המחברים רוצה להודות גרגורי האלר (הר סנט וינסנט אוניברסיטת) עבור עבודתו ראשוני בפיתוח של הפרוטוקול. המחברים רוצה גם להודות ג'ונס ניקולס (אוניברסיטת סנט וינסנט הר) עבור שלו מומחיות טכנית ועזרה עם הצילומים וייצור של חלק אודיו-ויזואלית של כתב היד. דניאל אנדרוז נתמכה על ידי מימון MSVU ו מדעי הטבע הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) דרך פרס מחקר של סטודנטים לתואר ראשון. תמרה א פרנץ-Odendaal נתמך על ידי מענק גילוי NSERC.

הערה: עבור העובר בשלבים, לנצל את ההמבורגר והמילטון12 (HH) היערכות טבלה.
1. העובר דגירה
<ol><li>דגירה הביצים עוף מופרית חממה סטרילי, בטמפרטורה מבוקרת-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות.</li>
	<li>להפוך את הביצים 1 x ליום ולאפשר להם דגירה עד HH34 (8 ימים לאחר ההפריה).</li>
</ol>2. הכנה ועיקור של החומרים
<ol><li>עבור 12 עוברי, החיטוי 2 ל' מים מזוקקים, 1 ליטר של תמיסת מלח צ'יק 0.85%, פיפטות זכוכית 12, 1 קופסה של נייר טישו, 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועי נייר סינון נקבוביים למחצה ו- 24 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ ריבועים של תיל פלדה רשת עם קצוות מעוגלים כלפי מטה. כדי לעקר את החומרים, החיטוי אותם ב 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. הערה: autoclaving של החומרים יכול להיעשות מראש.</li>
	<li>לעקר את החממה עם 70% אתנול שתמחקי את הצדדים, מדפים, הדלת. מניחים 2 מיכלי פלסטיק המכיל בלוק מזוקקים מים בתוך החממה כדי לשמור על לחות. Prewarm החממה תרבות כדי 37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות. להבטיח שהחממה חשוך לחלוטין; אם הדלת שקוף, מכסה אותו עם נייר כסף.</li>
	<li>Prewarm 100 מ של חומר מזין בינוני, 1 מ"ל של פניצילין על-ידי הצבתם בחממה תרבות.</li>
	<li>מכסה את סביבת העבודה עם מגבת נייר, לעקר את הספסל על ידי התזה עם 70% אתנול. לחטא 2 זוגות של מלקחיים, חיתוך מספריים, סכין גילוח, כפית פלסטיק עם 70% אתנול באופן דומה.</li>
	<li>צלחות פטרי סטריליות 100 מ מ מקום 12 ו- 24 צלחות פטרי סטריליות 35 מ מ על הספסל לשימוש. ודא שהמנות נשארים בשקית סטרילית עד השימוש.</li>
</ol>3. עובר הכנה
הערה:, מנקודה זו ואילך, תלבש מסיכת פנים מגן אבק כדי להימנע מזיהום התרבויות. זיהום חיידקי או פטרייתי יהרוס את התרבות, ויש סיכון של זה מתפשטת במהירות בכל התרבויות בחממה.
<ol><li>לפצח את הביצה ולהעביר את העובר צלחת פטרי 100 מ מ המכיל תמיסת מלח צ'יק 0.85%. בשלב העובר על פי התכונות אנטומי תיאר המבורגר, המילטון היערכות הנחיות12 , לאשר העובר הוא HH34.</li>
	<li>חתך את הצוואר, ואז קטיעות ראש העובר בקו האמצע באמצעות תער מעוקר. בעזרת מלקחיים סטרילי, מסירים את המוח. להשאיר את האף ללא פגע.</li>
</ol>4. תרבות ההתקנה
<ol><li>2. המקום של 35 מ מ פטרי בתוך צלחת פטרי 100 מ מ אחד.</li>
	<li>מניחים רשת תיל פלדה בתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, העברה 1 של ראשי זיבצנטן פיסת נייר סינון נקבוביים למחצה 2.5 ס"מ x 2.5 ס"מ עם העין פונה כלפי מעלה. ודא הרקמה מאובטחת לא להחליק על-ידי הטיית אותו מעט.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, בזהירות המקום רקמת העין, נייר הסינון על גבי רשת התיל פלדה 1 של 35 מ מ פטרי, יצירת במה מוגבהת עם רקמת העין על העליונה.</li>
	<li>חזור על שלבים 4.3 ו- 4.4 עם חצי ראש אחרים.</li>
	<li>בזהירות בעזרת פיפטה של זכוכית סטריליים, להוסיף את מזין בינוני ישירות לתוך צלחת פטרי כל 35 מ מ עד שהוא מגיע לרמת נייר הסינון. לא להטביע את הראש חצי במדיום התזונתי.</li>
	<li>להוסיף 50 µL של 10,000 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין המדיום מזין בכל צלחת פטרי.</li>
	<li>מקפלים פיסת נייר טישו לתוך כיכר קטנה ומניחים אותו בתוך 100 מ מ פטרי. להרטיב אותה במים מזוקקים בלוק.</li>
	<li>מקם את המנה תרבות לתוך החממה סטרילי, כהה-37 ° C ± 1 ° C ו ~ 40% לחות עד 4 ימים.</li>
	<li>חזור על שלבים 3 ו- 4 עבור כל העובר. הערה: מספר העוברים צריך יהיה תלוי בניסוי מסוים; כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עוברי 12.</li>
</ol>5. תרבות תחזוקה
<ol><li>פעם אחת ביום, למעלה למעלה את מיכלי פלסטיק בחממה עם מים מזוקקים טריים, בלוק.</li>
	<li>מדי יום בדוק בכל התרבויות עבור זיהומים חיידקים או פטריות. תרבויות זה יש התפוררה או שבהם המדיום השתנה צבע נגועים. למחוק את כל התרבויות שהודבקו.</li>
</ol>6. קיבוע
<ol><li>בעקבות culturing, הסר את כל המנות של החממה.</li>
