מר מומן על ידי התחברות של האגודה למלחמה בסרטן הדני (R146-A9394-16-S2). MFB ו MKT היו ממומן על-ידי AUFF נובה (AUFF-E-2015-FLS-9-8). מר MFB משותפת, במימון בית הספר, בריאות, AU. המעבדה E.F.W. נתמך על ידי מענקים ממשרד ספרדית של הכלכלה (SAF2015-70857, שותפה במימון על ידי ERDF-האיחוד האירופי), של ERC מתקדם גרנט (741888 - CSI-Fun).
אנחנו רוצים להודות ליליאנה Fajardo מלור (גנים, פיתוח ומחלות; לחקר הסרטן הלאומי) לקריאה ביקורתית של כתב היד.

פרוטוקול זה כרוך הליך כירורגי של עכברי מעבדה. ניסויים בבעלי חיים כל חייב להיות בנפרד נבדקו ואושרו על-ידי, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש הוועדה (IACUC). כמו הגישה מבוססת על שחזור בעלי חיים, הישרדות, ודא ההרדמה המתאימה לניהול כאב, סביבה כירורגי aseptic בכל עת. השתמש כרית החימום כדי למנוע היפותרמיה במהלך הניתוח ועד ההתאוששות מן ההרדמה.
1. הפעלת שיקולים
<ol><li>בהתאם הנגיף שימש, דרישות כייל נוגדנים שונים עשויים לחול; לדלל את הוירוס בהתאם. הערה: בדוגמה זו, וירוס Adeno-הקשורים בלתי מדולל ב- PBS מוזרק ב כייל של עונה 1 פרק 10-12 IU/mL. הנגיף מכיל מדריך RNA Pten , ביטוי של חלבונים Cre תחת promotor אוביקוויטין (איור 1), ויש serotype 9. אובדן Pten גדל pAKT והתפשטות של האפיתל של הערמונית13.</li>
	<li>השתמש עכברים זכרים בגיל 8 שבועות בזמנו של ניתוח כדי להבטיח פיתוח הערמונית נאותה. הערה: עכברים הראו בניסוי זה הם עכברים knockin Rosa26-LSL-Cas9-EGFP על רקע C57BL/6J12 (איור 1).</li>
	<li>טרי להכין תערובת הרדמה כללית, אם אפשר שיהיה סטרילי. הערה: עבור שחזור בעלי חיים טוב יותר לאחר הניתוח, תרופת הרדמה מומלץ מאוד.<ol>
<li>כדי להכין את הנפח הכולל של הרדמה 5 מ"ל, מערבבים 0.15 מ ל medetomidine הידרוכלוריד (1 מ"ג/מ"ל), midazolam 0.4 מ ל (5 מ"ג/מ"ל) ו 0.25 mL butorphanol (10 mg/mL) עם 4.2 mL סטרילי מים מלוחים. הערה: ניתן להשתמש שיטות הרדמה חלופי, כמו איזופלוריין נשימים, על פי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.</li>
		<li>כדי להפוך את האפקט של medetomidine הידרוכלוריד לאחר הניתוח, מערבבים atipamezole 0.1 מ"ל (5 מ"ג/מ"ל) עם 4.9 מ ל מים מליחים סטרילי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין סביבה כירורגי aseptic מאת נכונה חיטוי ועיקור. אוטוקלב מכשירי ניתוח לפני השימוש.</li>
</ol>2. וירוס-משלוח הערמונית מאתר
<ol><li>עזים ומתנגד החיה על ידי זריקה בקרום הבטן עם מזרק עקר 1 מ"ל, מחט 27G x ½". השתמש מנה הרדמה של 0.01 מ ל/גרם משקל. אם ההליך נמשך יותר מ 30 דקות, לשמור על הרדמה על ידי הזרקת מנה 1/3 של ההתחלה כל 30 דקות.</li>
	<li>בדוק את עומק הרדמה על-ידי הערכת הרפיית שרירים, נסיגה פדלים, רפלקסים palpebral. כאשר אובדן רפלקסים נצפית, לגלח את הבטן התחתונה של החיה.</li>
	<li>בזהירות לכסות את העיניים של החיה עם וטרינרי משחה אופטלמולוגיות באמצעות מקלון צמר גפן סטרילי כדי למנוע עיוורון עקב חוסר רפלקס המצמוץ.</li>
	<li>נגב את הבטן מגולח עם 70% אתנול וביו -10% povidone יוד לחטא את האזור הכירורגי. לשפשף את האזור הכירורגי במרכז האזור כירורגי לעבר הפריפריה.</li>
	<li>לבצע חתך אנכי העור בקו האמצע בבטן נמוך של 1 ס מ בעזרת מספריים כירורגי סטרילי.</li>
	<li>הרם את הצפק באמצעות מלקחיים הצבע בסדר כדי למנוע פגיעה האיברים הן הנחת מתחת. בזהירות לעשות חתך < 8 מ"מ באמצעות מספריים כירורגיים דרך הצפק. הערה: בניגוד אנושית, בלוטת הערמונית של מכרסם כוללת ארבע אונות נפרדים. האונה הקדמי מחוברת של שלפוחית הזרע.</li>
	<li>להניע בעדינות את רקמת השומן הצידה כדי לחשוף את שלפוחית הזרע. באמצעות מלקחיים טבעת, בזהירות להרים שלפוחית הזרע עד הקדמי הערמונית יכולה להיות מזוהה (איור 1).</li>
	<li>תזריק את הנפח הכולל של פתרון וירוס (3 x 1010 חלקיקים נגיפיים) µL 30 קדמי האפיתל הערמונית באמצעות מזרק אינסולין 0.5 mL עם מחט 30G x 8 מ מ. למזער את זליגת ולהבטיח שהנוזל נספג בתוך הרקמה, ויצרו בועה קטנה. מקם את שלפוחית הזרע בחזרה בחלל הבטן.</li>
	<li>תפר של הצפק עם תפרים קטע פשוט 2-3, 6-0 נספגים באמצעות של 13 מ מ, 3/8 circle ו מחט להתחדד לנקודה.</li>
