והטיפול מתאי הגידול הראשוניים מבודדים מעכבר תמס שריר

Rhabdomyosarcoma היא צורה נדירה של סרקומס רקמות רכות המאופיינת בהיסטולוגיה על ידי מורפולוגיה של רקמות והביטוי של סמנים מיוגניים. עם זאת, בהתחשב בקיומם של תת-סוגים שונים של גידולים אלה ואת ההטרוגניות של הגירויים התורמים להיווצרותו, זיהוי תא המקור היה מאתגר מאוד. כאן אנו מתארים שיטות לשחזור ואמין לזיהוי התא של מקור rhabdomyosarcomas החל רקמות גידול קציר טרי מעכברים וראיה זו היא בדיקה היווצרות הגידול.

היתרונות העיקריים של היווצרות tumorsphere assay היא כי היא מסתמכת על תכונות הסלולר כי ידועים להיות נוכח בתאים שמקורם בגידול וזה יכול לשמש גם עבור התרחבות והעשרה של אוכלוסיית התא הספציפי. יתר על כן, המבנה הכדורידי שלה לחקות את סביבת הגידול, ולכן הם יכולים לשמש מחקרים הקרנת סמים. שיטה זו יש פוטנציאל להיות מיושם על סוג אחר של גידולים כי זה לא דורש ידע מוקדם של סמנים מולקולריים אבל זה עשוי לדרוש אופטימיזציה של תנאי התרבות.

Tumorsphere עשוי לקחת קצת זמן כדי ליצור, במיוחד אם מנסה לזהות אוכלוסיית תאים נדירים בתוך הגידול שלך. לכן, זה לא הציע להסתכל על צלחת תת-תרבות שלך כל יום, שכן זה עלול להשפיע לרעה על תוצאות הניסויים שלך. התחל על ידי חימום צלחת 10 ס"מ עם חמישה מיליליטר של תקשורת בידוד באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.

לשקול 500 עד 1,000 מיליגרם של רקמת הגידול ולמקום אותו בצלחת. הביאו את הצלחת עם רקמת הגידול למכסה המנוע של התרבות הסטרילית וטחון אותה עם סכין גילוח. לעיכול אופטימלי, יש לוודא כי הגדלים של חתיכות טחון הם אחידים.

מעבירים את הרקמה הטחון ומדיית בידוד התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לשטוף את הצלחת עם עוד ארבעה מיליליטר של מדיה ולהוסיף את זה לצינור. מוסיפים 700 יחידות למיליליטר של תוסף קולגן לצינור ומדרגים אותו באמבט מים רועד ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה וחצי.

לאחר הדגירה, לסובב את הרקמה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שאפו את העל-טבעי מבלי לשבש את גלולת הכדור, ולאחר מכן תוכלו להשתמש שוב את גלולה ב 10 מיליליטר של פתרון עיכול השני דגירה באמבט מים רועדים במשך 30 דקות נוספות. לאחר העיכול השני, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה ולהעביר אותו דרך מסנן ניילון 70 מיקרומטר על צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.

ואז לשטוף את המסנן עם 10 מיליליטר של מדיה בידוד התא ולסובב את הרקמה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות. שאף את העל-טבעי ולחץ מחדש על גלולה ב 20 מיליליטר של מדיה תאים סרטניים. מעבירים את ההשעיה לצלחת תרבות של 15 ס"מ וממקמים את התאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס בן לילה.

למחרת, לשנות את התקשורת כדי להסיר פסולת ותאים מתים שעלולים להשפיע לרעה על הישרדות התא. בשלב זה, להעריך את confluency התא ולאפשר לתאים לגדול באינקובטור עד שהוא מגיע 90% לפקח על התאים כל יום ולשנות את המדיה כל יומיים. עבור נגזרת tumorsphere, להשתמש בתאים במעבר P1 או P2 כדי למנוע בחירת תאים דרך מעברים מרובים.

לשטוף את צלחת התא עם PBS ולאחר מכן לכסות אותם עם פתרון ניתוק. מניחים אותם באינקובטור במשך חמש עד 10 דקות ולאחר מכן לאשר ניתוק על ידי התבוננות בצלחת תחת מיקרוסקופ שדה בהיר. לאחר התאים התנתקו, להוסיף מדיה תא הגידול לצלחת ולהעביר את ההשעיה התא צינור צנטריפוגה.

לסובב את התאים למטה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות, להסיר על טבעי, ו resuspend התאים במדיה tumorsphere. לאחר שימוש חוזר בתאים, לספור אותם באמצעות כחול Trypan ולחשב את ריכוז התא. צלחת המספר הנכון של תאים בצלחת 96-גם קובץ מצורף נמוך למקם את התאים באינקובטור עד סוף הניסוי, דואג לא להפריע את הצלחת אלא אם כן חידוש התקשורת.

