עבודה זו נתמכה על ידי הפעלה מענקי הקרן סבוי, קרן אפילפסיה התרופה, באמצעות ציוד מענקים מקרן הקנדית לחדשנות כשלקחו (מיקרוסקופ קונפוקלי), G.H (ספינינג דיסק מיקרוסקופ קונפוקלי). בחדר המיון מקבל פרס על הקריירה של Fonds דה קוויבק du רשרש-Santé (FRQ-S; פרס Clinician-scientist) כמו גם כמו מן המוסדות הקנדי למחקר בריאות (CIHR; פרס החוקר הצעיר). ג. ה הוא חוקר בכיר FRQ-S. עם זיגוג היא זוכת הפרס הכשרה פוסט-דוקטורט Steriade-סבוי מטעם קרן סבוי, בפרס הכשרה פוסט-דוקטורט צ'ו Sainte-ז'וסטין קרן ופרס הכשרה פוסט-דוקטורט FRQ-S, בשותפות עם קרן של כוכבים. פרויקט זה כבר מתאפשרת על ידי המוח קנדה באמצעות קרן מחקר המוח. קנדה, באמצעות סיוע כספי של הבריאות בקנדה, מוענק זה

המחברים אין לחשוף. הדיעות בזאת ואינן מייצגות בהכרח את נופי שר הבריאות או בית הממשלה של קנדה.

