עם מניפולציה אופטוגנטית של אוכלוסיות עצביות ספציפיות או אזורי מוח, ניתן לשנות את ההתנהגות ברזולוציה זמנית ומ מרחבית גבוהה בבעלי חיים הנעים בחופשיות. באמצעות כלים אופטוגנטיים שונים בשילוב עם סיבים אופטיים מושתלים כרונית, ניתן לבצע מגוון אפנונים עצביים ובדיקות התנהגותיות. המטרה הסופית של אופטוגנטיקה היא אפנון של מעגלים עצביים עם רזולוציה זמנית ומ מרחבית גבוהה בבעל החיים מתנהג.
בניגוד למניפולציות תרופתיות או חשמליות, אופטוגנטיקה מאפשרת שליטה מדויקת של סוגי תאים ספציפיים במעגלים עצביים. אופטוגנטיקה היא הדרך המושלמת למקד סוגי תאים ספציפיים באזור מוגדר במיוחד במהלך ההתנהגות, ולבחן את ההשפעה הישירה של שינויים microcircuits כאלה. כעת אנו מציגים צעד כדי צעד מדריך כיצד להכין ולשתול ולנהל אופטוגנטיקה בעכברים נעים בחופשיות.
להכנת השתל האופטי, מניחים צד שטוח ferrule קרמיקה למעלה בספסל vise. להפשיט את הקוד של סיבי זכוכית בקוטר 200 מיקרומטר, עם כלי הפשטת סיבים לחתוך שניים עד שלושה סנטימטרים לא חתיכות עם סופר סיבים קרמיים. מניחים את חתיכת סיבי זכוכית לתוך ferrule קרמיקה ואז מניחים טיפה דבק על בצד השטוח עם cannular הזרקה.
בצד העגול של הפרולה הקרמית, חותכים את סיבי הזכוכית קצר ככל האפשר ומ מניחים את הקדם-שתל על דיסקית ליטוש ferrule כדי ללטש את הצד העגול בארבעה מאמרי הוצאה לאור שונים. לאחר מכן, לחתוך את סיבי הזכוכית בצד השטוח של ferrule קרמיקה, לאורך הדרוש להשתלה. השתמש אטלס המוח העכבר כדי לחשב את אורך השתל.
השתל צריך להסתיים ישירות מעל אזור העניין. לפני ההשתלה, הרדמה מוחלת. הטכניקה המדויקת והאסתטית מתוארת בכתב היד.
כאשר העכבר מגיע למצב עמוק של הרדמה, מניחים אותו על צלחת חימום ומתקן את הראש במסגרת סטראוטקטית. לתקן את האף ואת השיניים מלפנים ואת האוזניים משני הצדדים. החל אלגסיה עם cuprofen בתת מודע לתוך החלק האחורי של העכבר ולהחיל משחת עיניים אטומה על שתי העיניים כדי להגן עליהם מפני ייבוש.
להרטיב את השיער על הקרקפת עם מגבת נייר רטובה ולאחר מכן לחתוך אותו באמצעות מספריים. הקפד להסיר את כל השיער הרופף עם מגבת נייר רטובה. השתמש מקל כותנה כדי לחטא את הקרקפת עם תמיסת המכיל יוד.
הרם את הקרקפת על האזור של עניין עם פינצטה לחתוך סנטימטר אחד לאורך קו האמצע. כדי מחוספס את הגולגולת להשתלה, להחיל כמות קטנה של חומצה זרזית על הצלקת ולתת לו להיכנס לתוקף במשך 15 שניות. הסר את כל החומצה עם מקל כותנה ולשטוף את הצלקת עם נתרן כלורי פעמיים.
להזרקה נכונה, לחשב את גורם F עבור קואורדינטות בודדות. מניחים צינור זכוכית במסגרת הסטריאוקטית ומאתרים אותה ישירות מעל ברגמה. עכשיו אפס מערכת הקואורדינטות והזז את זכוכית cannula למבדה.
חשב את פקטור F עם הנוסחה הבאה. ברגמה מינוס למדה מחולקת ב-4.2 שווה ל-F פקטור. קואורדינטות מדויקות חשובות מאוד להזרקה והשתלה כי אחרת, אם המבנה הלא נכון מגורה אז ההשפעות ההתנהגותיות אינן ספציפיות.
לכל העכברים יש סטיות מינימליות בגודל הגולגולת שלהם, ולכן, המקדם הוא חובה לחלוטין. השתמש בקואורדינטות המותאמות כדי למצוא את המיקום על הצלקת ישירות מעל מבנה העניין. השתמש ב cannula הזרקה לקדוח חור לתוך הגולגולת, על ידי סיבוב cannula במקום.
