-3 הנוכחי למודל שיתוף פעולה. אופטימיזציה של פרוטוקול coculture הוא כרגע מתמשך.
בהתחשב לעיל, מודל הסימפונות Calu-3 הוא מודל מתאים לחשיפה חוזרת ונשנית אירוסולים של חומרים מסיסים חלקית כגון כימיקלים מעשן סיגריות LPS. חומרים מסיסים אלה לגרום לעלייה משמעותית בתגובות ציטוקינים בתאי Calu-3. לבדיקת חלקיקים בלתי מסיסים כגון פליטת דיזל ו- DQ12, יש צורך במודל קוקולטורה, מכיוון שהמאקרופאג'ים ממלאים תפקיד מכריע באינדוקציה של אפקטים על ידי חשיפה לחלקיקים.
לחשיפות המתוארות, נעשה שימוש בקרומים עם נקבוביות 3.0 מיקרומטר. הסיבה העיקרית לבחירת סוג זה של הכנסה היא כי ניתן לבדוק את טרנסלוקציה של ננו. בעת שימוש קטן יותר 0.4 מיקרומטר נקבובית גודל, agglomerates חלקיקים לא יוכלו לחצות את קרום הכנס. החיסרון בשימוש בגודל נקבובי גדול הוא שהתאים זקוקים לזמן ארוך יותר כדי לגדול במקביל וכי קשה יותר לדמיין את המורפולוגיה של התאים באמצעות מיקרוסקופיה קלה. כדי לבדוק שהתאים אכן יוצרים קו monolayer של מפגש, על ה- TEER להיות >1,000 Ω x ס"מ2 לפני תחילת החשיפה.
יחד, מודל הסימפונות Calu-3 המוצג כאן מתאים לשימוש לחשיפה חוזרת ונשנית לתרסיסים, לפחות עד 3 שבועות. המודל יכול לעמוד להיות תרבותי וחשוף באמצעות זרימת אוויר רציפה והוא מסוגל לזהות רעילות אפיתל הסימפונות.