במאמר זה, אנו מספקים שיטה אמינה עבור ביצוע לשעבר עם רחם אלקטרופורציה של העכבר MGE-e13.5, הדור של תרבויות organotypic של פרוסות המוח העוברי. למרות שיטות במבחנה , כמו וזמינותו קאמרית בוידן, שקל יחסית לבצע והוא יכול לשמש כדי להעריך תפקידים ספציפיים של גנים שונים, חלבונים ללא ההפרעה של גורמים אחרים, הם למנוע החקירה של דינמיקה ההעברה ביחס נתיב כיוון והעברה25. MGE explants לספק אמצעי שימושי כדי ללמוד את השינויים cytoskeletal הדינמיים המתרחשים במהלך ההעברה, כפי שנראה כאן, אבל הם ללא רמזים אנדוגני ביותר ולעיתים קרובות דורשים התוספת של הדרכה רמזים כדי לקדם הגירה העצבית (למרות שזה לשפר באופן משמעותי כאשר MGE explants מתורבתים בשכבות מזין קורטיקליים)25,54. בכל זאת, מבחני בהתבסס על MGE explants עלול להיכשל לזהות במשמעויות של מעורב מנגנונים עדינים יותר כמו אלה המנחה נתיב כיוון או העברה של תוספות29מולקולרית רמזים. בעיה זו היה מצויין בסופו של דבר בתוך הרחם אלקטרופורציה25, מה שמאפשר עבור תיוג ספציפית של MGE, נגזר In העברת שלהם לסביבתם הטבעית13,29,41. עם זאת, בטכניקה זו היא מיומנות-מאתגר, עקב הניתוחים מעורב, התשואה שלה מוגבל על ידי שיעור הישרדות נמוכה של העוברים ואת העובדה כי MGE קשה המטרה בתוך הרחם, לעתים קרובות הדורשות שימוש המלטות מרובות כדי להגיע משמעות55. לפיכך, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה של MGE ואחריו organotypic תרבות של עכברים מוח עוברי מספק שיטה בעלות נמוכה, היעילה ואמין עבור חוקרים את הדינמיקה ההעברה, המורפולוגיה של תוספות נגזר MGE הטבעי איכות הסביבה, תוך עקיפת הניתוחים בתוך הרחם אלקטרופורציה והצורך הדרכה רמזים ב- MGE explants. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת גישה קלה יותר MGE, אשר ניתן לפלח מאת ישירות apposing את האלקטרודה החיובית תחת בצוואר ואחד שלילי על הראש, תצורה קשה יותר לאמץ בתוך הרחם. לחלופין, יכול להיות מוזרק focally MGE ואת electroporated ישירות לאחר יצירת organotypic פרוסות13,25,29, אך הטכניקה הזאת הוכיחה קשה יותר ויעיל פחות בידיים שלנו מאשר הפרוטוקול המתואר כאן. על-ידי ביצוע השלבים המתוארים במאמר זה, אחד יהיה להשיג 50-100 electroporated MGE, נגזר תוספות לחתיכה organotypic, 5-20 אשר ניתן לראות מעבר tangentially החוצה MGE לאחר 72 ה' Transfected הארצי להיות visualized חי עם הדמיה בצילום מואץ או הדמיה, שוחזר לאחר קיבוע, תיוג immunohistochemical.
הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם ללמוד ההעברה ex-vivo , בהשראת תקנות שפורסמו שונות המתארות אלקטרופורציה בתוך הרחם של תוספות נגזר MGE, שמחוץ MGE הזרקת אלקטרופורציה, או דור של organotypic כרונית במוח פרוסה תרבויות36,38,39,42,43,56,57,58. הגישה שלנו מגביל אפשרות של נזק MGE אבות באמצעות עוצמת הדופק נמוך יותר (40 V) ועל זריקות פלסמיד ע ולא אינטרה MGE זריקות עם פולסים מתח גבוה (100 וולט), כמתואר39,56 57, ,58. יתר על כן, בעוד אחרים להשתמש בשילוב של פניצילין, סטרפטומיצין gentamycin כדי למנוע זיהום חיידקי39,56,57,58, אנחנו שבחרו להימנע אנטיביוטיקה ב תרבות המדיום שלנו, מאחר שהם יכולים להשפיע באופן תיאורטי בהעברה. בפרט, פניצילין הוא אנטגוניסט של59,קולטן GABAA 60, וכן הפעלת קולטן GABAA מפעילה ומפסיקה מאוחר יותר בהעברה בהתאם כלוריד תאיים מעברי צבע KCC2 ביטוי בשלבים שונים של הגירה61. עם זאת, שימוש באמצעי הזהירות שונים כאמור בפרוטוקול הנוכחי, זיהום יכול ביעילות להימנע גם בהיעדר של אנטיביוטיקה.
למרות היעילות של גישה זו בידיים שלנו, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה יש גם החסרונות. בזמן מתן סביבה תלת-ממדי טבעי עבור תאים כדי להעביר, זה יכול להיות קשה לבצע מבחני תרופתי בפרוסות organotypic בהקשר של העברה. אכן, ההעברה של In MGE, נגזר בעיקר תלוי רמזים חוץ-תאית2,13,19 והיישום של מעכבי תרופתי או מפעילים על פרוסות organotypic אינו מאפשר את מדויק דיסוציאציה של תופעות אוטונומיות תא מתופעות גלובלית על הבריאות הכללית פרוסה או פעילות. לניסויים כאלה, explants MGE גדל על תאים קורטיקליים הפומבית מעורבת, עדיף לתרבויות פרוסה organotypic, מאז נודדות החוצה explant יכול להיות בקלות רבה יותר מבודדים והתבניות חשופים באופן סלקטיבי תרכובות ייעודיות62. יתר על כן, למרות לשעבר עם רחם אלקטרופורציה היא קלה יותר לביצוע מאשר אלקטרופורציה בתוך הרחם , הוא עדיין יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית בכל הדורות עובריים מאויר כאן בהתחשב השברירי מתחלקים מוח- וגודל קטן e13.5. החוקרים יהיה עליך מספר נסיונות ביעילות לחלץ את המוח electroporated-e13.5 