הזמינות של אורגניזמים מודל culturable כבר היסוד להתקדמות בתחומים רבים של מחקר. פרוטוקול זה, לדעתנו, הוא הגישה היחידה הזמינה עבור culturing Doliolids. טכנולוגיית תרבות דוליוליאד אמינה מספקת מודל ניסיוני ייחודי לחקר אורגניזמים החשובים לכמה מהאזורים הפרודוקטיביים ביותר באוקיינוס ומייצגים את האבות הקדמונים האבולוציוניים המוקדמים ביותר של בעלי חוליות.
טכניקה זו היא ייחודית כפי שהוא שומר על חלקיקי מזון אצות ואת האורגניזמים תלויים בעמודת המים ללא מגע עם קירות המיכל כפי שהם חווים בטבע. ניתן ליישם שיטת פולחן זו על פולחן של מינים קטנים אחרים של ג'לטין וסרטנים או פלנקטון. מכיוון שלדולידים יש מחזור חיים מורכב, הבנה והכרה לצרכים של כל שלב בחיים היא קריטית.
לימוד מחזור החיים וכיצד לזהות ולטפל בהם דורש תרגול רב. מניסיונו, הדרך היחידה ללמוד את טכניקת הכת הזו היא לראות אותה ולעשות אותה. מספר משתתפים נוספים בפרויקט, ביניהם ארין ארנסון, ניקולס קסטליין, נטליה לופז, לורן לאמבוי, בריאנה פירס, אריה רודריגז-סנטיאגו ותרל סקארבורו, הופיעו אף הם לזמן קצר בסרטון זה.
לפני הקמה וגידול תרבויות דוליוליאד במעבדה, לנקות ולעקר 1.9 ו 3.8 ליטר צנצנות תרבות זכוכית על ידי טבילת אותם בתתסכול אשלגן הידרוקסיד נתרן. אפשר לצנצנות להשרות לילה. ואז להעביר את הצנצנות לתוך פתרון סודיום bisulfite.
אפשר לצנצנות להשרות לילה. לאחר מכן לשטוף את הצנצנות ביסודיות עם מים deionized. אפשר לצנצנות להתייבש.
כדי לשמור על תרבויות מלאי, השתמש בטכניקות קפדניות של תרבות צירית. כל שבועיים להעביר 0.5 מיליליטר של תרבות senescent הישן 25 מיליליטר של מדיה צמיחה טריים סטרילי 55 צינורות תרבות זכוכית מיליליטר. כדי להכין כמויות גדולות יותר של פיטופלנקטון להאכלת דוליולדים, להעביר ארבעה מיליליטר של phytoplankton מן המניות axenic לתוך 500 מיליליטר רקמות פלסטיק תרבות flasks המכיל 200 מיליליטר של מדיה צמיחה לחסן ב 1 עד 50 דילול.
חמוסים את התרבות באינקובטור סביבתי או בתא סביבתי ב 20 מעלות צלזיוס עם מחזור 12 עד 12 שעות אור כהה תחת תאורת אור לבן קריר של 65 עד 85 microEinsteins למ"ר. הניחו בקבוקונים תרבותיים שטוחים כדי למקסם את התאורה. מערבבים בעדינות את התרבות מדי יום.
צאו לים. כדי לאתר דוליולידים על המדף היבשתי, פרוס CTD של מכשיר אוקיאנוגראפי לזיהוי תנאי מים שתורמים לנוכחותם של דוליולידים על ידי פרופיל טמפרטורת המים, מליחות וכלורופיל פלואורסצנטיות. אשר את תנאי המים על ידי ביצוע גישושים נטו עם רשתות פלנקטון מיוחדות.
לחלופין, השתמש במערכת הדמיה פרופיל in situ כדי לזהות Doliolids. עכשיו להפעיל את הקרץ כדי לאחזר את CTD. בקבוקי ניסקין המותקנים על רוזט CTD אספו מי ים מהאתר בו נמצאים דוליולידים ובעומק המכיל את האומדנים הגבוהים ביותר של כלורופיל.
שוטפים שלושה דליים של 22 ליטר במי ים וממלאים במי ים לקצת יותר מחצי מלא. ממלאים את קצה בקלה נטו לחלוטין עם מי ים ולצרף את קצה בקלה לרשת. לפרוס את הרשת.
להוריד ולהרים את הרשת דרך עמוד המים, שמירה על זווית גרירה אלכסוני של 15 עד 25 מעלות ופריסה אנכית ומהירות אחזור לא יותר מ 15 מטר לדקה. ברגע שהנטו על הסיפון מעבירים בעדינות ומחלקים את תכולת קצה בקלה לדליי הפלסטיק שכל אחד מהם מכיל מי ים עיליים שנאספו מהאתר. באמצעות פיפטה זכוכית רחבת נשא בעדינות לערבב את התוכן של עם פיפטה באמצעות תנועות אנכיות ואופקיות.