	<li>באמצעות זוג מלקחיים, להסיר בעדינות את העין נייר הסינון, מטפל לא לקרוע את הרקמה.</li>
	<li>לתקן את רקמת העין paraformaldehyde 4% 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח בן לילה ב 4 ° C או בפורמלין באגירה נייטרלי 10% למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>אחסן את הרקמה ב 4 ° C 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+understanding+the+development+of+scleral+ossicles+in+the+chicken,+Gallus+gallus.">Towards understanding the development of scleral ossicles in the chicken, Gallus gallus.</a> Developmental Dynamics. 237 (11), 3240-3251 (2008).</li><li>Scholey, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+motor+proteins+in+echinoderm+embryos:+an+argument+in+support+of+antibody+inhibition+experiments.">Functions of motor proteins in echinoderm embryos: an argument in support of antibody inhibition experiments.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 39 (4), 257-260 (1998).</li><li>Horakova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+FGFR+inhibitors+on+chicken+limb+development.">Effect of FGFR inhibitors on chicken limb development.</a> Development, Growth &amp; Differentiation. 56 (8), 555-572 (2014).</li><li>Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbead+Implantation+in+the+Zebrafish+Embryo.">Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo.</a> Journal of Visualized Experiments. (101), e52943 (2015).</li><li>Luz-Madrigal, A., Grajales-Esquivel, E., Del Rio-Tsonis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+Embryonic+Chick+Eyes.">Electroporation of Embryonic Chick Eyes.</a> Bio-protocol. 5 (12), e1498 (2015).</li><li>Roach, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+organ+culture+of+embryonic+chick+femora:+a+system+for+investigating+bone+and+cartilage+formation+at+an+intermediate+level+of+organization.">Long-term organ culture of embryonic chick femora: a system for investigating bone and cartilage formation at an intermediate level of organization.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 5 (1), 85-100 (1990).</li><li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+inhibitory+action+of+BMPs+and+their+relationships+with+activators+in+feather+formation:+implications+for+periodic+patterning.">Local inhibitory action of BMPs and their relationships with activators in feather formation: implications for periodic patterning.</a> Developmental Biology. 196 (1), 11-23 (1998).</li><li>McKinnell, I. W., Turmaine, M., Patel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+Hedgehog+functions+by+localizing+the+region+of+proliferation+in+early+developing+feather+buds.">Sonic Hedgehog functions by localizing the region of proliferation in early developing feather buds.</a> Developmental Biology. 272 (1), 76-88 (2004).</li><li>Smith, E. L., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+take+on+an+old+story:+chick+limb+organ+culture+for+skeletal+niche+development+and+regenerative+medicine+evaluation.">A new take on an old story: chick limb organ culture for skeletal niche development and regenerative medicine evaluation.</a> European Cells &amp; Materials. 26, 91-106 (2013).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Spermatogenesis+in+Explanted+Adult+Mouse+Testis+Tissues.">In Vitro Spermatogenesis in Explanted Adult Mouse Testis Tissues.</a> PLoS One. 10 (6), e0130171 (2015).</li><li>Ochoa-Villarreal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+culture+strategies+for+the+production+of+natural+products.">Plant cell culture strategies for the production of natural products.</a> BMB Reports. 49 (3), 149-158 (2016).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+developmental+biology+of+feather+follicles.">The developmental biology of feather follicles.</a> The International Journal of Developmental Biology. 48, 181-191 (2004).</li><li>Jabalee, J., Hillier, S., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+cellular+dynamics+during+the+development+of+intramembranous+bones:+the+scleral+ossicles.">An investigation of cellular dynamics during the development of intramembranous bones: the scleral ossicles.