הריאות פגיעות לחשיפה לשאיפה לחלקיקים הנישאים באוויר. כדי להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חלקיקים הנישאים באוויר, חלה התקדמות בפיתוח מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI)1,2,3,4,5. מערכות החשיפה של ALI מאפשרות מודלי חשיפה רלוונטיים ומציאותיים יותר בהשוואה לחשיפה מסורתית שקועה באמצעות מדיום תרבותי המשנה את המאפיינים והקינטיקה של החלקיקים6. מערכות החשיפה של ALI מציבות דרישות ספציפיות במודלים של תרבות התאים, שכן למודלים אין מדיום תרבותי ולכן חומרים מזינים בצד האפור. מודלים רבים של תאים מושפעים לרעה על ידי להיות תרבותי וחשוף באוויר (למשל, ייבוש) ורק להישאר קיימא במשך כמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות). תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים; לפיכך, ניתן להטיל ספק ברלוונטיות של התוצאות. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פרוטוקול התרבות והחשיפה למודל הסימפונות המורכב מקו תאי האפיתל הסימפונות האנושי Calu-37 היה אופטימיזציה.
רוב דגמי הריאות במבחנה המשמשים לחשיפה ל- ALI מכילים קווי תאים אחרים כגון A549, BEAS-2B ו- 16HBE14o- (16HBE) או תאים ראשיים כבסיס8. קווי תאים אלה יש את החיסרון כי הם נשארים קיימא רק כמה ימים כאשר מתורבת על עלי. בנוסף, חלק מקווי תאים אלה מתגברים כאשר הם מתרבים לתקופה ארוכה מ -5 ימים. לבסוף, תאי A549 מפספסים צמתים הדוקים פונקציונליים ולכן אינם יכולים ליצור מחסום הדוק הדרוש כדי לחקות את הריאות9,10. תאי אפיתל ראשוניים עשויים להיות אפשרות טובה לחשיפה ALI כפי שהם יכולים להיות תרבותיים ב ALI במשך שבועות. עם זאת, תאים ראשוניים שונים מאצווה לאצווה, קשים יותר לתחזוקה, והם יקרים יותר בהשוואה לקווי תאים, מה שהופך אותם פחות מתאימים לבדיקות רעילות וסינון. בעת השוואת קווי תא אפיתל אנושיים שונים (16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B), רק תאי Calu-3 ממלאים את כל הקריטריונים הדרושים לחשיפה מציאותית וחוזרת על עצמה של ALI: הם נשארים בני קיימא במשך שבועות בעודם מתרבים ב- ALI, מספקים שלמות מחסום גבוהה, אינם מגזימים, וקלים לתרבות ולתחזוקה. תאים Calu-3 מקורם אדנוקרצינומה והם מסוגלים לייצר ריר11,12. ישנם חוסר עקביות בשאלה אם התאים יכולים לפתח ריסונים11,13. תאים Calu-3 הם גם מודל מתאים ללמוד וירוס סיניסיטיאלי בדרכי הנשימה (RSV) זיהומים להדביק תאי אפיתל דרכיהנשימה ciliated 14.
מלבד דגם התא, מערכת חשיפה אוטומטית (AES) משמשת לחשיפה לנוזל האוויר לתרסיסים15,16. ל- AES יש את היתרון שהוא משתמש בזרימת אוויר רציפה כדי לחשוף את דגם התא לתרסיסים. זאת בניגוד למערכות חשיפה אחרות לנוזלי אוויר, שבדרך כלל משתמשות בריכוזים גבוהים יחסית בתוך פרק זמן קצר כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים שמתיישבים במהירות)17,18,19. מערכות ענן אלה אינן משקפות חשיפה ריאלית ארוכת טווח לריכוזים נמוכים של חלקיקים. על ידי החלת זרימת אוויר רציפה באמצעות AES, מודל התא יכול להיחשף לריכוז נמוך של חלקיקים על פני תקופה ארוכה יותר, המשקף תנאי חשיפה מציאותיים. יתרון נוסף על פני מערכות ענן הוא של- AES יש אפשרות לחבר מכשירי אפיון חלקיקים, המאפשרים מדידה של גודל החלקיקים, ריכוז המספרים והמסה לאורך זמן. מגבלה של AES היא שהיא משתמשת בזרימות אוויר גבוהות יחסית בין 10 מ"ל לדקה ו 100 מ"ל / דקה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M (x10) PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;,7&#8217;-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab141525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated exposure station</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell proliferation reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit LDH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ12</td>
			<td>IOM</td>
			<td></td>
			<td>nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Ready-SET-Go</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>88-8086-86, 88-7399-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td>
			<td>EVOM2-STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow splitter</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>model 3708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate (F-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>MFC, Bronkhorst, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Sartorius, Goettingen, Germany</td>
			<td>ME-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>41090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray nozzle</td>
			<td>Schlick, Coburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon filters</td>
			<td>Pall</td>
			<td>R2PJ46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEOM</td>
			<td>Rupprecht &#38; Patashnick NY, USA</td>
			<td>series 1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>690175, 658175, 660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460, 3462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing

לבדיקות רעילות של חלקיקים הנישאים באוויר, פותחו מערכות חשיפה לממשק נוזלי אוויר (ALI) לבדיקות חוץ גופיות על מנת לחקות תנאי חשיפה מציאותיים. זה מציב דרישות ספציפיות על מודלים תרבות התא. סוגי תאים רבים מושפעים לרעה מחשיפה לאוויר (למשל, התייבשות) ונשארים בני קיימא רק לכמה ימים. זה מגביל את תנאי החשיפה שניתן להשתמש בהם במודלים אלה: בדרך כלל ריכוזים גבוהים יחסית מוחלים כענן (כלומר, טיפות המכילות חלקיקים, אשר מתיישבים במהירות) בתוך פרק זמן קצר. תנאי ניסוי כאלה אינם משקפים חשיפה מציאותית לטווח ארוך לריכוזים נמוכים של חלקיקים. כדי להתגבר על מגבלות אלה השימוש בקו תא אפיתל הסימפונות האנושי, Calu-3 נחקר. תאים אלה יכולים להיות תרבותיים בתנאי ALI במשך מספר שבועות תוך שמירה על מורפולוגיה בריאה מונולייר יציב עם צמתים הדוקים. בנוסף, מודל סימפונות זה מתאים לבדיקת ההשפעות של חשיפות חוזרות ונשנות לריכוזים נמוכים ומציאותיים של חלקיקים הנישאים באוויר באמצעות מערכת חשיפה של ALI. מערכת זו משתמשת בזרימת אוויר רציפה בניגוד למערכות חשיפה אחרות של ALI המשתמשות בערפילית אחת המייצרת ענן. לכן, מערכת הזרימה הרציפה מתאימה לחשיפה חוזרת וממושכת לחלקיקים הנישאים באוויר תוך ניטור רציף של מאפייני החלקיקים, ריכוז החשיפה והמינון המועבר. יחד, מודל הסימפונות הזה, בשילוב עם מערכת החשיפה לזרימה רציפה, מסוגל לחקות תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות.