מבלי להזיק את פני השטח של המוח. בנוסף, בניגוד פרוסות כמחנכת, פרוסות organotypic עובריים לא יכולים להישמר בתרבות במשך פרקי זמן ארוכים. למרות organotypic עובריים פרוסה תרבויות יכול להישמר לפחות 7 ימים במבחנה63, זה לא היה בשילוב עם אלקטרופורציה ויש הניסויים המתוארים כאן בדקו עד 3 ימים במבחנה עם תוצאות אמינות בידיים שלנו. לכן, החוקרים צריך לבצע בדיקות אופטימיזציה מראש אם פעמים דגירה ארוך יותר יש צורך. עוד, החקירה של פיתוח מאוחר שלבי כמחנכת עובריים או מוקדם לא מומלץ עם טכניקה זו בעת שימוש e13.5 עוברי25, אבל ניתן להשיג עם אלקטרופורציה בתוך הרחם , איפה בהצלחה electroporated עוברי מוכנסים חזרה לתוך חלל הרחם, ניתן יהיה להשאיר כדי להיות נולד וניתח -שלבים מאוחר יותר21,64. לבסוף, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה ואחריו organotypic פרוסה תרבויות מאפשר הניתוח של שני המורפולוגיה הדינמיקות ההעברה של תוספות המתפתח. אולם, כפי זה היה בעבר ציין בתוך הרחם אלקטרופורציה הטכניקה36, electroporations לשעבר עם רחם תשואות 50-100 electoporated תאי המוח פרוסה, ולכן אינם מתאימים לניתוח האוכלוסייה. בחקירות אלה מתנהלים יותר במודלים של בעלי חיים נושא מלא או מותנה מחיקה (או טוק-in) של הגן עניין. כשהם זמינים, מודלים כאלה ואז ניתן להשתמש ביעילות כדי ליצור תרבויות פרוסה organotypic או MGE explants כדי להמחיש את הדינמיקה בפועל בהעברה, כפי שמתואר כאן (ראה איור 5 , איור 6).
שלבים רבים של פרוטוקול זה צריך להתבצע בזהירות כדי להשיג תוצאות אופטימליות. למשל, זה הקדמונים בכל הצעדים מבוצעים בתנאים סטריליים מחמירים כמו זיהום יכול להתרחש בקלות. כפפות, מכשירים נעשה בו שימוש מחוץ אבטחה הקבינט צריך ריסוס עם 70% אתנול לעתים קרובות במהלך ההליך כולו. בנוסף, פתרונות כמו נוזל מוחי שדרתי מלאכותי ומדיה תרבות צריך להישמר סטרילי קר (4 ° C) ו תוצרת טרייה כל 2-3 שבועות. להוספת תווית הארצי MGE, נגזר באופן ספציפי יותר, פלסמידים שישמש בניסויים כאלה צריך להיות משובטת תחת השליטה של יזם ספציפי IN (לשעבר: Dlx5/649, Lhx665), במקום פשוט להסתמך על אנטומי הפגיעה המכוונת MGE. הדור של פרוסות organotypic דורש את המוח כדי להישאר בחיים. לפיכך, כדי לשמר בריאות והישרדות, הניסוי הזה וצריך להתנהל בתוך פחות מ- 3 שעות מרגע העוברים מאוחזרות עד שמים את פרוסות organotypic תרבות. במשך הזמן-יעילות, תרבות צלחות יכול להיות מראש מלא תוצרת בית תרבות בינוני רק לפני תחילת הניסוי ולשים בחממה תרבות תא 37 ° C עד השימוש. יתר על כן, המוח צריך בזהירות ניסויים מתוך הגולגולת ללא נזק למשטח בקליפת המוח על מנת להשיג הטמעה נכונה פתרון agarose, vibratome-חלוקתה עוקבות. למשל, ופגיעה קורטיקלית, אפילו מינימלית, עלולה לגרום להתנתקות הסעיפים מיקרומטר בעובי 250 מ הג'ל agarose שמסביב או השפלה של הסעיפים במהלך vibratome חלוקתה. להישרדות עצביים, חשוב גם כי הטמפרטורה הפתרון agarose נשאר קרוב 42 ° C, כמו טמפרטורות גבוהות יותר להוביל למוות רקמת נזק ותא, ואילו טמפרטורות נמוכות יימנע את ההטמעה תקין של המוח (או נזק זה במהלך הטמעת תהליך). פעם בתרבות, להימנע מקורות זיהום אחרים, הפרוסות כדאי לא להיות מניפולציות עד שהם מועברים המיקרוסקופ עבור הדמיה. שלבים אלה צריך להתבצע בסביבה מעוקר, בהתחשבות לא כדי לזהם את הצלחות לאחר מטיפולים אלה, במיוחד אם הם חייבים להחזירה בתרבות הדמיה מחדש לאחר מכן. לבסוף, אנו לא ממליצים מחלים aliquot DNA מעורבב עם טעינת צבען של ניסויים קודמים לשימוש עתידי כמו ראינו ירידה ניכרת בתפוקה של נוירונים electroporated עם חומר כזה.
לסיכום, לשעבר עם רחם אלקטרופורציה ו organotypic פרוסה תרבות הפרוטוקול המתואר לעיל מאפשר תיוג ספציפית של MGE, נגזר In ברמת תא בודד והוא יכול לשמש לתמרן גנטית ספציפית מסלולים מולקולריים כדי המחקר שלהם תפקיד בוויסות שינויים מורפולוגיים של ההעברה הדינמיקה של תוספות tangentially נודדים. שיטה זו מאפשרת לחקירה מהירה, בעלות נמוכה מוקדם תפקודית של המועמד הרומן גנים זיהו דרך רצף RNA לתא בודד של תוספות נודדות66,67 או רצף הדור הבא של חולים עם התפתחותיות והפרעות68,69,70. טכניקה זו שימש בהרחבה ללמוד נדידת אוכלוסיות תאים אחרים, כולל תאים כפירמידה ואת קליפת ההיפוקמפוס70,71,72,73. לאחר mastered, זה יכול באופן פוטנציאלי לשמש תמונה מיחזור וסחר של קרום חלבונים, כגון קולטנים וערוצי באמצעות מתויג GFP חלבונים; הפעלת באיתות מסוים מפלי באמצעות ביולוגיים74; . או אפילו את הפיקוח ואת מניפולציה של פעילות תאית באמצעות הדמיית סידן מצמידים optogenetics קורטיקלית הארצי, אלא גם באזורים אחרים במוח, כגון ההיפוקמפוס, האמיגדלה או אפילו את סטריאטום