</a> Journal of Anatomy. 223 (4), 311-320 (2013).</li><li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium.">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental Cell Research. 16 (1), 118-147 (1959).</li><li>Pinto, C. B., Hall, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+understanding+of+the+epithelial+requirement+for+osteogenesis+in+scleral+mesenchyme+of+the+embryonic+chick.">Toward an understanding of the epithelial requirement for osteogenesis in scleral mesenchyme of the embryonic chick.</a> Journal of Experimental Zoology. 259 (1), 92-108 (1991).</li><li>Mbiene, J. P., MacCallum, D. K., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+cultures+of+embryonic+rat+tongue+support+tongue+and+gustatory+papilla+morphogenesis+in+vitro+without+intact+sensory+ganglia.">Organ cultures of embryonic rat tongue support tongue and gustatory papilla morphogenesis in vitro without intact sensory ganglia.</a> Journal of Comparative Neurology. 377 (3), 324-340 (1997).</li><li>Cloney, K., Franz-Odendaal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+ex-ovo+culturing+of+chick+embryos+to+advanced+stages+of+development.">Optimized ex-ovo culturing of chick embryos to advanced stages of development.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52129 (2015).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (8), e306 (2007).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה עושה שימוש רקמת הוקמה culturing הטכניקות להשגת צמיחת יש עין עוף מיום עובריים 8 (HH34) במבחנה 4 ימים. שיטה זו רשת culturing תוארה במקור על ידי Trowell15. אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול מ של פינטו ואולם 1991 המחקר16 ניצול קרום נקבוביים למחצה עם רשת ללמוד אינדוקטיבית אותות בין רקמות מופרדים שכבות של העין עובריים עוף15. באמצעות שיטה זו, מקק תרבותי עוף 14 - בן יום עצם הירך6. שיטה זו גם הוכח כיעיל ב culturing העכבר רקמות6,17. השימוש של נייר הסינון הוא קריטי להצלחת הפרוטוקול כמו זה עוזר הרקמה כדי לקחת את החומרים המזינים של המדיום ביעילות ללא קולח או submersing הרקמה.
מזין בינוני ב- pH נכונה חיוני לצמיחה אופטימלית. המדיום צריך להיות ליד ה-pH פיזיולוגיים, והשימוש של פנול אדום במדיום או כמו מחוון מספק יתרון בכך pH שינויים ניתן להבחין בקלות. ניתן להשתמש במדיית ללא סרום, שינוי התקשורת מדי יום אינה נחוצה, אינה משפיעה על התוצאות. הפרוטוקול פותח בעזרת אמצעי זמין מסחרית (ראה טבלה של חומרים), אשר מכיל רמות גבוהות של חומצות אמינו ו גלוקוז; אין תוספת נוספת של התקשורת דרוש. רוב המופעים של צמיחת רקמת המסכן באמצעות פרוטוקול זה אירעה כאשר התקשורת התזונתי היה גם ב- pH לא תקין או מזוהם.
העין יכולה לשרוד ולצמוח עבור עד 4 ימים במבחנה, החל מ- עובריים יום 8, כאשר הפרוטוקול מבוצע בתנאים מיטביים. מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי השרידות מושפע מעבר 4 ימים culturing. לפיכך, תהליכים פיתוחיים המתפרסים על פני פרק זמן ארוך יותר ידרוש שינויים בפרוטוקול. מגבלה נוספת של הפרוטוקול הוא העדר זרימת הדם פעיל, ו vascularization. כלי דם חשובים עבור תהליכים התפתחותיים רבים, לא רק עבור המשלוח של חומרים מזינים הרקמות9, אשר מושגת נימיות במבחנה באמצעות דרך נייר הסינון שעליו מונח הרקמה.
פרוטוקול זה ניתן ללמוד על התפתחות איברי כולו או חתיכות גדולות של רקמות במבחנה. האיברים חוליות מורכבים מאוד, התפתחותם מוסדר על ידי דפוסים רבים ייתכן ברורים. המחקר של המסלולים הללו התפתחותית מסתמך על היכולת לתפעל את אותות לווסת אותם. שיטות להגביל זו מניפולציה אזורים קטנים יחסית לשפות אחרות, וכדי ריכוזים נמוכים מספיק כדי להימנע lethality עובריים. לדוגמה, ex ovo לשיטת culturing העובר עוף שלם תרבות18 או בשיטת החלון ביצים19 לערוך מניפולציות מוגבלים כי גם העובר כולו יש להתייחס אליו, אשר יכול לגרום קטלני, או בלבד באזור מקומי קטן מטופלת. היתרון של פרוטוקול המוצג כאן הוא ההשפעה של אותות אלה ניתן יהיה ללמוד על כל האיברים או כמויות גדולות של רקמות, מבלי להשפיע על הכדאיות עובריים. פרוטוקול זה אינו דורש כל תוספי עם פחמן דו חמצני, כמו פרוטוקולים קודמת15. העיכוב בהתפתחות שהבחנו הוא יתרון בכך שניתן יהיה לחקור תהליכים פיתוחיים מהירה.