מאמר זה מספק שיטה לפולחן וחשיפת תאי אפיתל הסימפונות האנושיים ב- ALI המחקה תנאי חשיפה מציאותיים וחוזרים ונשנים לשאיפה שניתן להשתמש בהם לבדיקת רעילות. המאפיינים של מודל התא ושל מערכת החשיפה חיוניים להשגת מודל חשיפה לשאיפה מציאותית שניתן להשתמש בו לחשיפות חוזרות ונשנות. התוצאות על מאפיינים אלה מוצגות להלן.
דרישות ובחירה של מודל התא
בעת בחירת מודל תא מתאים, יש לקחת בחשבון את המאפיינים הבאים:
<ol><li>מודל התא צריך להיות מסוגל ליצור monolayer confluent עם צמתים הדוקים מתפקדים כדי לחקות את מחסום הריאות.</li>
<li>דגם התא אמור להציג ביצועים מיטביים כאשר הוא נחשף שוב ושוב לאוויר ממוזג (טמפרטורה ולחות).</li>
<li>מודל התא צריך להגיב לחשיפה.</li>
</ol>מחקר זה התחיל עם ארבעה קווי תא אפיתל אנושיים שונים: 16HBE, Calu-3, H292, ו BEAS-2B. כל אלה נמצאים בשימוש נרחב עבור בדיקות רעילות של ננו וכימיקלים. מתוך ארבעת קווי התאים, רק תאי Calu-3 מילאו את כל הדרישות לעיל. התאים יצרו מונולייר עם צמתים הדוקים (איור 3) שנשאר מחסום יציב לאורך זמן כפי שנמדד על ידי TEER, בעוד שקווי התאים האחרים לא יצרו מחסום או הראו ירידה בתפקוד המחסום כאשר הם מתרבים ב- ALI (איור 4). בנוסף, H292 ו- BEAS-2B נטו לגדול יתר על הרה לשכבות תאים מרובות כאשר הם מתורבתים לתקופה ארוכה יותר. פולחן התאים השקוע המסורתי ופולחן ALI היו שונים מאוד, כי אצל החומרים המזינים של ALI היו זמינים רק מהצד הבזולטרלי והתאים נחשפו לתנאים יבשים בצד הקופי. תנאים אלה יכולים לגרום ללחץ על מודלים התא, אשר ניתן לראות על ידי מדידת הכדאיות של התא לאורך זמן. קווי התאים 16HBE, H292 ו- BEAS-2B הראו כולם שחרור LDH מוגבר כאשר הם מתרבים ב- ALI, בעוד שתאי Calu-3 הראו שחרור LDH קל בלבד (איור 5).
לאחר מכן נבדקה תגובת מודל קאלו-3 לחומרים. כחומר שליטה חיובי, LPS ניתנה באמצעות ערפיליות לצד האפי של המודל. המינון שהופקד היה 0.25 מיקרוגרם / ס"מ2. תאי קאלו-3 הראו תגובה לליפוליסכריד (LPS) על ידי עלייה בשחרור LDH ובשחרור אלפא של גורם נמק הגידול (TNF-α)(איור 6).
לבסוף, המונולאייר קאלו-3 נחשף לננו-חומרים של סיליקה קוורץ (DQ12) (IOM, אדינבורו). סיליקה גבישית יכולה לגרום לסיליקוזיס ועלולה גם לגרום לגידולים בריאות. לכן, הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן (IARC) סיווגה סיליקה גבישית כקבוצה I מסרטן אנושי20. מנגנון הפעולה של סיליקה גבישית נחשב באמצעות אינדוקציה של דלקת מתמשכת הנגרמת על ידי משטח תגובתי שלה21,22,23. מספר מחקרי vivo הן בחולדות והן בעכברים מדווחים על אינדוקציה של שינויים דלקתיים והיסטופטולוגיה, כולל גידולים ופיברוזיס, לאחר חשיפה לשאיפה לסיליקה גבישית24,25,26,27,28,29. כל ההשפעות הללו נצפו לאחר חשיפה חוזרת ונשנית ו/או מעקב ארוך טווח. מודל Calu-3 שימש כדי לחקור אם התצפיות ממחקרי in vivo ניתן לחקות באמצעות מודל במבחנה שיכול להיחשף שוב ושוב על עלי.
Calu-3 תאים נחשפו במשך 3 שבועות רצופים, 5 ימים בשבוע, 4 שעות ביום כדי DQ12. המינון שהופקד נמדד באמצעות QCM. המינון המופקד הממוצע היה 120 ng / cm2 ליום, עם מנה מצטברת של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2, בדומה למינונים גרימת השפעה vivo. מאפייני חלקיקים אחרים מוצגים בטבלה 1. לאחר 3 שבועות של חשיפה, DQ12 לא גרם להשפעות משמעותיות ב- TEER, בכדאיות התא ובשחרור חלבון כימותרפי מונוציט 1 (MCP-1), בהשוואה לבקרת האוויר הנקי (איור 7). ככל שצפויה רעילות רבה יותר של DQ12 בהתבסס על נתוני in vivo, תגובתיות החלקיקים נבדקה באמצעות בדיקה תאית על פי הפרוטוקול הממוטב במסגרת GRACIOUS של פרויקט האיחוד האירופי (תוצר 5.3). התגובה של אצוות DQ12 הייתה נמוכה מהצפוי (איור 8), סדרי גודל נמוכים