GABAergic קורטיקלית interneurons (INs) מגוונים לגבי תכונותיהם הביוכימי, מאפיינים פיזיולוגיים וקישוריות, ולסיים הם פונקציות שונות רשתות בוגר1,2,3 ,4,5. המפרט של תתי סוגים שונים של תוספות קורטיקלית מוסדר בחוזקה דרך מפלי גנטי כי כבר למדה בהרחבה1,2. הרוב (70%) של תוספות GABAergic קורטיקלית מקורן אבות ב המדיאלי ganglionic קדושתו (MGE), מבנה עובריים ממוקם ventrally, ו עליך להעביר על פני מרחקים ארוכים יחסית כדי להגיע את צלחת קורטיקלית1, 2 , 6. בזמן תאים קורטיקליים כפירמידה להעביר בצורה רדיאלית מאזור חדרית (VZ) לצלחת קורטיקלית לאורך לגרדום עכשיו רדיאלי, דונלד, ההעברה וקולו של תוספות, אשר לא צורפו כזה גרדום, דורש מגוון מהותי ו הסימנים החיצוניים כדי למשוך נוירונים נודדים כלפי הלוח בקליפת המוח, בזמן מנחה אותם הרחק מבני קורטיקלית-2,-7,-8. לאחר היציאה מחזור התא, תוספות הם שמופץ מ MGE על-ידי רמזים כימותרפיה-דוחה הביע בתוך VZ של MGE, אשר מפעיל העברה משיק לקראת9,קורטיקלית צלחת10. העברת תוספות למנוע את סטריאטום בעזרת רמזים שונים דוחה11 והם, כשמגיעים לצלחת קורטיקלית, להחליף בין וקולו מצב ההעברה רדיאלי להגיע אל המיקום למינריות הסופי שלהם, חלקית בתגובה רמזים של פירמידה תאים12 ו אחרים אוכלוסיות הסלולרית13. ההעברה של In, עבור אוכלוסיות עצביים אחרים, כרוך שינויים מורפולוגיים דינמיים שונים להתיר תנועת בפועל של הנוירון. ומכניקה עצביים כביכול זו מאופיינת מחזורים חוזרות של שלושה שלבים רצופים: התארכות של תהליך מוביל, של תנועה anterograde פעיל של הגרעין (nucleokinesis), משיכת תהליך נגרר14. בהעברה מוסדר על ידי רמזים רבים פנימי ולא חיצוני להסיע את מסעף ו שיפוץ פעיל של התהליך מוביל להנחות הארצי בכיוון הנכון, קביעת כיוון ומהירות ההעברה14,15 ,16.
גורמים ויסות קורטיקלית בהעברה נחקרו בהרחבה בשנים האחרונות1,2,7,17,18,19,20, יש כבר שמהווה שיבוש בחלק מן השחקנים מולקולרית להוביל להפרעות התפתחותיות, כגון רפואת ילדים עקשן אפילפסיה או אוטיזם ספקטרום הפרעות1,2,21, 22 , 23 , 24. לפיכך, הפיתוח של גישות שונות במבחנה , ויוו יש כנראה תפס לקדם בצורה משמעותית את היכולת שלנו ללמוד תהליך דינמי זה, כפי שנבדקו בעבר25. במבחנה שיטות, כולל וזמינותו קאמרית בוידן, פס בחירה וזמינותו, לספק את האמצעים והמהירה ביותר לשחזור להעריך את הדרישה וההשפעה התא האוטונומי של גנים ספציפיים או חלבונים במהלך ההעברה עצביים, ללא השפעת גורמים אחרים25. אלה מבחני שימושיות במיוחד בשילוב עם הדמיה live8,26,27. עם שיטות אלה, הן בקלות שאוחזר מ- e13.5 MGE והתבניות מבודדת על ידי דיסוציאציה אנזימטי ועל מכניים, אחרי אשר איתות המסלולים שונה, הדרכה רמזים יכול ייחקרו, כמופיע בעבר8,28 . עם זאת, אלה מבחני לקחת את המקום מטריצה חוץ-תאית מלאכותי בהיעדרו של רקמות תלת מימדי אדריכלות, אשר עשוי לשנות מאפייני התנהגות של תאים עצביים, פוטנציאל להשפיע תא העברה ו/או הישרדות25. כדי לעקוף את מגבלות אלה, פותחו vivo לשעבר MGE explants ככלי חלופי כדי לכמת את השינויים מורפולוגי דינמיים המתרחשים במהלך ההעברה יחד עם פרמטרים כגון מהירות וכיוון14, 29. MGE explants הוא יחסית פשוט ושוויונית כבר בהרחבה תיאר במקום30. היא מצריכה את ציפוי של תמצית קטנה של MGE על טפט של תאים קורטיקליים מעורבת, או בתערובת של matrigel וקולגן בנוכחות רמזים מושך או דוחה25, למרות האחרונים הם אופציונליים31. MGE explants לאפשר רזולוציה גבוהה הדמיה של תאים עם תוויות בדלילות, לפשט את המחקר של תהליכים תאיים, כגון שיפוץ cytoskeletal בתהליך המוביל הסתעפות, כפי שמוצג בעבר32,33 ,34 , במחקר הנוכחי. MGE explants שימשו בהצלחה כדי להעריך שינויים cytoskeletal דינמי במהלך ההעברה בסביבה דו-מימדית, למשל לאחר ספציפי מניפולציות תרופתי או chemotactic (ראה, לדוגמה, Tielens. ואח 201633) . אולם, עם גישה זו, תוספות להעביר במסגרת מלאכותי, זה עשוי לשנות ב התנהגות הפארמצבטית ואת המשמעות של תוצאות הניסוי.
לעומת זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר מניפולציה גנטית של תוספות בסביבתם הטבעית, היא שיטה הנפוצה להעריך במהירות וביעילות את ההשפעה של רווח הפסד של תפקוד הגן תוך עקיפת המגבלות של נוקאאוט יקר וארוך, טוק-in אסטרטגיות25,35. אלקטרופורציה בתוך הרחם עלולים להיות מוטים לכיוון בבית אבות באמצעות תא סוג ספציפי היזמים ועל ידי מיקום האלקטרודות לכיוון מבני ventromedial, כולל את MGE36. יתר על כן, בתוך הרחם אלקטרופורציה מאפשר ביטוי בזמן של בונה ניסיוני בתוך 1-2 ימים, לעומת 7-10 ימים נדרש לבנות ביטוי באמצעות ויראלי המומנט25. עם זאת, בתוך הרחם אלקטרופורציה של בבית אבות נוטה להיות תפוקה נמוכה. למרות אבות תא כפירמידה ממוקם באזור הגבי חדרית יכולה להיות transfected ביעילות באמצעות בתוך הרחם אלקטרופורציה, פילוח יותר ventrally ממוקם מבנים, כגון MGE, הוא יותר מבחינה טכנית מאתגר, בפרט קטן e13.5 עוברי, השיעור הגבוה של עובריים קטלני עוד יותר מפחית את התשואה ניסיוני25.
כדי לעקוף חלק המגבלות הטכניות הקשורות במבחנה MGE explant הניסויים ולא אלקטרופורציה ויוו ברחם , שמחוץ organotypic פרוסה תרבויות היה מפותח8,37, 38,39. המוח organotypic פרוסה תרבויות מציעים תנאים היתרון מחקה ויוו , בעת היותו פחות יקרים ולגזול מאשר חיה ביצירת מודלים25. אכן, הכנות אלה מאפשרים גישה נוחה MGE, יחד עם הפריט החזותי ספציפי של תוספות, ולא יכול להיות משולב עם מוקד אלקטרופורציה לחקור מסלולים מולקולריים ספציפי ב- INs נודדות סביבה יותר פיזיולוגית8 , 39 , 40 , 41. אנחנו ולכן יש אופטימיזציה גישה עבור organotypic תרבויות38, אשר אנחנו בשילוב עם רחם לשעבר אלקטרופורציה והדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, בכדי להעריך את תהליך דינמי מורפולוגיים המתרחשים במהלך ההעברה וקולו של MGE-In. בפרוטוקול הנוכחי הותאם וממוטב אחרים אשר השתמשו לשעבר הרחם או בתוך הרחם המוח אלקטרופורציה organotypic פרוסה תרבויות ללמוד את ההעברה של תאים כפירמידה42,43 ו בקליפת המוח תוספות36,39,44. באופן ספציפי, העכבר העוברים נמצאים ערף, MGE הוא electroporated vivo לשעבר לאחר הזרקה ע של פלסמידים ניסיוני, ומאפשר יותר יעיל, מדויק פילוח של אבות MGE מאשר מה ניתן להשיג באמצעות אלקטרופורציה בתוך הרחם . המוח ואז מופקים למחלקה לפרוסות הילתית כל המוח זה יכול להיות תרבותי לכמה ימים, ובכך מאפשר רציפה מעקב, הדמיה של transfected In. גישה זו תוויות בדרך כלל 5-20 tangentially העברת תוספות לחתיכה המוח, למזער את מספר האיטראציות ניסיוני נדרש להגיע מובהקות סטטיסטית, תוך תיוג אוכלוסיה עצביים דליל מספיק