העוף עובריים (גאלוס גאלוס) הוא אורגניזם מודל מצוין נפוץ בתחום הביולוגיה. תקופת הדגירה שלו הוא בערך 21 ימים, ביצים רבות יכול להיות מודגרות בו זמנית, ביצוע ניסויים מהיר ויעיל. ואולי הכי חשוב, העובר בקלות גם מטופל, המאפשרים לימוד מקיף של תהליכים התפתחותיים המפתח, של גנים, חלבונים כי הכונן תהליכים אלה.
עין עוף עובריים היא איבר מורכב אשר מפתחת דרך האינטראקציה של מספר ברקמות שונות דומה מערכות גוף רבות אחרות. שיטה זו מאפשרת למידת ההתפתחות של רקמות אלה, במיוחד בשלבים מתקדמים של פיתוח. לדוגמה, ייתכן הרשתית רב שכבתית עניין מיוחד הלומדים הפיתוח של מערכת העצבים. שיטות אלטרנטיביות שמאפשרות המחקר של רקמות העין אחרות כגון הקרנית, הגוף vitreal, העדשה, את sclera העפעפיים הם להועיל לחוקרים. העין עובריים עוף מכיל גם סדרה של עצמות שטוחות, עצמות השמע scleral, אשר יכול לשמש כמודל לחקר של עצם intramembranous אינדוקציה, התקשות חולייתנים1.
כיום, ישנן מספר שיטות חקר התפתחות. Microinjections של נוגדנים מעכבות או אחרים מולקולות מעכבות2,3, שהושתל. גרגרי טבולים מעכב4, אלקטרופורציה5 הם כל השיטות יכול לשמש downregulate גנים או חלבונים עניין בהעובר. שיטות דומות משמשות upregulate חלבונים. שיטות אלה אינן ללא המגבלות שלהם. לדוגמה, בעת שימוש בכימיקלים כדי לשנות את ההתפתחות, הערכת ההשפעות קטלני על העובר, זה מגביל את השימוש השיטות דלעיל לאתרים לשפות אחרות של יישום במינונים נמוכים מספיק כדי להבטיח את השרידות של . אני אדם מסוכן
במבחנה culturing רקמות שימש במגוון רחב של אורגניזמים ללמוד פיתוח, יכול לשמש כדי לעקוף חלק מהמגבלות הנ. לדוגמה, femora6, נוצה ניצנים7,8ו הגפיים9 של העוף כל נחקרו באמצעות רקמות culturing שיטות, כמו שיש את האשכים של העכבר10 ושורשים והגבעולים של צמחים11. שיטות אלה מעניקים מדענים רמה גבוהה של שליטה על הפיתוח רקמות, כגון היכולת להשתנות הטמפרטורה ולשנות את זמינות חומרי הזנה. בידודו של הרקמה של העובר כל גם עושה את זה הרבה פחות רגישים להשפעות קטלני של כימיקלים, ובכך מאפשר מניפולציה מחקרים בקנה מידה עולמי בריכוזים גבוהים. יתרון בולט נוסף של במבחנה culturing הוא שימור הסביבה התאית של הרקמה; הסידור של רקמות נותר כמעט ללא שינוי, כך שניתן ללמוד את האינטראקציות בין סוגי רקמות שונות9. לפיכך, במבחנה culturing פותח דלתות נוספות ניסיוני גישות שאינן זמינות במודלים vivo או בכל ovo .
כיום, ללמוד על התפתחות העין עוף עובריים שימוש בכימיקלים הוא מאתגר במיוחד. מספר של ממברנות extraembryonic לכסות את העובר, ולכן קשה ליישם את גרגרי או כימיקלים; העובר הוא מאוד פעיל בתוך הביצה גם כאשר הוא מזדקן, שמסבך עוד יותר את שיטת כבר קשה. פרוטוקול זה מאפשר גישה נוחה לעין, הרקמות הסובבות שלו, ביטול מחסומים אלה, גם בעת מתן הזדמנויות חדשות לבחון תהליכים התפתחותיים בתוך העין. פרוטוקול זה הוקם כדי ללמוד את תנאי הגיוס של עצמות השמע scleral בתוך העין עובריים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1081px;" width="1082">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm cell culture petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353001</td>
			<td style="width:676px;">easy grip tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">100 mm cell culture petri dishes</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td>tissue culture dish, polystyrene, non-pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paper tissue</td>
			<td style="width:71px;">Kimtech</td>
			<td style="width:119px;">34155</td>
			<td>Kimtech Science Brand Task Wipers, 280 per carton</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">wire mesh</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>stainless steel wire mesh (grid size 0.7 mm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">disposable glass pipettes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">14673-010</td>
			<td>Borosilicate glass disposable 5 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">nutrient medium</td>
			<td style="width:71px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12591-038</td>
			<td>Fitton-Jackson Modification, [+] L-glutamine with phenol red (BGJB)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4458</td>
			<td>10000 units/mL penicillin streptomycin solution stabilised</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:119px;">1454 090</td>
			<td>semi-porous filter paper 90mm</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">fertilized chicken eggs</td>
			<td style="width:71px;">Dalhousie University Agricultural College</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>can be obtained from local farms</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:71px;">EMD</td>
			<td style="width:119px;">SX0420-3</td>
			<td>sodium chloride crystals, reagent grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">1 L glass bottle</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89000-240</td>
			<td>1 L pyrex autoclavable glass bottle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ethanol</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td>BP82011</td>
			<td>70% molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tupperware containers</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought and sterilized with EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">disposable razor blades</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">55411-050</td>
			<td>single edge industrial razor blades (surgical carbon steel)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic spoons</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought and sterilized with EtOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dust mask</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>3M 8500 Comfort Mask</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>paraformaldehyde, reagent grade, crystalline</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">neutral-buffered formalin</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">72210</td>
			<td>10% neutral buffered formalin</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>10X phosphate buffered saline pH 7.4 (137mM NaCl, 2.5mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.4mM KH2PO4)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">15 ml falcon tubes</td>
			<td style="width:71px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">21008-216</td>
			<td>presterilized centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">forceps</td>
			<td style="width:71px;">FST</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>fine forceps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">chick saline&#160;</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a&#160;</td>
			<td>0.85% NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">tinfoil</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">paper towel</td>
			<td style="width:71px;">n/a</td>
			<td style="width:119px;">n/a</td>
			<td>store-bought</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