כדי לקחת פתרון וירוס לתוך cannula זכוכית מחובר מזרק, מניחים טיפה של נתרן כלורי על הגולגולת חתיכת pirophen על גבי. מניחים טיפה של שני פתרון וירוס microliter על pirophen ולהוריד את קצה cannula זכוכית לתוך הנגיף. החל לחץ שלילי ולחכות עד פתרון הנגיף נלקח על ידי cannula.
אפס לקואורדינטת זה כאשר קצה הנגיף עם cannula הוא ברמה של הגולגולת לאט להוריד אותו לתוך borehole למיקום הנמוך ביותר של צד ההזרקה. החל כמות קטנה של לחץ חיובי עם המזרק עד המניסקוס הוא הוריד. תן לנגיף להתפשט במשך שתיים עד שלוש דקות לפני הזזת cannula זכוכית כלפי מעלה למיקום הבא.
הסר את cannula זכוכית לאט מאוד להשליך אותו לאחר הזריקה הסופית. עכשיו תכין את הגולגולת להשתלה. יבש את הגולגולת עם אוויר דחוס, להחיל את פריימר עם זה מקל מתאים ולתת לו להתייבש במשך 15 שניות.
החל את הקשר עם אותו מקל לרפא אותו במשך 20 שניות עם אור UV. מניחים את השתל במחזיק המתאים וממקמים את קצה סיבי הזכוכית ישירות מעל הבור ומנמיך אותו בזהירות. להפסיק להוריד את השתל כאשר השסתום הנותר של דבק-על נוגע בגולגולת.
ההשתלה של סיבים אופטיים יכולה להיעשות גם עבור מבנים דו-צדדיים כמו ההיפוקמפוס. זה מאפשר גירוי קל בשתי ההמיספרות באותו זמן או מאפשר גירוי של שני מבנים שונים. ניתן גם להזריק את הנגיף במיקום שונה השתל סיב אופטי.
אם ההזרקה וההשתלה נעשות באזורים שונים, לקדוח את כל החורים הדרושים לאחר החלת חומצה זרפורית אבל לפני הידבקות שני מרכיבים. בדוק שוב אם הגולגולת עדיין יבשה לחלוטין, ולאחר מכן להחיל מלט שיניים נוזלי סביב השתל באזור שמסביב ואז לרפא במשך 20 שניות עם אור UV להחיל שני מלט פחות יותר באזור גולגולת פרווה לחלוטין חינם ומיובש. לרפא כל שכבה עם אור UV.
כדי לסיים את הניתוח להחיל משחת יוד על כל הפצע. שחררו את קיבעון האף והאוזן, הכניסו את העכבר לכלוב טרי והכניסו אותו מתחת למנורת חימום כדי למנוע אובדן חום גוף. בדוק שזה מצב בריאותי לפחות פעם ביום וזה יהיה לפרסם אופרטיבי אלגסיה לאחר שלושה ימים במידת הצורך.
לאחר שבועיים של התאוששות, עכברים יכולים לשמש לניסויים התנהגותיים. פתח את תוכנת Pulser ובחר את יציאת USB com שמקור האור מחובר לתוכה. בחר במצב פעולה 3 כדי לאפשר לתוכנה חיצונית לשלוט במקור האור.
בחרו בהתאמה הנכונה לגירוי הרץ 20 עם דופק אור של חמש אלפיות השנייה. כדי לאתר חלוקה כדי לתקשר עם הפולס, לחץ על רצף ההתחלה. מצב זה יישאר עד לסיום הניסויים.
כעת, צור ניסוי חדש ב- EthoVision XT, עבור לקובץ, בחר חדש מתבנית ובחר להחיל תבנית מוגדרת מראש. בחר מעקב חי ובחר את המצלמה עם המקור ואשר את מצלמת Puslar Gen-Eye המחוברת. בחר עכבר כחיה אשר צריך להיות מוקלט.
בחר את תבנית הזירה, את ריבוע השדה הפתוח ואת מרכז תבנית האזור, הגבול, הפינות. אשר נושא אחד שיש לעקוב אחריו ובחר נקודת מרכז, נקודת אף ובסיס זנב. ודא שצבע החיה בהשוואה לרקע כהה יותר ואת קצב הדגימה המומלץ כדי לסיים את השלב.