כדי להבטיח הפרדת קל נוירונים בודדים עבור שחזור והערכה מורפולוגי משובחים. יתר על כן, בהשוואה ל- MGE explants, organotypic תרבויות להבטיח כי העברת תוספות נחשפים סביבה טבעית יותר, כולל נוגדנים מופרשים באופן מקומי, תשומות מ afferents דפנות התלמוס. גישה זו מתאימה מאוד ובכך לכמת את כיוון והנתיב נודדות שאומצה על ידי transfected In, תוך מתן פרטים אנטומיים מספיקים כדי לאפשר אפיון תהליכים דינאמיים עדינה יותר כגון מוביל תהליך הסתעפות, nucleokinesis, נגררים תהליך הכחשה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 serum-free supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X Serum-free neuron specific supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td>Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor&#39;s website&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum, heat inactivated</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>H1138-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurocell supplement N-2 100X</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>305-016</td>
			<td>Botteinstein&#39;s N-2 Formulation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Square PETG Media Bottles 125 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89132-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II Type A Biosafety Cabinet</td>
			<td>Nuaire</td>
			<td>NU-540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC700.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S233-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D+ glucose</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SPM400.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>C79-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>BiosShop</td>
			<td>MAG522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>AGA002.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Model P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>1-000-800/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil (heavy)</td>
			<td>Rougier Pharma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #5</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504511</td>
			<td>11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WPI Swiss Tweezers #7</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504504</td>
			<td>11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTC Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504617</td>
			<td>11 cm, Straight, flat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501225</td>
			<td>16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501217</td>
			<td>12.5 cm, straight, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>504478</td>
			<td>10.2 cm, full curve, serrated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DeBakey Tissue Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501996</td>
			<td>15 cm, 45&#176; angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbran Microspatula with rounded ends</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>21-401-5</td>
			<td>You will need 2 of these.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond scientific</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TC Dish 60, Standard</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td>60-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1800</td>
			<td>35-mm dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black Wax</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>S17432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes&#160;</td>
			<td>Ultident</td>
			<td>170-CTB700-212</td>
			<td>3 mL, small bulb</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Leica M80</td>
			<td>In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro Square Porator</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>ECM 830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm</td>
			<td>BTX Harvard Apparatus</td>
			<td>45-0487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G 1 1/2</td>
			<td>Becton Dickinson &#38; Co</td>
			<td>305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica VT1000S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GEM, Single edge razor blade</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>71952-10</td>
			<td>Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide 8 well</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80827</td>
			<td>Pack of 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell cell culture insert</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td>30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 &#181;m pore, pack of 50.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMi6000 microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning disk confocal head Ultraview Vox</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.0 acquisition software</td>
			<td>Improvision/Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LiveCell Stage top incubation system</td>
			<td>Pathology devices</td>
			<td>LC30030</td>
			<td>Provides Temperature, CO2 and humidity control.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8 confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-Lifeact-7</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>54491</td>
			<td>Gift from Michael Davidson</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Green FCF</td>
			<td>Millipore-Sigma</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>25G bottle, certified by the Biological Stain Commission</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex utero electroporation and organotypic slice cultures of embryonic mouse brains for live-imaging of migrating gabaergic interneurons