organotypic culture method to study the development of embryonic chicken tissues

העוף עובריים הוא נפוץ כאורגניזם מודל אמין לפיתוח חוליות. הנגישות שלה, דגירה קצרה תקופה הופך אותו לאידיאלי עבור ניסויים. כיום, המחקר של המסלולים הללו התפתחותית של העובר עוף מבוצע על-ידי החלת מעכבי וסמים באתרים המותאמות לשפות אחרות, בריכוזים נמוכים, תוך שימוש במגוון שיטות. במבחנה culturing רקמות היא טכניקה המאפשרת המחקר של רקמות הופרדו האורגניזם המארח, בזמן בו זמנית תוך עקיפת רבים של המגבלות הפיזיות נוכח בעת עבודה עם כל העוברים, כגון הרגישות של העוברים על מינונים גבוהים של כימיקלים קטלני. כאן, אנו מציגים את organotypic culturing פרוטוקול culturing את העוף מתחלקים חצי ראש במבחנה, המציג הזדמנויות חדשות עבור בחינת תהליכים פיתוחיים מעבר השיטות כיום הוקמה.

באמצעות שיטה זו, עין עוף עובריים יכולים להיות מחונן יום 8 של התפתחותו (HH34) במבחנה 4 ימים ארבעה ימים של ovo פיתוח מקביל HH38.
שיטה זו culturing תומך בפיתוח של נוצה ניצנים סביב העין, על העפעפיים (איור 1B). אלה ניצנים נוצה אינם נוכחים ב ovo -HH34 לפני culturing (איור 1 א'), המציין כי פיתוח באד נוצה מאותחלת במהלך תקופת culturing, כפי שהוא ב ovo13 (איור 1C). העפעפיים ואת קרום nictitating לגדול כדי לכסות את העין במהלך culturing (איור 1B). העפעפיים מופיעות יותר בוגרת לאחר במבחנה culturing מאשר בתחילת culturing ב HH34 (איור 1 א') אבל הם פחות מפותחת יותר ב- HH38 (איור 1C). נתונים אלה מראה כי היבטים מרכזיים של התפתחות נתמכים, אמנם עם עיכוב קטן.
לאחר culturing, ניתחנו את החלק הקדמי של העין כדי להראות את conjunctival ואדומות סטיגמטה והיו שלמים (טבעת ארעית של בליטות אפיתל 13-14), אשר פועלים כמו עוד ציון דרך המציין כי האירועים התפתחותית נתמכים בתרבות. בדרך כלל, אלה ואדומות סטיגמטה והיו שלמים נוצרות באופן מלא על-ידי HH34 (איור 1D), ומנוון לאורך זמן גם הם לגרום skeletogenic condensations ב מזנכימה כבסיס; הם נעלמים HH381 (איור 1F). הנתונים מראים כי להידרדרות מתרחשת במבחנה (איור 1E) לפניו שיטוח של ואדומות סטיגמטה והיו שלמים בעקבות התבנית של ovo של פיתוח. מוכתם condensations, לעומת זאת, אינם גלויים הדגימות במבחנה , שלא כמו ב HH38 (איור 1F). השתמשנו אלקליין פוספטאז מכתים, אשר מזהה פעילות אוסטאובלסט מוקדם להעריך עוד יותר את תנאי הגיוס של אלה condensations14; תהליך זה מתרחש לצד התנוונות ה conjunctival ואדומות סטיגמטה והיו שלמים ב ovo. אינדוקציה של condensations skeletogenic, אשר מתחילה ב- HH34 (איור 1 