יותר בהשוואה לחלקיקי הבקרה החיוביים פחמן שחור (CB). חוסר תגובתיות זה עשוי להסביר את היעדר תגובת רעילות במודל Calu-3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> איור 1: תחנת החשיפה האוטומטית (AES). הדמות השמאלית מראה את החלק החיצוני של הארון עם לוח המגע. ל- AES שלוש רמות עם מודולי חשיפה: הרמה העליונה לחשיפות לאוויר נקי, והרמה האמצעית והתחתונה לחשיפות אירוסול. האיור הנכון מציג את מודול החשיפה שבו ממוקמים תוספות עם תאים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> איור 2: ייצוג סכמטי של כיוונון החשיפה. משמאל לימין: 1) המתלה ENM מחובר זרבובית ספריי באמצעות משאבה peristaltic; 2) באמצעות אוויר דחוס זרבובית ספריי ערפילית המתלים ENM ובאמצעות תא ערבוב האירוסולים מובלים AES; 3) רגע לפני הכניסה ל- AES, מכשירי אפיון אירוסול מחוברים: SMPS, OPS, CPC ו- TEOM. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> איור 3: תמונה מייצגת של תאי Calu-3 לאחר שהתבצבות בממשק הנוזלי-אוויר (ALI) למשך 10 ימים. פלואורסצנטי מיקרוסקופיה תמונה של תאים Calu-3 לאחר culturing ב ALI במשך 10 ימים. חלבון צומת הדוק ZO-1 מוכתם בירוק, גרעינים של התאים מוכתמים בכחול. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> איור 4: התנגדות חשמלית טרנספיתליאלית (TEER) של ארבעה קווי תאים שונים במהלך תקופת תרבות של 21 ימים. ערכי TEER של 16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B כאשר הם מתורבתים במשך 21 יום: 7 הימים הראשונים שקועים, ולאחר מכן 14 ימים ב- ALI. ערכי TEER תוקנו עבור התנגדות הרקע של ההוספה והוכפלו על-ידי שטח הפנים של ההוספה. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של שש הוספות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> איור 5: שחרור LDH של ארבעה קווי תאים שונים במהלך תקופת תרבות של 21 ימים. שחרור LDH של 16HBE, Calu-3, H292 ו- BEAS-2B כאשר הוא מתורבת במשך 21 ימים: 7 ימים שקועים, ואחריו 14 ימים ב- ALI. ערכי LDH המוצגים הם יחסיים למהדורת LDH המרבית לכל סוג תא. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של חמש הוספות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> איור 6: השפעות תאיות בתאי Calu-3 החשופים ל- LPS. תאים Calu-3 נחשפו באמצעות ערפילית ענן ל 0.25 מיקרוגרם / ס"מ2 LPS. (A)המרת WST-1. (B)שחרור LDH. (C)שחרור TNF-α לאחר חשיפה LPS. הסימנים ופסי השגיאה מייצגים ערכים ממוצעים וסטיות תקן של שלוש הוספות. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> איור 7: השפעות תאיות בתאי Calu-3 החשופים לננו-חומרים DQ12. Calu-3 תאים נחשפו במשך 3 שבועות (4 שעות ליום, 5 ימים בשבוע) כדי DQ12 nanomaterials, על 120 ng / cm2 ליום, מינון מצטבר של 1.6 מיקרוגרם / ס"מ2. (A) ערכי TEER. (B)שחרור LDH. (C)MCP-1 שחרור לאחר חשיפה DQ12. כל הסימנים וקווי השגיאה מייצגים ערכים ממוצעים וסטיות תקן של שלוש הוספות עבור הפקדים ושש הוספות עבור החשיפה ל- DQ12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> איור 8: תגובתיות תאית של DQ12. DQ12 היה דגירה עם 2ʹ,7ʹ-Dichlorofluorescein Diacetate (DCFH-DA) בדיקה כדי לזהות תגובתיות פני השטח שלה. כשליטה חיובית, חלקיקי פחמן שחור (CB) נכללו. בהשוואה ל- CB, DQ12 יש תגובתיות משטח נמוך מאוד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>מסת חלקיקים (μg/m3)</td>
			<td>מספר חלקיקים (#/cm3)</td>
			<td>גודל חלקיק ניידות (nm)</td>
			<td>סטיית תקן גיאומטרית</td>
			<td>גודל חלקיק אופטי (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מאפייני חשיפה DQ12. ערכים מוצגים כממוצע עם סטיית תקן בסוגריים מרובעים.

