כרומוגניים היברידיזציה באתרו הכלי עבור אבחון הקשורות HPV וסרטן צוואר

HPV RNA CISH מאפשר זיהוי של זיהום וירוס פפילומה אנושי פעיל. מאז היברידיזציה in-situ מטרות HPV RNA טכניקה זו מאפשרת הדמיה של שעתוק פעיל של הנגיף. יש לו רזולוציה מרחבית מדויקת והופעות אבחון טובות.

זיהוי של HPV עשוי לתמוך באבחון של מספר נגעים הקשורים HPV, כגון קרצינומה של תאים קשקשיים oropharyngeal או neoplasia צוואר הרחם. זה יכול להיות גם השפעה על הפרוגנוזה. לאחר הכנת מאגרים וריגנטים נגד מכתימים, הכינו רהגנט אחזור יעד x אחד בסקילר גדול על ידי הוספת 70 מיליליטר של רהגנט אחזור יעד 10x ל-630 מיליליטר של מים מזוקקים.

מניחים את המזימה על צלחת חימום עם ערבוב מגנטי ומכסים אותה בנייר אלומיניום. מרתיחים את תכולתו ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 עד 15 דקות הקפדה לא להרתיח אותו במשך יותר מ 30 דקות. כדי לחסום פעילות peroxidase על שקופיות עם מקטעי רקמות בעבר deparaffinized והניח בארון השקופיות, להוסיף ארבע עד שש טיפות, רק מספיק כדי לכסות את המדגם, של מי חמצן לכל שקופית, ותדגור אותם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.

לשטוף את המגלשות פעמיים במשך שתי דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. כדי לשבור את גבולות רקמת RNA בחלקי רקמת RNA, תחילה להסיר את רדיד אלומיניום מן הרותחת אחד x TRR באמצעות טופר, ולהפסיק לבחוש. לטבול את מתלה השקופיות לאט ובזהירות רבה.

מכסים את המזימה שוב בנייר אלומיניום, ו דגירה במשך 15 דקות. השתמש בטופר כדי להעביר מיד את מתלה השקופיות החם לאמבט מים מזוקק ולשטוף אותו במשך שתי דקות. לשטוף את השקופיות ואז טרי 100% אתנול במשך שתי דקות, ולתת להם להתייבש בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות.

לאחר מכן, השתמש בעט מחסום הידרופובי כדי לצייר מחסום סביב כל דגימה, ולתת לו להתייבש לפחות חמש דקות. לעיכול פרוטאז, מניחים את השקופיות במגש מבוקר הלחות ומוסיפים כארבע טיפות של Protease Plus לכל מדגם. מכסים את המגש במכסה, ומכניסים אותו לתנור ההכלאה למשך 30 דקות ב-40 מעלות צלזיוס.

מוציאים את המגש מהתנור ומסירים את מתלה השקופיות. עובדים על שקופית אחת בכל פעם, מסירים במהירות כל נוזל עודף ומניחים את השקופית בארון השקופיות שקוע בצלחת מכתים מלאה במים מזוקקים. לשטוף את המגלשות פעמיים במשך שתי דקות במים מזוקקים בטמפרטורת החדר עם תסיסה מתמדת.

כדי להתחיל בהכלאה, הקש והחלק את השקופיות כדי להסיר נוזל עודף ולמקום אותו בחזרה בארון התקשורת של השקופיות. הסר בדיקת HPV מחוממת מראש מהתנור, והוסף כארבע טיפות כדי לכסות לחלוטין כל קטע. מכסים את המגש עם המכסה, ומכניסים אותו לתנור במשך שעתיים ב 40 מעלות צלזיוס.

לאחר השלמת הדגירה, מוציאים את המגש מהתנור ומסירים את מתלה השקופיות. שקופית אחת בכל פעם, הסר במהירות כל נוזל עודף והצב את השקופית בארון השקופיות שקוע בצלחת מכתים מלאה במאגר כביסה x אחד, שוטף את השקופיות במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה מתמדת, וחוזר על הפעולה עם חיץ שטיפת x אחד טרי. הקש והחלק כדי להסיר נוזל עודף מהשקופיות והצב אותו שוב בארון התקשורת של השקופיות.

הוסף כארבע טיפות של AMP1 טמפרטורת החדר לכל קטע כדי לכסות לחלוטין כל קטע. מכסים את המגש עם המכסה, ומכניסים אותו לתנור במשך 30 דקות ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר הסרת המגש מהתנור, הסר את מתלה השקופיות.

עובדים על שקופית אחת בכל פעם, מסירים במהירות כל נוזל עודף ומניחים את השקופית בארון השקופיות שקוע בצלחת מכתים מלאה במאגר כביסה x אחד, שוטפים במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר בתסיסה מתמדת וחוזרים על הפעולה עם חיץ x כביסה אחד טרי. לוותר על אותו מספר טיפות של כל פתרון DAB-A ו- DAB-B בצינור בגודל מתאים כדי להפוך כ 120 microliters של מצע DAB לכל קטע, ומערבולת. קח כל שקופית, אחת בכל פעם, מארונות התקשורת של השקופיות, הקש והחלק כדי להסיר נוזל עודף והחזר אותו לאר השקופיות.

פיפטה כ 120 microliters של תערובת DAB על כל קטע רקמה, לוודא כי החלקים מכוסים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולהמשיך עם נגדי. מניחים טיפה אחת של מדיום הרכבה לכל לוח זכוכית, ולאחר מכן מניחים את הלוחות על המגלשות ולתת להם אוויר יבש.

לאחר מספר שעות, המשך בהערכה באמצעות מיקרוסקופ אופטי כמתואר בכתב היד. כפי שמתואר כאן קרצינומה של תאים קשקשיים בראש ובצוואר, נוכחות של כתמי פנצ'טים חומים בציטופלסמה או בגרעין של תאים סרטניים הגדירה מקרה חיובי. התוצאות חולקו לשני ציונים, RNA CISH ציון גבוה ונמוך כפי שנצפה עם מטרה 20x.

כתמי ציון CISH RNA נחשב נמוך כאשר נצפה מתחת 50% של תאים סרטניים מכסה פחות מ 80% של פני השטח של התא. מצד שני, ציון RNA CISH גבוה כאשר נצפתה ביותר מ -50% מהתאים הסרטניים המוכתמים, או עם משטח הכתמים העולה על 80% ביותר מ -30% מהתאים הגידוליים. אף אחד לא צריך לתת את השקופיות להתייבש להכלאה.

אל תשכחו להתחממות מוקדמת של הגשוש. עבור כל מדגם, לבצע שליטה חיובית ושלילית על מנת להעריך את איכות RNA.