המשמעות של פרוטוקול זה היא שהוא מציג טכניקת הדמיה ללא תווית המסוגלת לרכוש תמונות חדות גבוהה בשיעורי פריימים גבוהים, פשוטים וזולים יותר מטכניקות אחרות כמו DIC ותחום כהה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה קל ליישם וזה קל לשימוש. זה זול וזה יכול להיות משולב עם מיקרוסקופים פלואורסצנטיים בקלות.
השיטה פותחה להדמיית מיקרוטובולים בודדים. יש לו פוטנציאל לשמש להדמיית קומפלקסים חלבון גדולים חלקיקים. הקושי העיקרי הוא אנרגיית ההפעלה הנדרשת כדי להתעסק עם קוביית המסנן כדי להוסיף את המראה חצי כסף.
העצה שלי למישהו שמנסה את הטכניקה בפעם הראשונה היא פשוט לעשות את זה. כדי להתחיל, הכנס מראה 50/50 לתוך גלגל המסנן של מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות קוביית מסנן מתאימה. לטפל במראה בזהירות לעתים קרובות יש להם קידוד נגד השתקפות.
הפוך למטרה הגדלה גבוהה כי יש גם צמצם מספרי גבוה. זה המוצג כאן הוא יעד שמן 100x עם צמצם מספרי של 1.3. לאחר מכן, השתמש בסכין גילוח ובשקופית מיקרוסקופ כקצה ישר כדי לחתוך שלוש רצועות רחבות מילימטר של סרט פרפין מפלסטיק.
מניחים שניים של רצועות סרט פרפין פלסטיק שלושה מילימטרים זה מזה על 22 נקי על ידי 22 מילימטר כיסוי להחליק, ולאחר מכן למקם 18 על ידי 18 מילימטר כיסוי להחליק על גבי הרצועות כדי ליצור ערוץ. מעבירים את החלקת הכיסוי לבלוק חום ב-100 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 30 שניות כדי שסרט הפרפין יתגבש בערוץ אטום. באמצעות פיפטה, לזרום 50 מיקרוגרם למיליליטר של נוגדן אנטי רודמין על ידי נזיפה דגירה את השקופית במשך 10 דקות.
לאחר הדגירה, לשטוף את הערוץ חמש פעמים באמצעות BRB80 מסונן, ולאחר מכן לזרום 1%Poloxamer 407 ב BRB80 מסונן כדי לחסום את פני השטח נגד כריכה לא ספציפית דגירה השקופית במשך 10 דקות. שוב, לשטוף את הערוץ חמש פעמים באמצעות BRB80 מסונן. כדי למנוע התייבשות הדגימה, הוסף שתי טיפות של BRB80 המסונן בקצות הערוץ והוסף מאגר נוסף לפי הצורך.
מניחים את הדגימה על שלב המיקרוסקופ ומדליקים את מקור האור של תאורת האפי. התמקד בקצה סרט הפרפין כדי למצוא את משטח הדגימה ולאחר מכן הזז את השדה כדי להגדיר את התצוגה למרכז התא. תוכלו לצפות משטחים מרובים כמו המטרה מועברת למעלה ולמטה עקב השתקפות אחורית של אור אופטי בתוך הנתיב האופטי.
לאחר מכן, מרכז את הסרעפת בשדה התצוגה על-ידי סגירתה באמצע הדרך ושימוש בברגים של ההתאמה. לאחר הסרעפת מיושר כראוי, לפתוח אותו מחדש. לאחר מכן, החלק בעדשת ברטרנד כדי להציג את מישור המוקד האחורי, הידוע גם כתלמיד היציאה של המטרה.
סגור את הסרעפת הצמצם מעבר לקצוות של אישון היציאה ולהשתמש ברגים התאמה למרכז הסרעפת הצמצם ביחס לתלמיד היציאה. בדוק שוב על ידי פתיחת הסרעפת הצמצם התאמת הקצוות שלה עם אלה של אישון היציאה. לאחר מכן, הגדר את הסרעפת הצמצם כשני שלישים של הצמצם המספרי של המטרה.
כדי להתחיל, הגדר את זמן החשיפה של המצלמה ל- 10 אלפיות שניה והתאם את התאורה כך שכמעט תרווה את הטווח הדינמי של המצלמה. לאחר מכן, השתמשו בפיפסה כדי לזרום ב-10 מיקרוליטרים של מיקרוטובולים המיוצבים על ידי GMPCPP במיקרו-מיקרומטר מסונן BRB80. לפקח על כריכת microtubule על ההדמיה של פני השטח.
לאחר 10 עד 20 microtubules כבולים בתוך שדה הנוף, לשטוף את המדגם פעמיים עם BRB80 מסונן. רכוש 10 תמונות של המיקרוטובולים על-ידי הגדרת מעידת זמן עם חשיפה של 10 אלפיות שנייה ותהליכי השהיה של שנייה אחת למשך 10 שניות בסך הכל. לאחר מכן, רכוש תמונות רקע על-ידי הזזת השלב באמצעות בקר הבמה לאורך הציר הארוך של הערוץ תוך רכישת 100 תמונות ללא השהיה.
