היום אנחנו הולכים להציג זחלים זברה PDX מודל. מודל זה הוא משמעותי כי הם יכולים לחקות טוב יותר הרכב הסלולר דומה xenograft להערכת תגובות סמים וגם משפר עוד יותר את העקביות של התוצאות עם הניתוח ההשוואתי שלנו. ישנם שני יתרונות עיקריים של טכניקה זו.
ראשית, אנו משתמשים בצבעים כימיים סטנדרטיים שונים כדי לסמן תאים לתוך פלואורסצנטיות שונה, המאפשר מעקב בזמן אמת של הרכבים הסלולר ואת היכולת של שלב האנגרף. שנית, זה גם משפר את זמן ההישרדות הכללי של תאים אנושיים בזברה, השינוי הגנטי שלהם, אשר מספק חלון תצפית ארוך יותר לבדיקות סמים. טכניקה זו מספקת מודל פוטנציאלי לרפואה מותאמת אישית לחולים עם סרטן הלבלב וגם להערכה מוקדמת של תרופה לגידולים פרה-קליניים.
שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לעקוב אחר תאים סרטניים אחרים או לא תא הגידול xenografted זברה ב vivo ולשפר את הישרדות התא במשך זמן תצפית ארוך יותר. כדי להכין את צלחת ההזרקה, להכין פתרון 50 מיליליטר של 1%agarose בתתכונה E3. מרתיחים את הפתרון עד שהתעוררות מתמוססת.
יוצקים את כל הפתרון לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולאחר מכן מניחים את עובש קיבוע העובר זברה על פני השטח. כאשר הפתרון agarose מתגבש לחלוטין, להסיר את התבנית. כדי להכין מחטי הזרקה, השתמש מושך מחט למשוך נימי זכוכית 10 ס"מ עם מימד פנימי של 0.9 מילימטרים לתוך שתי מחטים.
באמצעות מיקרוסקופ ומדפים, לחתוך את קצה המחט כדי ליצור פתח. ראשית, מניחים זוג אחד עד שניים של דגי זברה בוגרים במיכל הזדווגות בסביבות שבע עד תשע בערב. בשמונה בבוקר שלמחרת, לאסוף את הביציות המופריות. מעבירים את הביציות המופריות לצלחת פטרי המכילה 40 מיליליטר של תוסף E3 טרי.
דגירה ב 28.5 מעלות צלזיוס. ראשית, להעביר את דגימת סרטן הלבלב שנאסף לתוך צלחת פטרי. לשטוף את הרקמה חמש עד שש פעמים עם PBS ולהשתמש אזמל לחתוך את הרקמה לחתיכות קוביות מילימטר אחד.
לאחר מכן, להעביר את הרקמה מגוררת לתוך צינור 50 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר של HBSS. הוסף קולגנס מסוג ארבע, היאאלורודיניאז ו- DNAse אחד בריכוזים הסופיים המוצגים כאן. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כדי לערבב היטב.
להחגירה את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%פחמן דו חמצני במשך 15 עד 20 דקות. פיפטה את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כל חמש דקות. הוסף שבעה מיליליטר של DMEM לצינור.
צנטריפוגה ב 110 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן, decant supernatant ולהשעות מחדש את תערובת הגידול ב- DMEM. צלחת התערובת לשתי מנות פטרי שישה סנטימטר המכיל שלושה מיליליטר של מדיה צמיחה מלאה בשם קבוצה אחת וקבוצה שתיים.
דגירה שתי הקבוצות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5%פחמן דו חמצני. לאחר 48 שעות, להוסיף מעכב 100x של פיברובלסטים סרטן הלבלב לתוך המדיום של קבוצה אחת כדי להסיר את fibroblasts מגודל, עוזב את התאים הסרטניים כמו סוגי התאים העיקריים. המשך דגירה באמצעות התנאים הקודמים.
לאחר ייצור lentivirus, זרע את התאים להיות נגוע לתוך צלחת 12 באר עם 30 עד 40% צפיפות. תרבו את התאים בן לילה ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% פחמן דו חמצני. למחרת, החלף את המדיום ב-500 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום המכיל פוליברן בריכוז של שמונה מיקרוגרם למיליליטר.