GABAergic interneurons (INs) הם מרכיבים קריטיים של רשתות עצביים לנהוג קוגניציה והתנהגות. תוספות נועד לאכלס את קליפת להעביר tangentially את מקומם המוצא telencephalon הגחוני (ובכלל זה המדיאלי, סימטרית ganglionic הרוחביים (MGE, CGE)) לצלחת בקליפת המוח הגבי בתגובה מגוון של פנימי, חיצוני רמזים. מתודולוגיות שונות פותחו במהלך השנים גנטית לתמרן מסלולים ספציפיים ולחקור כיצד הם להסדיר את השינויים הדינמיים cytoskeletal הדרושים עבור נאות בהעברה. אלקטרופורציה בתוך הרחם נעשה שימוש נרחב כדי לחקור את ההשפעה של דיכוי גנים או ביטוי ב- IN מסוימים תת תוך הערכת ההשפעה על מורפולוגיה והמיקום הסופי. עם זאת, בעוד גישה זו משמשת ברצון לשנות בצורה רדיאלית העברת תאים כפירמידה, זה יותר מבחינה טכנית מאתגר כאשר המיקוד מהווה בתוך הרחם אלקטרופורציה יוצרת תשואה נמוכה נותן שיעורי ההישרדות ירידה של הגורים כאשר אלקטרופורציה מבוצע לפני e14.5, כפי שמקובל כשלמדתי נגזר MGE הארצי. בגישה אלטרנטיבית, MGE explants מספקים גישה נוחה אל MGE וכדי להקל על ההדמיה של In מהונדסים. עם זאת, ב- explants אלה, תוספות נודדים אל מטריצה מלאכותיים, ללא הדרכה אנדוגני רמזים, תשומות דפנות התלמוס. זה הוביל אותנו כדי למטב את שיטת איפה הארצי יכול להעביר בסביבה יותר נטורליסטי, תוך עקיפת האתגרים הטכניים של גישות בתוך הרחם . בנייר זה, אנו מתארים את השילוב של הרחם לשעבר אלקטרופורציה מוח עובריים בעכבר ואחריו organotypic תרבויות פרוסה בקלות לעקוב אחר, תמונה, לשחזר מהונדסים תוספות מעבר לאורך שבילים טבעיים שלהם, בתגובה רמזים אנדוגני. גישה זו מאפשרת כימות שני של ההיבטים דינמי בהעברה עם הדמיה קונאפוקלית זמן לשגות, כמו גם את ניתוח מפורט של פרמטרים שונים מורפולוגית באמצעות שחזורים העצבית על רקמת immunolabeled קבוע.