כדי לדמיין דינמיקה של microtubule באמצעות צינורית המוח, התחל בקביעת טמפרטורת התנור לדוגמה ל- 37 מעלות צלזיוס. באמצעות פיפטה, לזרום 10 microliters של זרעי microtubule מיוצב GMPCPP ולנטר אותם מחייב אל פני השטח על ידי הדמיה פני השטח לחיות. לאחר 10 עד 20 זרעים כבולים בתוך שדה התצוגה, לשטוף את המדגם באמצעות נפח ערוץ כפול של BRB80 מחומם מראש ומסונן.
לאחר מכן, זורמים ב-10 מיקרוליטרים של תערובת הפולימריזציה. כדי למדוד צמיחת microtubule, להגדיר לשגות זמן באמצעות תוכנת הרכישה כדי להשיג תמונה כל חמש שניות במשך 15 דקות. שפר את החדות על-ידי רכישת תמונה ממוצעת של 10 בכל נקודת זמן.
רכוש תמונות רקע כפי שמוצג בסעיף הקודם. חשב את החציון על-ידי ניתוח תמונה, בחירת מחסנית ולאחר מכן פרוייקט Z ולאחר מכן חציון. הפחת את הרקע המתאים על-ידי הליכה לעיבוד, הליכה אל מחשבון תמונה ובחירה בהפחתה מהתפריט הנפתח.
ודא שאפשרות התוצאה של ציפה של 32 סיביות מסומנת. עבור התכווצות microtubule, לרכוש תמונות ב 100 מסגרות לשנייה על ידי הגדרת השהיית הזמן לאפס ושמירה על זמן החשיפה ב 10 אלפיות השניה. גורם חשוב לרכישת תמונות חדות גבוהה עם מיקרוסקופ אינדוקציה הפרעה היא להגדיר כראוי את הצמצם המספרי של התאורה.
זה יכול להיעשות על ידי הנחיית גודל קרן התאורה בתלמיד היציאה של המטרה, הנשלטת על ידי גודל הסרעפת הצמצם. באמצעות מדגם של microtubules מיוצבים המסומנות באופן פלורנטי, להביא את microtubules לפוקוס באמצעות ידית המיקוד של המיקרוסקופ תוך הדמיה פלואורסצנטית אותם. הגדר את החשיפה למצלמה ל- 10 אלפיות השניה וסגור את הסרעפת הצמצם לפתיחה הקטנה ביותר שלו.
כמו כן, התאימו את התאורה לכמעט רוויה בטווח הדינמי של המצלמה או עד להגעה למקסימום. רכוש 10 תמונות על-ידי הזרמת שדה תצוגה המכיל 10 מיקרוטובולים או יותר. לאחר מכן רכוש תמונת רקע.
שנה את גודל הסרעפת והתאם את עוצמת התאורה כך שתתאים לזה שנקבע קודם לכן. לרכוש 10 תמונות חדשות ורקע חדש. חזור על תהליך זה עד שכל טווח הסרעפת יושלם.
עבור כל שדה תצוגה שנרכש, הפחת את הרקע המתאים וה ממוצע התמונות המחסות ברקע כפי שהוצגו קודם לכן. לאחר מכן, לחשב את האות הממוצע יחס רעש רקע של microtubules עבור כל גודל פתיחה. הגדר את גודל הסרעפת לזה המייצר את יחס האות הגבוה ביותר לרעשי רקע.
ייתכן שיש מגוון גדלים המייצרים ניגודיות דומה כפי שמוצג כאן. עם מיקרוסקופ מיושר היטב, microtubules צריך להיות גלוי ללא חיסור רקע. עם זאת, חיסור הרקע משפר את הניגודיות של המיקרוטובול.
כדי לשפר עוד יותר את הניגודיות, ממוצע, סינון 4a, או שילוב של שניהם ניתן להשתמש. סריקות הקו המוצגות כאן מתארות את השיפור המצטבר באיכות התמונה. אלה מתארים הפחתה ניכרת של רעשי רקע עם כל שלב עיבוד.
דינמיקה microtubule ניתן דיווח בקינוגרפים, אשר נוצרים מסרטים לשגות זמן. קינוגרף לדוגמה שנרכש בקצב פריימים של 0.2 מסגרות לשנייה מוצג כאן. הקווים המקווקווים מסמנים את הזרעים.
בעת ביצוע הליך זה, חשוב לעבוד עם מטרות צמצם מספרי גבוהות. חשוב גם ליישר ולהגדיר את גודל מסגרת קוטר הצמצם בצורה נכונה. קל לשלב IRM עם הדמיה פלואורסצנטית כדי ללמוד, למשל, חלבונים מחייבים microtubule וכיצד הם משנים דינמיקה microtubule.
הטכניקה מפחיתה במידה ניכרת את נזקי הצילום ומאפשרת רכישת קצב מסגרות גבוה יותר, מה שמקל על לימוד ביופולימרים מסומנים כגון microtubules לפרקי זמן ממושכים עם רזולוציית זמן גבוהה ודיוק מעקב טוב.
