הפיתוח של כלים סלקטיביים לאספקת גנים ותרופות לטיפול בהפרעות נוירודגנרטיביות, דורש כימות ואפיון של מיקוד תאים, עם ניהול מחדש, או וקטורים ויראליים, או חלקיקים. יש להם תפוקה ויכולות multiplexing של ציטומטריית זרימה, מאפשר זיהוי פשוט בו זמנית של סוגי תאים מרובים ממוח העכבר וחוט השדרה. הדגמת ההליך תהיה פרנסיסקו חוויאר מולינה אסטבז, פוסט-דוקטורט מהמעבדה של אלכסנדר.
לאחר קצירת המוח וחוט השדרה מעכבר C57 Black 6 בן שמונה שבועות, מניחים את הרקמות לתוך בארות בודדות של צלחת שש בארות, המכיל שני מיליליטר של קרח קר HPSS ל הבאר על קרח. מחלקים כל רקמה שנקטפו לשתי חתיכות שוות. ולהשתמש במספריים כדי לטחון חצי מכל דגימת רקמה לחתיכות בעובי של 1-2 מ"מ.
כאשר כל הרקמות כבר מקוטע, מראש לשטוף שונה 1, 000 טיפ פיפטה microliter ב HPSS, ולהשתמש פיפטה להעביר כל השעיית רקמה לתוך צינורות חרוט בודדים 15 מיליליטר. שטפו את בארות עם שני מיליליטר נוספים של HPSS ל באר. ולמשוך את הכביסה בצינורות חרוט 15 מיליליטר המתאימים.
תבזבז את הדגימות על ידי צנטריפוגה. ומערבבים 50 מיקרוליטרים של Enzyme P מערכת דיסוציאציה של רקמה עצבית עם 1,900 מיקרוליטרים של Buffer X מההערכה לכל דגימה. מחממים את תערובת האנזים ב 37 מעלות צלזיוס לפחות 10 דקות.
ושואפים את העל-טבעי מכל צינור איסוף רקמות. כאשר תערובת האנזים מוכנה, מוסיפים 1.95 מיליליטר של הפתרון לכל מדגם. ובעדינות מערבולת להשעות מחדש את כדורי.
לאחר מכן, דגירה הדגימות על גלגל במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, ומערבבים 10 microliters של אנזים A עם 20 microliters של מאגר Y לכל מדגם. לפני המלחמה פתרון האנזים השני ב 37 מעלות צלזיוס, לפני הוספת 30 microliters של הפתרון לכל פתרון רקמה בסוף הדגירה רועדת. השתמשו בקצה פיפסה של 1,000 מיקרוליטר, שטוף מראש ב-HPSS כדי לערבב בעדינות כל דגימה.
ולהחזיר את הדגימות לגלגל במשך 15 דקות ב37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, עצרו את התגובות האנזימטיות עם 10 מיליליטר של HPSS קר כקרח. ולהרוס את הדגימות על ידי צנטריפוגה.
בסוף הצנטריפוגה, להשעות מחדש את כדורי בשבעה מיליליטר של HPSS קר כקרח לכל צינור. ובעדינות מערבולת כל דגימה, לפני מחזיק את הצינורות על קרח. להומוגניזציה של רקמות, הוסיפו שלושה מיליליטר של HPSS מקורר מראש למרגמת הזכוכית המצונן מראש של מטחנה לרקמות מנוקד, והעבר את החצי השני של אחת מדגימות רקמת המוח או חוט השדרה שנקטפו למרגמה.
בעדינות macerate את הרקמה עם 10 משיכות של עלה A, ואחריו 10 משיכות של עלה B.ולהעביר את התערובת הומוגנית לתוך צינור חרוט חדש 15 מיליליטר. מלא את הצינור לנפח סופי של 10 מיליליטר עם HPSS מקורר מראש עבור צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את גלולה בשבעה מיליליטר של HPSS טרי עם מערבולת, לפני מחזיק את המדגם על קרח.
