פרוטוקול זה הוא טכניקה חזקה כדי לקבוע את השלמות התפקודית של צמתים הדוקים בין תאיים במודל התא של מחסום הדם - מוח האנושי. זהו פרוטוקול פשוט וזול למדי המאפשר לחשב את החלחלות לכאורה בתקופה קצרה יותר במקום להפעיל תצהיר קינטי ארוך יותר. שיטה זו יכולה לשמש גם כדי לקבוע את השלמות התפקודית של צמתים הדוקים בתאי אנדותל במוח מנופקטים עם חלקיקי DNA פולימריים.
כדי להתחיל ציפוי תאים, מניחים את תרבות הרקמה עם קרום מיקרופורי לתוך צלחת תרבות 24 באר. הוסף 400 מיקרוליטרים של קולגן 0.15 מיליגרם למיליליטר אחד בכל הכנסת תרבות רקמה. ואז דגירה במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.
רוק צלחת 24 באר בעדינות כדי לאפשר אפילו הפצה של תספורת קולגן על קרום מיקרופורי בתרבות הרקמה מוסיף. לאחר שעה, להסיר את תספורת הקולגן בעדינות לשטוף את קרום microporous עם 0.4 מיליליטר של חיץ PBS 1X. עכשיו, לוח hCMEC / D3 תאים עם צפיפות של 50, 000 תאים לסמטר מרובע בתא מוסיף.
מניחים את הצלחת 24 באר עם הגדרת תרבות הרקמות באינקובטור כדי לאפשר חיבור תאים והתפשטות. הדגירה את הצלחת במשך שבעה ימים כדי לאפשר לתאים להגיע 100% confluency. הסר את מדיום הצמיחה כל יומיים והעבר 0.5 מיליליטר של מדיה טרייה מחוממת מראש לתוך מוסיף תרבות הרקמות.
חזור על הליך הציפוי עבור כתמים מערביים כדי לקבוע שינויים בביטוי ZO-1 עבור transfection ננו-חלקיקי DNA, ועל הבדיקה ATP כדי לקבוע את הכדאיות התא בתאים מפוספסים. לקביעת חודרות לכאורה של לוציפר צהוב, בכל יום לאחר הזריעה, הסר את מדיום הצמיחה והוסף 1.5 מיליליטר של חיץ תחבורה מחומם מראש לצד הבזלתי של הבאר. עכשיו להוסיף 58.3 microliters של 20 מיקרומולר לוציפר צהוב פתרון לצד apical של כל הכנסה טרנס-היטב.
חסוך 50 מיקרוליטרים של הפתרון למדידות פלואורסצנטיות. לאחר הסרת מאגר PBS שיורית לחלוטין מהצד apical, להוסיף פתרון צהוב לוציפר מהר ככל האפשר, כדי למנוע ייבוש התאים. הבטח כמויות מדויקות של פתרון צהוב לוציפר בצד הקוף.
הקפד להוסיף את אותו נפח מדויק של פתרון לוציפר צהוב בכל התוספות. לעבוד במהירות כדי למנוע ייבוש התאים. הדגירה את התאים בשייקר צלחת סיבובית ב 100 סל"ד ו 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
לאחר מכן הסירו 30 מיקרוליטרים של דגימת צהוב לוציפר מכל תא אפי. העבר את הפתרון הצהוב של לוציפר 20 מיקרומולרית ואת דגימות הצד האפטימי לצינורות מסומנים מראש. עכשיו לדלל את הדגימה פי עשרה באמצעות מאגר תעבורה.
מוציאים 500 מיקרוליטרים מכל תא בזלת, ומעבירים את הדגימה לצינורות מסומנים מראש. הכן סדרה של תקנים צהובים של לוציפר עבור העקומה הסטנדרטית. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של כל דגימה אפית ובזלת סטנדרטית לכל באר של צלחת שחורה של 96 בארות בכפילות.
השתמש בקורא מיקרופלסטיק פלואורסצנטי כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות הצהובה של לוציפר ולחשב את החלחלות לכאורה, כמתואר בטקסט כתב היד. ההשפעה של זמן פולחן על חודרות צהובה לוציפר שימשה כדי לקבוע את הקינטיקה לכאורה של היווצרות צומת הדוק. ערכי החדרות לכאורה ירדו באופן משמעותי ביום השביעי לעומת היום הראשון, מה שמרמז על כך שהמחסום נעשה הדוק יותר.
ערכי החלחלות לכאורה התייצבו עד יום 10. הדבר מרמז על כך שהיווצרות המחסום הייתה שלמה ופונקציונלית, וכתוצאה מכך ירדה התחבורה המצנחית הצהובה של לוציפר. סופג מערבי שימש כדי לזהות שינויים בביטוי של חלבון צומת הדוק ZO-1 לאורך זמן.
שתי הלהקות מייצגות את שני אייזופורמים ZO-1. ניתוח Densitometry גילה כי ערך הפיקסל של ZO-1 עלה מימים שלוש עד שבע לאחר הזריעה, מה שמרמז כי חלבון הצומת ההדוק ZO-1 נוצר ללא הרף מיום שלוש עד שבע. לאחר טיפול דלדול סידן ביום שבע לאחר הזריעה, הלהקה של ZO-1 היה כמעט בלתי ניתן לגילוי, המציין כי ZO-1 לא היה מסוגל להיווצר בהיעדר יוני סידן.
כפי שמוצג בתוצאות, ניתן לבצע כתמים מערביים של חלבון ZO-1 כדי לקבוע שינויים ברמת הביטוי של חלבוני צומת הדוקים, המשלימים את נתוני הפעילות הפונקציונלית המבוססת על צהוב לוציפר. גילינו גם שהפעילות התפקודית של צמתים הדוקים בתאי אנדותל במוח האדם לא הושפעה מהתמרה ננו-חלקיקית של דנ"א.