	<li>סיכת הידוק העור עם 3 קליפים סטרילי 4.8 x 6.5 מ"מ הרמת העור עם מלקחיים כדי למנוע נזק של הצפק.</li>
	<li>להתאוששות טובה יותר, החל תרופת הרדמה במנה של 0.01 מ ל/גרם משקל בזריקה בקרום הבטן באמצעות מזרק עקר 1 מ"ל ו מחט 27G x ½". בזהירות המקום האחורי חיות בכלוב שלו.</li>
</ol>3. לאחר הניתוח נהלים
<ol><li>שמור את הכלוב עם עכברים נותח על משטח חימום עבור 1 h לאחר הניתוח, כדי למנוע היפותרמיה עד החלים לחלוטין. אם הנוגדן מוחל, החיה צריך להיות ער, דקות ספורות לאחר ההזרקה.</li>
	<li>לפקח על החיות מדי יום עבור אינדיקציות ריפוי וכאב הפצע המתאים. במידת הצורך, לנהל משככי כאבים נוספים לפי הנחיות טיפול בבעלי חיים מוסדיים.</li>
	<li>להסיר סרטונים העור אחרי 4-5 ימים, לאחר הפצע סגור.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+incidence+and+mortality+worldwide:+sources,+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012.">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing.">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li><li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer.">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454 (2015).</li><li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transgenesis:+an+overview.">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation.">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis.">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li><li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis.">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li><li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus.">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+JUNB/AP-1+promotes+invasive+prostate+cancer.">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy,+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis.">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li><li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome.">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer.">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li><li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer.">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li><li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer.">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li><li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors.">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li><li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate.">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li><li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+prostate:+an+historical+survey+of+divergent+views.">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li><li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation.">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לשנות ביטוי גנים באונה הקדמי של הערמונית מאתר באמצעות הזרקת וירוס, יצירת מודל חזק עכבר חדש עבור סרטן הערמונית (איור 2). ניהול מוצלח אדנו תוארה לראשונה על ידי Leow et al. . ב- 2005-8. בעבר הראינו איך קידוד אדנו Cre recombinase חלבון יכול להחליף גוזלת זמן בין מטלטלין של אלל Cre רקמות ספציפיות מחיקה 9 (איור דו-ממדי). מאז הנגיף מדביק תאים מספר9, מודל זה מחקה את התרחיש אנושי משובט הרחבה14,15 והוא אופטימלי לחקר הסרטן (איור 2B).
הגילוי של CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה פתחה הזדמנויות חדשות לעריכת ויוו ג'ין. עכשיו זה אפשרי לשנות גנים מרובים בו זמנית, מתן טכניקה בעלי ערך גבוה לסרטן נדלנית זה באופן חסכוניים וגם היעילה. מחקר באמצעות מודלים נהנה מן היתרון של יצירת שינויים ג'ין לא רק את germline, אלא גם ברקמות למבוגרים. יתר על כן, הפיתוח של עכברים לביטוי Cas9 מאפשר משלוח ויראלי של Cre והן sgRNAs (איור 1). כפי המדריכים אין השפעה על הגנום ללא ביטוי Cas9, העבודה עם הוירוס הזה הוא לא מסוכנים.