להסרת פסולת, הוסיפו שלושה מיליליטר של תוסף פרקול איזוטוני מקורר מראש לכל מדגם מתעכל או הומוגני. ובעדינות מערבולת הדגימות כדי לוודא שהם מעורבבים הומוגנית. לאחר מכן, צנטריפוגה הדגימות, בזהירות להסיר את הדיסק לבנבן של פסולת ומילין צף על פני השטח של הפתרון.
כאשר הפסולת הושלכה, לאסוף את כל אבל האחרון 100 microliters של supernatant מכל צינור מבלי להפריע כדורי. להשעות מחדש כל גלולה במיליליטר אחד של פתרון FACS BL להעברה לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מיליליטר. לאחר אינטגרציה זו עם פתרון פרקול, חשוב להסיר את דיסק הפסולת ואת supernatant בזהירות רבה מבלי לסלק את גלולת התא כדי למנוע אובדן מדגם.
לאחר צנטריפוגה, בזהירות שאף את supernatant מכל צינור, ולהשעות מחדש את כדורי 350 microliters של FACS טרי BL לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של סוגי התאים המבודדים, הדגירה את הדגימות עם חמישה מיקרוגרם למיליליטר של בלוק FC לצינור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס לפני הוספת הנוגדן המתאים לכל צינור על פי פרוטוקול העמידה המתואר בטבלה. מערבולת כל צינור במשך חמש שניות לערבב.
ומ מניחים את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות מוגנות מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הדגימות עם מיליליטר אחד של PBS לכל צינור, צנטריפוגה. להשעות מחדש את כדורי בנפח המתאים של סטרפטבידין לכל צינור.
לאחר מערבולת לערבב, הדגירה את הדגימות במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור. ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של PBS לצינור כפי שהודגם. לאחר השלכת supernatants, להשעות מחדש את כדורי 300 microliters של FACS טרי BL לכל צינור.
ולתייג כל דגימה עם חמישה מיקרוליטרים של 7-AAD. לאחר מכן לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד ניתוח cytofluorometric. שיטת ההומוגניזציה מייצרת תפוקת תאים גבוהה יותר הן מהמוח והן מהחוט השדרה באופן כללי, אך רוב התאים שאוחזרו מתים בדרך כלל, וכתוצאה מכך רק כ -14% נרפאו של תאים בני קיימא מהמוח, וכ -10% נרפאו בחוט השדרה.
לעומת זאת, שיטת עיכול הפפאין מביאה לשימור כללי טוב יותר של הכדאיות התאית. ניתוח של מתלי תאי המוח וחוט השדרה עם ציטומטריה דו-זרימה בצבע תשעה צבעים, חושף את נוכחותם של CD45+CD11b+microglia, ומאקרופאגים. ו CD45+CD11b-לימפוציטים בשתי הרקמות.
לאחר מכן ניתן להפלות את אוכלוסיות תאי ה- CD45 בהתאם החיוביות שלהן עבור אסטרוציטים, או סמני אוליגודנדרוציטים, או ביטוי סמן פני שטח פראי ו אנדותל. באמצעות שיטת הומוגניזציה, בין 32 ל 38% של התאים קיימא הם ממוצא hematopoietic. בעוד שיטת העיכול האנזימטית גורמת לרכישת חלק גדול מאוד של CD45-תאים שאינם hematopoietic.
למרבה הפלא, CD45+CD11b+microglia ומאקרופאגים מייצגים את שבר התא הנפוץ ביותר בשיטת ההומוגניזציה. שיטת העיכול, לעומת זאת, מייצרת ייצוג הטרוגני יותר של סוגי תאים כולל אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים, תאי אנדותל ותאי עצב. פרוטוקול זה הוא רב-תכליתי, והוא יכול להיות מנוצל עבור מספר יישומים במורד הזרם כגון כימות או בידוד של תאים ספציפיים subpopulations, התרבות העיקרית, או ביוכימי, או ניתוח רצף RNA.
יישמנו פרוטוקול זה כדי להעריך את ביטוי הגנים וחתימות תפקודיות של אוכלוסיות שונות של מערכת העצבים המרכזית במהלך התקדמות זו, או לאחר טיפול במודל עכבר של טרשת נפוצה צידית אנדוטרופית.
