פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לנתח חיידקים הגדלים בתנאים המחקים באופן הדוק יותר את אלה שנמצאו במארח יונקים, שהם מתכת מוגבלת באמצעות תהליך הנקרא חסינות תזונתית. פרוטוקול זה מקל על הדור של צמיחה עקבית חיידקים לשחזור בתנאים מוגבלים מתכת והוא יכול להיות מותאם לצמיחה של סוגים רבים ושונים של חיידקים. יומיים לפני תחילת הניסוי, פס gonococcide ממלאי מקפיא על צלחות בינוניות GC עבור לא יותר מ 24 שעות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס.
14 עד 16 שעות לפני ניסוי הצמיחה, סטייק מושבות בודדות על צלחות בינוניות GC טריות. ביום הניסוי, להוסיף חמישה עד 10 מיליליטר CDM לבקבוק זרוע צדדית שטוף חומצה 125 מיליליטר מבולבל ולהשתמש במדיום זה כדי ריק colorimeter קלט. השתמש ספוגית כותנה סטרילית הטה לחסן 20 יחידות קלט של CDM מכושבות בודדות בריאות.
הדור של חיסון זיבה Neisseria בריא עבור תת תרבות לתוך 96 צלחות באר עבור מתנסה צמיחה נוזלית הוא קריטי להצלחת כל הניסויים במורד הזרם. הדגירה את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס ב 250 מהפכות לדקה במשך שעה עד בערך מסה אחת הכפלה לפני דילול התרבויות עם נפח מספיק של CDM כדי להגיע למחצית צפיפות התרבות הראשונית. לאחר מכן, החזירו את התרבות לאנקובטור הרועד.
להכנת חלבונים טעונים ממתכת, הוסיפו תמיסת phoration לתמיסת טרנספרין אנושית של 10 מיליגרם למיליליטר כדי להשיג רוויה של 30%. הוסיפו את מתכות העניין לתווית החלבון ביחס של 15% טוחן כדי לקבל רוויה של 25%. השתמש במזרק כדי להוסיף את החלבון טעון מתכת לקלטת דיאליזה דיאליזה נגד שני ליטרים של חיץ דיאליזה במשך ארבע שעות בטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, להעביר את הקלטת לשני ליטרים של ארבעה מעלות צלזיוס דיאליזה חיץ דיאליזה לילה בארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר את כל מתכות לא מאוגדות. במהלך הכפלת המסה, לדלל מעט 10X טרום ערבובים של עניין עם PBS. טרום לטפל בארות של 96 מיקרופלסטיק היטב עם 15 microliters של טרום ערבובים מדולל ולהוסיף 10 microliters של 10X מראש לערבב ו 90 microliters של CDM לכל אחד משלוש בארות עבור הפקדים הריקים.
לאחר שהתרבויות בבקבוק הזרוע הצדדית הוכפלו, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל תרבות ל באר לא שימושת במיקרו-פלאט ולמדוד את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר. לאחר חישוב הכמות הנכונה של דילול הנדרש כדי להביא את התרבויות לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 0.02, לדלל את התרבויות עם CDM בצינורות תרבות קטנים ולהוסיף נפח מספיק כדי לדלל את 10X מראש מתערבב 1X בצלחת. לאחר מכן, מניחים את הצלחת אצל קורא לוחות במשך שמונה עד 12 שעות עם רעידות כדי להשיג צפיפות אופטית ב 600 קריאות ננומטר במרווחי הניסוי הרצויים.
לאחר הדגירה הכפלה המונית, בחזרה לדלל את התרבויות עם שלושה כרכים של CDM ולהוסיף את הטיפולים מתכת עניין. לאחר מכן, הדגירה את התרבויות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד במשך ארבע שעות. זמן קצר לפני סימן ארבע השעות, לחתוך שלוש חתיכות של נייר מסנן פיסת nitrocellulose לגודל המשוער הדרוש כדי להתאים לתוך מנגנון נקודה כתם.
משרים מראש את הניטרוסלולוס במים מיוניים במשך כ -10 דקות לפני הרכבת המנגנון עם נייר סינון מתחת לניטרוסלולוס. בסוף הדגירה, להקליט את צפיפות התא ולתקנן את הצפיפות לצפיפות סופית מתאימה. לאחר מכן, פיפטה תרבות התא על הניטרוסלולוס.
כאשר נייר המסנן ספג את כל הנוזל לפרק את המנגנון ולאפשר את הכתם להתייבש. לחסום את קרום nitrocellulose במשך שעה אחת עם פתרון חסימה מתאים להרכיב מחדש את מנגנון כתם נקודה, החלפת נייר המסנן עם סרט פרפין כדי ליצור חותם הוכחה דליפה מתחת nitrocellulose. לדלל את ליגנד קשירה מתכת של עניין 0.2 micromolar חוסם ולחרוט את התאים במשך שעה אחת עם רעידות מתונות.
בסוף הדגירה, לשאוב את הנוזל עם ואקום, לשטוף את הכתם, ובצע הליכים אימונולוגיים סטנדרטיים כדי לפתח את האות. ניתוח כתם מערבי של ייצור חלבון בריכוזי מתכת משתנים חושף את הרגולציה של tdfJ ממברנה מגיב אבץ בתגובה chelation אבץ על ידי TPEN. TdfJ הוא למעשה בלתי ניתן לגילוי כאשר אבץ מתווסף בחזרה למדיום.
N.זיבה גדל בנוכחות קלפרוקטטין טעון אבץ, אשר דורש את הפעולה של tdfH מגיב אבץ. כאשר אין מקור אבץ שמיש זמין, הצמיחה מוגבלת. תוצאות דומות נצפו בנוכחות אבץ S100 A7, אשר יכול לשמש כמקור אבץ יחיד כאשר טרנספורטר הממברנה החיצוני, tdfJ, מיוצר.
Gonococcide גדל CDM מסוגלים לאגד calprotectin בעת הפקת tdfH וכתוצאה של מחסור באבץ. כריכה מוגברת של transferrin נצפתה גם בתרבויות הגדלות CDM, המעיד על רמות גבוהות יותר של ביטוי חלבון בשל אופי מדולדל ברזל יותר של CDM לעומת מרק GC chelated. פרוטוקול זה כבר אופטימיזציה לשימוש עם מקורות המים המתוארים טיטור נוסף עם כלטורים אחרים או מתכות יהיה צורך אם סוגים אחרים של מים משמשים.
לניתוח נוסף, ניתן לבצע בדיקות ספיגת מתכת כמותית או RTPCR כמותי למחקרי ביטוי גנים בתנאי דלדול מתכת או גדוי במתכת.