באמצעות האצבע המורה, ליצור יניקה נימי ללכוד ולהעביר Doliolids. לכוד את הדוליולידים מפילטופלנקטון מעורב בפקעת. לאחר הוספת Doliolids, להוסיף את התרבות Rhodomonas לתוך הצנצנת לריכוז הסופי של כחמש פעמים 10 לשלישי עד 10 לתאים הרביעיים למיליליטר.
בדוק את צבע מערכת העיכול של דוליולידים. הצבע האדום קובע שהדוליולידים ניזונים באופן פעיל. כדי למנוע מדוליולידים להילכד בממשק מי האוויר, מלאו לחלוטין את הצנצנות במי ים לא מסונים ועשירים בחלקיקות כדי להימנע ממרחב הראש.
מניחים חתיכת ניילון נצמד על פתח הצנצנת. הימנעו מיצירת בועות אוויר שיכולות גם לגרום נזק לבעלי החיים. בזהירות לדפוק את הכובע על הצנצנת בעדינות להפוך את הצנצנת כדי לקבוע אם בועות נמצאים.
אם יש בועות, מלאו יותר מי ים כדי להסיר אותן. לאחר הצנצנות מתמלאים מחדש עם המכסה ולנגב את המים העודפים מבחוץ של הצנצנת. הר כל צנצנת על גלגל הפלנקטון על ידי הנחת הצנצנת על מוטות מתכת אנכיים מכוסים צינורות גומי בין מהדק צינור נירוסטה.
ודא כי החלק האחורי של הצנצנת מרופד על צינורות גומי. כוונן את הבורג כדי להדק את מהדק הצינור סביב הצנצנת. אפשר לצנצנות להסתובב ב 0.3 סל"ד כדי לשמור על Doliolids בהשעיה.
לאחר שלושה ימים התאקלמות לתנאי המעבדה להעביר 100 עד 150 מיליליטר של מי תרבות מן הצנצנת למיכל מדגם ולמדוד את ריכוז האצות באמצעות מונה קולטר. בהתבסס על הערכת ריכוז האצות, להוסיף אצות מספיק כדי להביא את הריכוז בצנצנת התרבות ל 40 עד 95 מיקרוגרם של פחמן לליטר. השתמש בדלפק החלקיק כדי לפקח על ריכוזי אצות לאחר Doliolids כבר האכלה כדי להנחות את ההחלטה של כמה תדירות וכמה אצות להוסיף לתרבויות.
לשמור על ריכוזי פיטופלנקטון בצנצנות התרבות בין 40 ל 95 מיקרוגרם של פחמן לליטר. Culturing Doliolids דורש תמיכה בהם דרך מחזור החיים המסובך שלהם. פיתוח זחלים, אוזואידים ואחיות מוקדמות.
ברגע שנראה לפחות שמונה טרופוזואידים על הקטפור של האחות, העבר לפחות ארבע אחיות לצנצנת פולחן חדשה. ברגע שהפורוזואידים מגיעים לגודל של שלושה מילימטרים, מקטין את מספר בעלי החיים בצנצנת. כאשר phorozooids להיות גדול יותר מחמישה מילימטרים פיתחו אשכולות גונוזואיד להסיר את כל אבל ארבעה phorozooids.
פרוטוקול זה מספק סקירה של גישת איסוף וטיפוח של דוליולטה ג'נבורי. שיעורי שחרור אצות היו דומים בריכוזים של 20 עד 60 מיקרוגרם של פחמן לליטר וירידה כמו ריכוזי המזון גדל. שיעורי הסליקה עלו באופן פרופורציונלי על פני טווחי טמפרטורה התומכים בצמיחת D.gegenbauri.
שיעורי צמיחה הנעים בין 0.1 ל 0.7 מילימטרים ליום כפונקציה של טמפרטורה וזמינות מזון נצפו. הטיפוח של דוליולידים תלוי בהצלחה בשכפול התנאים באוקיינוסים ובהתאימות הצרכים של בעלי החיים לאורך מחזור החיים המורכב שלהם. כתוצאה מכך, נדרש טיפול עדין בבעלי החיים במהלך לכידתם, בידודם וגידריהם.
ריכוזי המזון חייבים להיות מנוטרים לעתים קרובות ומותאמים. הדבר נכון במיוחד בשלבי החיים המתפתחים של הזחלים והאוטזואידים. שיטה זו תוכננה במיוחד לגידול מינים קטנים של זואופלנקטון בבסיס רשת המזון הימית.
שיטה זו תהיה בעלת ערך למשל כדי לחקור תגובות zooplankton לשינוי האקלים. מאז התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לאקולוגים זופלנקטון לקבוע את שיעורי האכלה, צמיחה ורבייה מבוססי מעבדה של דוליולידים. בנוסף שיטה זו סללה את הדרך לחקירות מולקולריות מהפכניות של דיאטת דוליוליאד בטבע.
אני רוצה להזכיר לך שפרוטוקול ניקוי הזכוכית כולל רייגנטים שהם מגרים נשימתיים ויש להשתמש בהם באזורים מאווררים היטב. עבודה בים יכולה גם להיות מסוכנת ולכן בצע את כללי בטיחות הספינה.
