עצם השתלת מח פלטפורמת לחקור את התפקיד של תאים דנדריטים במחלה שתל-מול מארח

פרוטוקול השתלת מח עצם חדשני זה יכול לשמש כדי לחקור כיצד תאים דנדריטיים מארחים מווסתים תגובות השתל-לעומת-מארח-נגד לוקמיה לאחר ההשתלה. התחדשות תאי ה-Ex vivo מאפשרת להתאים פרוטוקול זה כדי לבדוק את תפקידה של אוכלוסיית תאים חיסוניים אחרים כגון מקרופאג' ונויטרופילים פשוט על ידי שינוי מצב התרבות. הדגמת ההליך איתי תהיה מנהל המעבדה קריסטל הוסק ותחתון סנג'יב גורשאני.

לתורם T-cell מדולדל C57BL/6 הכנת מח עצם, לקצור את עצם הירך ואת השוקה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים מעכברים תורמים המתת דם ולהעביר את העצמות לתוך צלחת פטרי בקוטר 92 מילימטר המכיל 1%RPMI בינוני. באמצעות מספריים, להסיר את הקצוות מכל עצם ולמלא מזרק שלושה מיליליטר מצויד מחט 26 מד עם טרי 1% RPMI בינוני. הכנס את המחט לקצה אחד של עצם אחת ודכא את הבוכנה כדי לשטוף את מח העצם מתוך החלל לתוך מסננת תא איסוף.

כאשר כל מח העצם נאסף, מסננים את חתיכות מח העצם דרך מסנן רשת 75 מיקרומטר ומעבירים את המתלה החד-תאי לצינור חדש של 50 מיליליטר. להרוס את התאים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה ב 20 פעמים 10 לשישה תאים לריכוז מיליליטר ב PBS בתוספת 0.5%BSA. לאחר מכן, להוסיף 0.05 מיקרוגרם של נוגדן THI1 לכל אחד פעמים 10 לשישה תאים עבור דגירה של 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 10 מיליליטר של קרח קר PBS ו resuspend את גלולה בשתי פעמים 10 לריכוז שבעה תאים למיליליטר ב 0.5% BSA בתוספת 10% ארנב צעיר להשלים ו 2% DNAse במים סטריליים עבור דגירה של 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם 15 מיליליטר של PBS טרי לכל לשטוף מחדש את גלולה ב 20 מיליליטר של PBS המכיל 0.5%BSA. בריכת בלוטות הלימפה ואת הטחול מסננת נקבוביות 40 מיקרומטר ולהשתמש בוכנה מזרק כדי macerate את הרקמות דרך המסננים כדי לשחרר את התאים.

לשטוף את מסננת ובוכנה עם מדיום RPMI בתוספת 1%FBS כדי לאסוף את כל התאים ולשקע את התאים על ידי צנטריפוגה. הוסף חמישה מיליליטר של מאגר תזה ACK לכדור התא. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של בינוני בתוספת 1% FBS ו גלולה תאי הדם הלבנים על ידי צנטריפוגה.

תן שימוש חוזר את גלולה בחמישה מיליליטר של מאגר MACS לספירה ולדלל את התאים לריכוז של פעמיים 10 לשמונה תאים למיליליטר במאגר MACS טרי. הוסף את הריכוז המתאים של נוגדנים נגד אריתויד, אנטי גרנולוציטים, אנטי B-cell, ונוגדני דלדול נגד תאי NK לכל אחד פעמים 10 לשש התאים לדגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של חיץ MACS קר כקרח ו להשתמש מחדש את גלולה באחת פעמים 10 לריכוז שמונה תאים למיליליטר במאגר MACS טרי.

לאחר מכן, להוסיף 0.22 microliters של MicroBeads אנטי ביוטין לכל אחד פעמים 10 לשישה תאים עם ערבוב עבור דגירה של 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של חיץ MACS קר כקרח ולאסוף את תאי T מועשרים לא מאוגדים על ידי הפרדת חרוזים מגנטית באמצעות מפריד MACSxpress על פי פרוטוקולי בידוד חרוזים סטנדרטיים. בסוף ההפרדה, מים את תאי T על ידי צנטריפוגה לשימוש חוזר את גלולה בחמישה מיליליטר של מאגר MACS טרי לספירה.

כדי ליצור תאים דנדריטיים שמקורם במח העצם, בודדו את מח העצם מעצם הירך של עכברי נוקאאוט מסוג פראי או גורם B כפי שהוכח ו-lyse תאי הדם האדומים בחמישה מיליליטר של חיץ תמיסת ACK, עצירת התגובה עם 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 1%FBS לאחר חמש דקות. לאחר איסוף כל תאי הדם על ידי צנטריפוגה, תוסיפו את גלולת הכדור ב-10 מיליליטר של תרבות בינונית עד פי שניים מ-10 לתאים השישיים לריכוז מיליליטר ותוסיפו 20 ננוגרם למיליליטר של GM-CSF לתאים לפני שתזרעו 10 מיליליטר תאים על 100 בודדים על ידי 15 מילימטר מנות פטרי ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שישה ימים. ביום השישי, הפעל את תרבות התאים הדנידריטיים המופקים ממח העצם עם 25 מיקרוגרם למיליליטר של LPS לכל צלחת.

לפחות 85% מתאי מח העצם התרבותיים מתבדלים לתאים דנדריטיים. טוהר תאי T לאחר העשרת חרוזים מגנטיים הוא 90%הדגם העיקרי של C57BL/6 BALB/c לא תואם באופן הדוק להתפתחות GVHD לאחר ההשתלה. שיא החומרה מתרחש כ -11 ימים לאחר העברת התא ואחריו ירידה הציונים הקליניים והתאוששות משקל הגוף עד היום 16.

הנמענים נכנעו באופן אחיד ל-GVHD ב-30 עד 40 יום לאחר ההמשגבה. מעניין, השתלה עם פקטור B נוקאאוט תאים דנדריטיים משפר את הישרדות המטופל ציונים קליניים GVHD. לימפומה A20 B-cell מתומרת לוציפראז מאפשר ניטור של גידול גידול בבעלי חיים חיים.

בניסוי מייצג זה, כל מקבלי BALB/c מסוג הבר שקיבלו מח עצם לבד בתוספת A20 מתו מהתדרדרות הגידול. נמעני BALB/c פראיים שהושתלו בתאי T של תורמים מרוקנים במח העצם, שמקורם במח העצם, מתו מ-GVHD. בנוסף, בעלי חיים שקיבלו מח עצם תורם ותאי T מדולדלים ACC1 מתו הן GVHD והן מהתדרדרות הגידול.

כדי ליצור מספיק תא מח עצם, השוקה שנאסף ועצמות עצם הירך חייב להיות חופשי לחלוטין של רקמת שריר לפני תיקון מח העצם. טיהור שלילי של תאי מח העצם עם ביוטינילאז אנטי CD3 ו MicroBeads אנטי ביוטין יכול גם לכל מבוצע כדי לרוקן את הלימפוציטים ממח העצם.