תן שם לניסוי המתאים ובחר מיקום לשמירה. עד שתמצא את הגדרות הזירה, המצלמה תפתח באופן אוטומטי תמונת רקע. התאם את האזורים המוגדרים מראש לזירה האמיתית באמצעות החץ ושני הסמלים מימין.
אם אזורים מסוימים אינם נחוצים, מחק אותם. לחץ על קנה מידה של ציור כדי לכייל ולשים קו מפינה אחת של המבוך לפינה השנייה. הזן את אורך המרחק האמיתי בסנטימרים.
חזור על זה עבור הציר האחר. כדי להגדיר את הגדרות פקד הניסיון, הכן את הכלל הראשי על-ידי התאמת זמן התנאי ל- 20 דקות. התנאי ל"מסע בין כוכבים" צריך להיות, כאשר הנושא נמצא בזירה למשך שתי שניות, עבור מצב אוטומטי של המעקב כאשר העכבר נמצא בזירה.
כדי ליצור כלל משנה עבור גירוי האור, עבור למבנים, עוד ובחר כלל משנה. מניחים אותו מתחת לכלל הראשי ולפרוס את שתי הקופסאות. עבור לתנאים, זמן ולתת לו שם כמו אור על אחד, להתאים את המצב הוא נפגש עם לאחר חמש דקות.
מקם את התיבה ישירות מאחורי תיבת התחלת הכלל של כלל המשנה. עבור אל חומרה מותאמת אישית לפעולה ותן לה שם עם אור על אחד. בחר פעולה לביצוע כ: אני אשים אחד גבוה.
מקם את התיבה ישירות מאחורי תיבת התנאי. חזור על השלבים כדי לתכנת אור אל האור. כעת עבור אל מבנים, הפניה לכלל משנה ובדוק שההפניה שייכת לכלל המשנה הנכון.
בחר תנאי התחלה כמו ללא השהיה ותנאי התחלה כהפעלה פעם אחת לכל תנאי התחלה. מקם את תיבת הייחוס בין הספרים הנוספים אחד ואת התנאי ספרים שניים של הכלל העיקרי. כעת הגדר את הגדרות הזיהוי כדי להראות למערכת על מה היא אמורה לעקוב.
מקם קילומטרים מבחן לתוך הזירה ובחר התקנה אוטומטית. בחר מכרסם כסוג חיה ולהשתמש בסמן העכבר כדי לצייר תיבה סביב העכברים בזירה. אשר את תוצאות שאלת הטיפול עם כן.
לניסוי בשטח הפתוח, הביאו את העכבר הניסיוני לחדר ההתנהגות ממש לפני הניסוי כדי להבטיח רמה נאותה של חרדה. זוג העכבר להיות חריץ של מקור האור על ידי לחיצה עליו בעדינות לרשת של הכלוב. מניחים אותו לתוך כלוב המתנה עם המלטה טרייה במשך 10 דקות כדי להתאקלם לכבל האור.
התחל רכישה על-ידי לחיצה על לחצן העצור ועליך לראות את XT. העבר את העכבר מכלוב ההמתנה לפינה השמאלית העליונה של השדה הפתוח. השאירו את שדה הראייה של העכבר במהלך הניסוי ושמור על קור רוח. לאחר 20 דקות, כאשר הניסוי יסתיים, הסר את העכבר מהמבוך, נתק את כבל האור והחזר אותו לכלוב משלו.
על ידי הדמיה לבדוק, ההבדלים בזמן מרכז בין אור כבוי ואור על פרצופים ניתן לראות ישירות. העכבר מבלה פחות זמן במרכז כאשר האור דום. לניסוי במבוך בארנס, הכניסו את כל העכברים הניסיוניים לחדר ההתנהגות כשעה לפני הניסוי.
הכן את מבוך בארנס על ידי סגירת כל החורים מלבד אחד, ועכשיו אשר תיבת בריחה ממוקמת. חבר עכבר אחד במקור האור בשני השתלים והצב אותו ישירות באמצע מבוך בארנס. לחץ להתחיל צריך לבקר הבא T ולהסיר את תיבת קרטון.
היו מוכנים להפסיק את הניסוי באופן ידני רק למקרה שהתוכנה לא תזהה את כל המעבר. הוצא את העכבר מהמבוך והסר את החיבור לכבל האור. בעת ביצוע, למידה, משימת זיכרון, לא רק את ההשפעה המיידית של המניפולציה נחקרת, אלא גם את ההשפעה ארוכת הטווח של מניפולציה במהלך רכישה, איחוד או אחזור.