לאחר השלמת הניסוי, זהה גידולים באופן ידני תחת מיקרוסקופ שדה בהיר או באמצעות תוכנת Celigo. ניתן להעריך את המספר והגודל של הגידולים כתוצאה מהערכה זו. כדי להכין גידולים להשתלת allograft, למשוך יחד את כל הגידולים המתקבלים סוג תא מסוים או טיפול.

צנטריפוגה את הגידולים בזהירות להסיר את supernatant עם פיפטה מילימטר אחד ואחריו פיפטה 200 מיקרוליטר, ולאחר מכן לשטוף אותם עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי. לסובב את הגידולים למטה שוב ולופות PBS. מוסיפים 500 מיקרוליטרים למיליליטר אחד של ניתוק תאים על גבי גלולת הגידולים ומטרים את התאים באמבט מים רועד ב-37 מעלות צלזיוס.

בדוק את התקדמות העיכול כל 10 דקות. התהליך כולו לוקח עד 30 דקות. אם עיכול של tumorsphere באמבט מים רועדים אינו מספיק כדי להשיג פתרון חד-תאי, הפרעה מכנית באמצעות צינור למעלה ולמטה מוצע.

שים לב כי לאחר ספינינג tumorspheres אינם יוצרים גלולה יציבה, כך שאספירה supernatant צריך להיעשות בזהירות עם פיפטה מיליליטר אחד ו 200 מיקרוליטר פיפטות. לאחר פתרון חד-תאי מתקבל, להוסיף נפח של מדיה תא הגידול ולסובב אותו למטה ב 300 פעמים g במשך חמש דקות ב 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה זו, כל השלבים הבאים חייבים להתבצע על קרח.

השתמשו שוב בתאים במדיה של תאים סרטניים קרים וספירת תאים חיים באמצעות הדרה כחולה של טריפאן. לקבוע את המספר הנכון של תאים עבור allograft לדלל אותו 50 microliters של מדיה תאים סרטניים קרים. מניחים טיפ פיפטה במדיה תא גידול קר כדי לקרר אותו ולאחר מכן להשתמש בו כדי לקחת 50 microliters של פתרון ECM קר ולהוסיף אותו לצינור עם תאים, הקפדה לא להסיר את צינור ECM מקרח במהלך תהליך זה.

לשמור על התאים על קרח עד ההשתלה ולה מניחים מכוסה, 0.5 מיליליטר מזרק אינסולין עם מחט 29 מד על קרח. לאחר אישור כי העכבר כבר הרדמה כראוי, לגלח את הצד הימני של החיה, לשאוף את פתרון התא לתוך המזרק מקורר, ולהזריק את התאים תת עורית לתוך האזור המגולח. אם ההזרקה מבוצעת כראוי, בליטה גלויה תיוופס מתחת לעור.

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ליצור באופן אמין גידולים לזיהוי אוכלוסיות תאים נדירים האחראים על פיתוח סרקומה רקמות רכות. חלק מהותי מהצגה זו הוא אפליה בין גידולים ואשכולות תאים, אשר מפגינים הבדלים מורפולוגיים ברורים. כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי שבו חלבון של עניין מפעיל השפעה על תאים סרטניים, יש צורך להעריך את רמת הביטוי של מטרות במורד הזרם של החלבון.

שלושה מהגנים שנבדקו הראו תגובה תלוית מינון לטיפול בחלבון רקומביננטי ואחד לא. על מנת להקים פרוטוקול יעיל, ההשפעות של transfection על תאים סרטניים אינהרנטי נותחו;שתי כמויות שונות של רהט נבדקו ויעילות הוערכה עם פלסמיד GFP-כתב. כמויות נמוכות יותר של רגנט גרמו ליעילות גבוהה יותר של ההמרה.

היה צריך ליישם פרוטוקול דו-שלם כדי לבצע חילוף על תאים בהשעיה. Transfection בוצע על תאים חסידים ו 24 שעות לאחר מכן הם היו מנותקים מצופים בהשעיה;לאחר שבעה ימים, גידולים מבוקרים היו מבטאים GFP. לאחר גידולים מתקבלים, מטופלים, מושתלים ניתן להשוות את ההשפעה של טיפול שונה זה בגידול בגידול vivo.

שיטות אלה יאפשרו למדענים לענות על השאלות שעדיין עומדות של תא המוצא של rhabdomyosarcomas בעת ובעונה אחת הגדרת הבסיס להקרנת סמים.