ג'י), המשך במבחנה , כפי שמעידים על phosphatase אלקליין מכתים (איור 1 H). אלה condensations, עם זאת, לא כמו גדולים כפי שהם HH3814 (איור 1I), שוב המציין כי יש עיכוב קטן בפיתוח. אנו מעריכים כי ימי 4 culturing ייצגו כ יומיים של התפתחות עובריים; ומכאן עיכוב של-50%. באופן קולקטיבי, תוצאות אלו מראות כי אינדוקציה של התפתחות של עצמות intramembranous, condensations scleral, היא נתמכת במבחנה והמשך כי תהליכים התפתחותיים כגון היווצרות ניצן נוצה וצמיחה של העפעף ב חוץ גופית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57619/57619fig1.jpg"> איור 1 . מאפיינים מורפולוגיים של במבחנה תרבותי עיניים, HH34 העיניים, והעיניים HH38. A - F הן מוכתם ו- G - אני מוכתמים עבור האנזים אלקליין פוספטאז (AP) להבחין בין תאי העצם פעיל בתוך condensations scleral. A, D, ו- G העיניים הצג בתחילת התקופה culturing ב HH34. B, Eו- H הצג את העיניים לאחר 4 ימים במבחנה culturing. C, F, ואני להראות את העיניים לאחר 4 ימים של ovo culturing, ב- HH38. כל העיניים נצפים רוחבית. (א) conjunctival ואדומות סטיגמטה והיו שלמים גלויים טבעת סביב הקרנית. כוכבית מציינת papilla #12, הטופס הראשון. החץ מצביע על הקצה של העפעף באזור האף של העין. (B) conjunctival ואדומות סטיגמטה והיו שלמים שיטוח, החלו להידרדר. החץ מצביע על ניצן נוצה הולך וגדל. (C) conjunctival ואדומות סטיגמטה והיו שלמים לחלוטין התדרדרו, מכוסים על ידי העפעפיים ואת קרום nictitating. החץ פתוח מציין את הקצה של העפעף באזור האף של העין. החץ מוצק מציין ניצן נוצה הולך וגדל. (ד) A ביתור החלק הקדמי של העין HH34. הכוכבית מציינת papilla #12. (E) A גזור בחלק הקדמי של HH34 + 4 במבחנה העין מציג ואדומות סטיגמטה והיו שלמים שעברו שיטוח. ואדומות סטיגמטה והיו שלמים באזור הטמפורלי (חץ מוצק) החלו להידרדר; אלה ואדומות סטיגמטה והיו שלמים העתיק ביותר בזירה. (F) של החלק הקדמי ביתור של עין HH38 עם העפעפיים, nictitating ממברנות הוסר, מראה כי כל ואדומות סטיגמטה והיו שלמים התדרדרו. קווים מקווקווים המתאר את המיקום של שני סמוכים condensations וללא רבב. (G) A HH34 העין מוכתם AP מציג skeletogenic קטן מאוד condensations מעידה על ההתחלה של אינדוקציה. (ח) A HH34 + 4 עיניים מוכתם עבור AP מציג מוגדלים, גדל skeletogenic condensations. (אני) A HH38 העין מוכתם AP מציג skeletogenic גדול condensations. כל סולם ברים הם 1 מ מ. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57619/57619fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues at JoVE.com

Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

שיטת Organotypic תרבות ללמוד על התפתחות עובריים עוף רקמות

כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

The embryonic chicken is commonly used as a reliable model organism for vertebrate development. Its accessibility and short incubation period makes it ...

organotypic-culture-method-to-study-development-embryonic-chicken

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Views.  Mount Saint Vincent University. כאן, אנו מציגים organotypic culturing פרוטוקול לגדול עוף עובריים באיברים במבחנה. באמצעות שיטה זו, התפתחות עובריים עוף רקמות ניתן יהיה ללמוד, תוך שמירה על רמה גבוהה של שליטה על הסביבה תרבות.

Video: Organotypic Culture Method to Study the Development Of Embryonic Chicken Tissues

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

תרבות של עוברי Explants שבלול העכבר וג&#39;ין העברה על ידי Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during oogenesis. In order to study roles of such maternal factors in early embryonic development, it is desirable to manipulate their functions from the very beginning of embryonic development. Conventional ways of gene interference are achieved by injection of antisense oligonucleotides (oligos) or mRNA into fertilized eggs, enabling under- or over-expression of specific proteins, respectively. However, these methods normally require more than several hours until protein expression is affected, and, hence, the interference of gene functions is not effective during early embryonic stages. Here, we introduce an experimental system in which expression levels of maternal proteins can be altered before fertilization. Xenopus laevis oocytes obtained from ovaries are defolliculated by incubating with enzymes. Antisense oligos or mRNAs are injected into defolliculated oocytes at the germinal vesicle (GV) stage. These oocytes are in vitro matured to eggs at the metaphase II (MII) stage, followed by intracytoplasmic sperm injection (ICSI). By this way, up to 10% of ICSI embryos can reach the swimming tadpole stage, thus allowing functional tests of specific gene knockdown or overexpression. This approach can be a useful way to study roles of maternally stored factors in early embryonic development.

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

We describe methods of manipulating Xenopus laevis immature oocytes, in vitro maturation of oocytes to eggs, and intracytoplasmic sperm injection. This protocol allows degradation of some maternal proteins and overexpression of genes of interest at fertilization, and hence is valuable to study roles of specific factors in early embryonic development.

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo development due to their similar developmental process. Although genetic factors are known to affect early embryonic development, the discovery of such factors has been a serious challenge. Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. One of the main decisions that have to be made when planning a microarray experiment is whether to use a one- or two-color approach. Two-color design increases technical replication, minimizes variability, improves sensitivity and accuracy as well as allows having loop designs, defining the common reference samples. Although microarray is a powerful biological tool, there are potential pitfalls that can attenuate its power. Hence, in this technical paper we demonstrate an optimized protocol for RNA extraction, amplification, labeling, hybridization of the labeled amplified RNA to the array, array scanning and data analysis using the two-color analysis strategy.