לניתוח נתונים, אתה מוצא את מצב הטיפול מטופל או מבוקר, ללכת קינון ולבחור מצב בקרת ניסיון. בחר את מרווח הזמן של המצב מתוך פעולת הרכיב מסע בין כוכבים לאור הפעולה של הרכיב הנמשך על אחד. מקם את תיבת הקינון בין טיפול תיבת הסינון לבין תיבת התוצאות המתאימה.
מרווח זמן מוגדר זה הוא אחד. חזור על השלבים עבור מרווחי זמן באחד משניים ועל שניים כמו גם עבור קבוצת הביקורת. הגדר גם את הפרמטרים לניתוח בפרופיל הניתוח.
בחר את המשתנה התלוי באזור ובחר את מרכז האזור, את נקודת הגוף, את נקודת המרכז והמשך לסטטיסטיקה של ניסיון. בחר תדירות, משך מצטבר והתן שם לראות את הראשון. הוסף גם מהלך מרחק כמשתנה.
עם פרופיל זה, הנתונים עבור הזמן שהושקע במרכז, ערכי מרכז ואמרו להם לנוע מרחוק זמינים. כדי לחלץ נתונים מכל חטיבה, עבור לתוצאות ובחר סטטיסטיקה ותרשימים, לחץ על חשב כדי לראות את הנתונים שנותחו. לחץ על ייצוא נתונים ובחר את סטטיסטיקת הניסיון ואת המיקום לשמירה.
הנתונים המיוצאים נשמרים כקובץ Excel ועם ערכים בודדים עבור כל עכבר. בנוסף, עבור אל הדמיית מפת החום ולחץ על מפות חום של התוויית, בחר ניסויים מימין כדי לראות מפות חום בודדות עבור כל עכבר ומשפט. לעשות לחיצה ימנית על העכבר ולייצא את מפות החום כתמונות.
מאוחר יותר, פתח את קובץ ה- Excel במחשב וחשב את ה- SCM של האירו הממוצע והסטנדרט עבור כל ארבעת המבחנים וכל קבוצת מיזוג מדודת. כדי ליצור גרפים ותווית סיגמא, העתק את האמצעים ואת SCM לסדר הנכון מהקובץ הנוסף לתווית סיגמא. השורות חייבות להכיל את הנתונים עבור אחד כבוי, באחד, והעמודות מכילות ניסיון, ממוצע והרץ SCM.
בחרו בכל שלוש העמודות ולכו ליצירת תרשימים. בחר את תיבת הבר ובחר תיבה לא מקובץ עם חץ. סמן את הגרף כולו, עבור אל הבית, בחר את תיבת התרשים ולחץ על ייצוא.
בחר את תיקיית היעד ובחר מטא-קובץ כתבנית. כדי לחשב סטטיסטיקה עבור נתונים שהתקבלו, העתק נתונים ימניים מ- Xcel מאחד לאחד, וכולי, ולעמודות בודדות של התוויית סיגמא. סמן את העמודות שברצונך להשוות ולעבור לניתוח, בחר בדיקת T והקש על הפעל.
לבסוף, ניתן להציג נתונים התנהגותיים המחולקים ל-Let off ובניסוי עם התמחות נוספת במפת חום. בניסוי השדה הפתוח, במהלך גירוי אור של Channelrhodopsin2 ונוירונים פירמידליים, משך המרכז יורד, מה שמצביע על רמות חרדה מוגברות. באמצעות אימונוהיסטוכימיה, אתר ההזרקה והביטוי של הנגיף ניתן לקבוע, גם על הספציפיות בקו העכבר תלוי Cre מיוחד יכול להיות מאומת.
ניתן לראות בבירור כי גירוי האור של Channelrhodopsin2 לשפר את נוירוני המוח של אזור קליפת המוח הספציפי הזה מגביר את רמות החרדה, לעומת חרדה בסיסית לפני גירוי זה. השפעה מיידית זו של המניפולציה על ההתנהגות היא הסיבה מדוע אופטוגנטי משמש היום עבור כל כך הרבה שאלות מחקר לגבי התנהגות. הליך זה יכול לשמש אפנון אופטוגנטי של כל סוג התא הרצוי או מעגלים עצביים במוח העכבר.
על ידי שילוב הליך זה עם בדיקות התנהגותיות מתאימות למחקר שלך, ניתן להשיג תובנה עמוקה יותר על מעגלים עצביים המעורבים בהתנהגויות ומחלות מעניינות.