דגירה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע שעות. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters נוספים של lentivirus למדיום דגירה שוב במשך 12 שעות. לאחר 12 שעות, להחליף את המדיום עם שני מיליליטר של מדיום מלא דגירה במשך 36 שעות נוספות.
לאחר 36 שעות, בדקו את סמני הפלואורסצנטיות. לקצור את התאים הנגועים ולערבב אותם ביחס של אחד לאחד עם ריכוז סופי של מיליון תאים למיליליטר. צנטריפוגה התאים ב 110 פעמים G במשך חמש דקות מחדש להשעות את תערובת התא ב 50 microliters של פתרון הזרקה.
לאחר הרדמה של זחלי הזברה, מעבירים אותם לצלחת ההזרקה, המלאה ב- E3 שונה. קח 25 microliters של ההשעיה תא מעורב לתוך המחט microcapillary ולהכניס את המחט לתוך מניפולטור microinjection. הגדר את לחץ ההזרקה ואת הזמן ולהזריק 50 עד 80 תאים לתוך שם החלמון של 48 שעות לאחר ההפריה זברהפיש. ראשית, מעבירים את זחלי הזברה שלאחר הזנוגרפט ל-40 מיליליטר של תסריט מיקס ב-32 מעלות צלזיוס.
מניחים 10 זחלים זנוגרפטים לתוך כל באר של צלחת 12 באר. לאחר מכן, חלקו את הזחלים לארבע קבוצות. פנקו בקבוצת הביקורת E3 המכילה 0.1%DMSO וטפלו בקבוצות האחרות באמצעות Gemcitabine ו/או Navitoclax.
דגירה כל הזחלים ב 32 מעלות צלזיוס במשך יומיים. לאחר הרדמה של הזחלים הזנוגרפטים לאחר הטיפול, מניחים אותם בתאית מתיל 3%. השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי כדי לדמיין את הזחלים מהתצוגה הבין-ארצית.
לאחר מכן, השתמש בתוכנת Image J ו- graph Pad כדי לכמת את עוצמת אותות הפלואורסצנטיות האדומים והירוקים. במחקר זה, תאי רקמת סרטן ראשוניים נזרעים לתוך בינוני מלא לאחר העיכול עם או בלי תוספת של מעכבי פיברובלסטים סרטן הלבלב. תאים סרטניים ופיברובלסטים מועשרים כשתי אוכלוסיות נפרדות.
האוכלוסייה ללא מעכבים נשלטת על ידי fibroblasts בעוד צמיחת תאים סרטניים שוררת לאחר תוספת של מעכבים. שני וקטורים אריזה lentiviral בנויים אשר מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ירוקים או אדומים ב BCL2L1. תיוג הפלואורסצנטיות המבוססת על וירוסים מייצג את מצב ההישרדות של התאים.
תאים סרטניים מעורבים fibroblasts מוזרקים לתוך שם חלמון זברה ב 48 שעות לאחר ההפריה ולאחר מכן מטופלים עם Gemcitabine ו / או Navitoclax במשך יומיים. הוויאציות התאיות באוכלוסיות שונות וההרכב התאי של הזנוגרפט משתנות כתגובות לטיפול התרופתי. בעת עיבוד סוגים שונים של גידולים, ישנם מספר שלבים שייתכן שיהיה צורך להתנגד, כולל זמן עיכול התא, מינון טיפול תרופתי, וכן הלאה.
טכניקה זו מסייעת לחוקרים להעסיק דגי זברה ממבחן CGX או PDS סטנדרטי. זה מאפשר ערבוב והזרקה של תאים שונים ביחסים קבועים לכמת את רצועות ההתקדמות על ידי השוואתם לצמיחת תאים. הגנה אישית היא בעלת משמעות רבה, במיוחד כאשר אריזת lentivirus.
ללבוש מסכות וכפפות בעת הצורך ולנסות לא לערבב על העור.