Watch this Scientific Journal Video about Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons at JoVE.com

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

. פשוט תאכל לשעבר אלקטרופורציה ותרבויות פרוסה Organotypic מוח עובריים בעכבר עבור Live-הדמיה של העברת Interneurons GABAergic

כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

9.9K Views.  Centre de recherche du CHU Sainte-Justine. כאן, אנו מספקים שיטה נמוכים ואמין כדי ליצור electroporated המוח organotypic פרוסה תרבויות מעוברים עכבר מתאים מיקרוסקופיה קונפוקלית טכניקות הדמיה לחיות.

Video: Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly oriented in the sagittal plane and develops mostly in the postnatal period in small rodents 3. Furthermore, several antibodies are available which selectively and intensively label Purkinje cells including all processes, with anti-Calbindin D28K being the most widely used. For viewing of dendrites in living cells, mice expressing EGFP selectively in Purkinje cells 11 are available through Jackson labs. Organotypic cerebellar slice cultures cells allow easy experimental manipulation of Purkinje cell dendritic development because most of the dendritic expansion of the Purkinje cell dendritic tree is actually taking place during the culture period 4. We present here a short, reliable and easy protocol for viewing and analyzing the dendritic morphology of Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. For many purposes, a quantitative evaluation of the Purkinje cell dendritic tree is desirable. We focus here on two parameters, dendritic tree size and branch point numbers, which can be rapidly and easily determined from anti-calbindin stained cerebellar slice cultures. These two parameters yield a reliable and sensitive measure of changes of the Purkinje cell dendritic tree. Using the example of treatments with the protein kinase C (PKC) activator PMA and the metabotropic glutamate receptor 1 (mGluR1) we demonstrate how differences in the dendritic development are visualized and quantitatively assessed. The combination of the presence of an extensive dendritic tree, selective and intense immunostaining methods, organotypic slice cultures which cover the period of dendritic growth and a mouse model with Purkinje cell specific EGFP expression make Purkinje cells a powerful model system for revealing the mechanisms of dendritic development.