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Microarray technology allows quantitative measurement and gene expression profiling of transcripts on a genome-wide basis. Therefore, this protocol provides an optimized technical procedure in a two-color custom made bovine array using Day 7 bovine embryos to demonstrate the feasibility of using low amount of total RNA.

Transcriptome Profiling של<em&gt; In-Vivo</em&gt; עוברי אדם שור הופק באמצעות פלטפורמת microarray שני צבעים

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Epigenetic Regulation of Cardiac Differentiation of Embryonic Stem Cells and Tissues

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated by transcription factors which bind genomic regulatory regions including enhancers and promoters of cardiac constitutive genes. DNA is wrapped around histones that are subjected to chemical modifications. Modifications of histones further lead to repressed, activated or poised gene transcription, thus bringing another level of fine tuning regulation of gene transcription. Embryonic Stem cells (ES cells) recapitulate within embryoid bodies (i.e., cell aggregates) or in 2D culture the early steps of cardiac development. They provide in principle enough material for chromatin immunoprecipitation (ChIP), a technology broadly used to identify gene regulatory regions. Furthermore, human ES cells represent a human cell model of cardiogenesis. At later stages of development, mouse embryonic tissues allow for investigating specific epigenetic landscapes required for determination of cell identity. Herein, we describe protocols of ChIP, sequential ChIP followed by PCR or ChIP-sequencing using ES cells, embryoid bodies and cardiac specific embryonic regions. These protocols allow to investigating the epigenetic regulation of cardiac gene transcription.

A fine tuning regulation of gene transcription underlies embryonic cell fate decision. Herein, we describe chromatin immunoprecipitation assays used to investigate epigenetic regulation of both cardiac differentiation of stem cells and cardiac development of mouse embryos.

תקנה אפיגנטיים של לב בידול בתאי גזע עובריים ורקמות

Specific gene transcription is a key biological process that underlies cell fate decision during embryonic development. The biological process is mediated ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

רומן<em&gt; אקס אובו</em&gt; טכניקת פסים לאלטר ופרמטרים המודינמיים intracardiac במערכת עוף עוברי

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

תרבות של Murine העוברי metatarsals: מודל פיסיולוגי של Endochondral התאבנות

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Isolation of Embryonic Tissues and Formation of Quail-Chicken Chimeric Organs Using The Thymus Example

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed contributions to unveiling key processes in developmental biology.
Herein is described an optimized method to isolate embryonic tissues from quail and chickens by microsurgery and enzymatic digestion while preserving its biological properties. After isolation, tissues from both species are associated in an in vitro organotypic assay for 48 h. Quail and chicken tissues can be discriminated by distinct nuclear features and molecular markers allowing the study of the cellular cross-talk between heterospecific association of tissues. This approach is, therefore, a useful tool for studying complex tissue interactions in developmental processes with highly dynamic spatial modifications, such as those occurring during pharyngeal morphogenesis and the formation of the foregut endoderm-derived organs. This experimental approach was first developed to study the epithelial-mesenchymal interactions during early-stages of thymus formation. In this, the endoderm-derived prospective thymic rudiment and mesoderm-derived mesenchyme, were isolated from quail and chicken embryos, respectively.
The capacity of the associated tissues to generate organs can be further tested by grafting them onto the chorioallantoic membrane (CAM) of a chicken embryo. The CAM provides nutrients and allows gas exchanges to the explanted tissues. After 10 days of in ovo development, the chimeric organs can be analyzed in the harvested explants by conventional morphological methods. This procedure also allows studying tissue-specific contributions during organ formation, from its initial development (in vitro development) to the final stages of organogenesis (in ovo development).
Finally, the improved isolation method also provides three-dimensionally (3D) preserved embryonic tissues, that can also be used for high-resolution topographical analysis of tissue-specific gene-expression patterns.

This article provides a method to isolate pure embryonic tissues from quail and chicken embryos that can be combined to form ex vivo chimeric organs.

בידוד של רקמות עובריים ועל היווצרות האיברים Chimeric שליו-עוף לפי הדוגמה בלוטת התימוס

The capacity to isolate embryonic tissues was an essential step for establishing the quail-chicken chimera system, which in turn has provided undisputed ...

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.