Watch this Scientific Journal Video about An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing at JoVE.com

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

מודל אפיתל ממשק נוזלי אוויר לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לחלקיקים מוטסים לבדיקות רעילות

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

an-air-liquid-interface-bronchial-epithelial-model-for-realistic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  National Institute for Public Health and the Environment (RIVM). המתוארת היא תרבות התא ושיטת החשיפה של מודל הסימפונות במבחנה לחשיפה מציאותית וחוזרת ונשנית לשאיפת חלקיקים לבדיקות רעילות.

Video: An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

בדיקת סובלנות ניקוטין ב כנימות באמצעות ניסוי דיאט מלאכותית

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Using an EEG-Based Brain-Computer Interface for Virtual Cursor Movement with BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to control a computer or other device. The amplitude of the EEG signals in selected frequency bins are measured and translated into a device command, in this case the horizontal and vertical velocity of a computer cursor. First, the EEG electrodes are applied to the user s scalp using a cap to record brain activity. Next, a calibration procedure is used to find the EEG electrodes and features that the user will learn to voluntarily modulate to use the BCI. In humans, the power in the mu (8-12 Hz) and beta (18-28 Hz) frequency bands decrease in amplitude during a real or imagined movement. These changes can be detected in the EEG in real-time, and used to control a BCI ([1],[2]). Therefore, during a screening test, the user is asked to make several different imagined movements with their hands and feet to determine the unique EEG features that change with the imagined movements. The results from this calibration will show the best channels to use, which are configured so that amplitude changes in the mu and beta frequency bands move the cursor either horizontally or vertically. In this experiment, the general purpose BCI system BCI2000 is used to control signal acquisition, signal processing, and feedback to the user [3].

In this video, we demonstrate the steps required to run a brain-computer interface experiment, including setting up the EEG cap, calibrating the system, and training the user to move a cursor in two dimensions using imagined movements.

שימוש EEG מבוסס מוחי המחשב ממשק עבור תנועת הסמן וירטואלי עם BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

כיווני שאיפת תרסיס Nanoparticle כל הגוף

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Culturing של אדם תאי אפיתל באף בממשק האוויר הנוזלי

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

נוהל כדי להעריך את היעילות של flocculants להרחקת מפוזרי חלקיקים מן תמציות צמחים

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

אופטימלית Lentivirus ייצור תרבית תאי תנאים הכרחיים בהצלחת transduce האדם הראשי תאי אפיתל סימפונות

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...