We present a protocol that permits to view and to quantitatively asses the morphology of the dendritic tree of individual Purkinje cells grown in organotypic cerebellar slice cultures. This protocol is intended to promote studies on the mechanisms of Purkinje cell dendritic development.

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for tissue formation during embryonic development and tissue homeostasis during adulthood 1. Currently, great efforts are invested towards controlling the switch of somatic stem cells from expansion to differentiation because this is thought to be fundamental for developing novel strategies for regenerative medicine 1,2. However, a major challenge in the study and use of somatic stem cell is that their expansion has been proven very difficult to control.
Here we describe a system that allows the control of neural stem/progenitor cell (altogether referred to as NSC) expansion in the mouse embryonic cortex or the adult hippocampus by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, a major regulator of the G1 phase of the cell cycle and somatic stem cell differentiation 3,4. Specifically, two different approaches are described by which the cdk4/cyclinD1 complex is overexpressed in NSC in vivo. By the first approach, overexpression of the cell cycle regulators is obtained by injecting plasmids encoding for cdk4/cyclinD1 in the lumen of the mouse telencephalon followed by in utero electroporation to deliver them to NSC of the lateral cortex, thus, triggering episomal expression of the transgenes 5-8. By the second approach, highly concentrated HIV-derived viruses are stereotaxically injected in the dentate gyrus of the adult mouse hippocampus, thus, triggering constitutive expression of the cell cycle regulators after integration of the viral construct in the genome of infected cells 9. Both approaches, whose basic principles were already described by other video protocols 10-14, were here optimized to i) reduce tissue damage, ii) target wide portions of very specific brain regions, iii) obtain high numbers of manipulated cells within each region, and iv) trigger high expression levels of the transgenes within each cell. Transient overexpression of the transgenes using the two approaches is obtained by different means i.e. by natural dilution of the electroporated plasmids due to cell division or tamoxifen administration in Cre-expressing NSC infected with viruses carrying cdk4/cyclinD1 flanked by loxP sites, respectively 9,15.
These methods provide a very powerful platform to acutely and tissue-specifically manipulate the expression of any gene in the mouse brain. In particular, by manipulating the expression of the cdk4/cyclinD1 complex, our system allows the temporal control of NSC expansion and their switch to differentiation, thus, ultimately increasing the number of neurons generated in the mammalian brain. Our approach may be critically important for basic research and using somatic stem cells for therapy of the mammalian central nervous system while providing a better understanding of i) stem cell contribution to tissue formation during development, ii) tissue homeostasis during adulthood, iii) the role of adult neurogenesis in cognitive functions, and perhaps, iv) better using somatic stem cells in models of neurodegenerative diseases.

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Controlling the expansion of somatic stem cells is a major factor hampering their study and use in therapy. Here we describe a system to temporally control neural stem cells expansion during development and adulthood, which can be used to increase the number of neurons generated in the mouse brain.

התרחבות של תאי גזע עצביים עובריים ומבוגרים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation או הזרקת Stereotaxic ויראלי

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

הדמיה חיה של מיטוזה בCortex עכבר עוברי פיתוח

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Subtype-selective Electroporation of Cortical Interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression of genes of interest to specific neuronal subtypes has proven remarkably challenging due to the relative scarcity of specific promoter elements. GABAergic interneurons constitute a neuronal population with extensive genetic and morphological diversity. Indeed, more than 11 different subtypes of GABAergic interneurons have been characterized in the mouse cortex1. Here we present an adapted protocol for selective targeting of GABAergic populations. We achieved subtype selective targeting of GABAergic interneurons by using the enhancer element of the homeobox transcription factors Dlx5 and Dlx6, homologues of the Drosophila distal-less (Dll) gene2,3, to drive the expression of specific genes through in utero electroporation.

This procedure shows how to target interneurons in the developing mouse forebrain by means of in utero electroporation. This technique was particularly efficient to achieve selective gene expression in interneuron subtypes destined to the superficial layers of the cortex.

Electroporation תת סוג סלקטיבי של בקליפת המוח interneurons

The study of central nervous system (CNS) maturation relies on genetic targeting of neuronal populations. However, the task of restricting the expression ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em&gt; באוטרו</em&gt; Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...