וירוסים Adeno-הקשורים זירוז תגובות חיסוניות נמוכה מאוד, למרות נוכחים עד שנה, הנגיף לא השתלבה הגנום המארח, מה שהופך את זה עדיף ויוו נוקאאוט מחקרים16. בהקשר זה יצוין כי שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם עשוי להשפיע התמרה חושית יעילות סוגי רקמות שונות. לכן, אופטימיזציה עבור רקמות ייעודיים חיוני להשיג יעילות גבוהה. באמצעות שילוב של הגנום Lentivirus ניתן להתיר מצד אונקוגן ארוכת טווח הביטוי10.
הערמונית האנושי אינו מופרד בתוך האונות נפרדות, זה נדון של האונות הערמונית מאתר הטוב ביותר המייצג את הערמונית אנושי. ואילו האונה לרוחב הוצע, הוכח הבדל משמעותי בין האונות שונים לגבי הגידול חניכה9,17,18,19. היבט קריטי נוסף של המשלוח וירוס הוא זיהום אפשרי של תאים אחרים בגוף. הבחנו תאי משתית הערמונית יש כבר transduced. ניתן למזער את הסיכון במהלך ההליך משלוח orthotopic, הימנעות כלי הדם ומניעת זליגת תוך הזרקת. עוד וירוס עיצוב כולל מקדם ספציפי הערמונית, כגון יזם Probasin ו serotype, יכול להגדיל תא-ירידה לפרטים.

זיהוי וטיפול בסרטן הערמונית השתפרו משמעותית בעשור האחרון. ובכל זאת, השכיחות של סרטן הערמונית עולה, בעקבות תוחלת החיים. משוערת 1.1 מיליון מקרים חדשים ברחבי העולם, זה בין הסיבות הנפוצות ביותר של מוות מסרטן גברים 1. סרטן הערמונית הוא איטי בהתפתחות שלו, אך כאשר הסרטן התפתחה למצב גרורתי מתקדם, הפרוגנוזה הוא עני בשל אפשרויות הטיפול מוגבל. עד כה, רק כמה גנים זוהו מנהלי התקנים נפוצים ב סרטן זה, ופוגע שלה הטרוגניות, multifocality זיהוי של סמנים ביולוגיים, מחלת targetable מנהלי התקנים2,3.
לטכניקות GEMMs ביצירת הם לעיתים קרובות לקוי על ידי המורכבות שלהם, הוצאות בזמן ועלויות. מודלים נוקאאוט מותנה היה בשימוש נרחב לחקר סרטן הערמונית המועמד גנים, כי התוצאה עובריים קטלני כאשר לא פעיל ב germline4. הדגמים הנפוצים ביותר לערב של recombinase Cre ספציפיים הערמונית מושפעת גם ששונה Probasin5 או מקדם6 PSA משולב של GEMM על ידי הצלב מטלטלין נוספים. דגמים אלה, הגן עניין יהיה ממוקד ברוב המכריע של הערמונית תאים אפיתל, יצירת היפרפלזיה האיבר כולו, אשר עשוי לפגום של החיה בדרכי השתן פונקציה7.
משלוח ויראלי של החלבון Cre בזריקה לתוך האונה הקדמי של הערמונית מאתר ניתן לפתור בעיה זו על ידי מיקוד רק תאים מספר8. התחשבות דרישות טכניות מעבדות, מומחיות, מטרות, יתרונות שיטת מקשת רחבה של ווריאציות אפשריות. גישות מוצלחת ניצול אדנו מיקוד JunB , Pten9 או Lentivirus מיקוד Pten ו- Trp5310 הוכחו בין השאר. הוספת transgenes, כגון לוציפראז, הבונה ויראלי או GEMM את יתר על כן תאפשר פולשני ניטור של התקדמות המחלה באמצעות ביולומינסנציה הדמיה11.
הגנום עריכה מבוסס על טכנולוגיית CRISPR/Cas9 מגלה הזדמנות חדשה ומהירה ללמוד סרטן באמצעות יצירה מהירה של הסתרה סומאטית12. משלוח ויראלי של מדריך בודד RNAs (sgRNAs) למזהים ייחודיים של האונה הקדמי של הערמונית מאתר יוצר מודל פיזיולוגית רלוונטיים יותר של סרטן הערמונית. בכך תאים בודדים נשיאת מוטציות שבחרת יכולים ליצור שיבוטים מסוגלים התפשטות ופלישה. יתר על כן, השימוש מדריך RNAs עבור גנים יעד מרובים יפיק שיבוטים תאים עם שינויים בגנים שונים. פעולה זו תאפשר גידול הטרוגניות, לחץ הברירה הטבעית על התקדמות סרטן, אשר יכול לחשוף את החשיבות של כל שינוי גנטי או מנגנונים epistatic.
כאן אנו מציגים שיטה להעביר נגיפים הערמונית מאתר עבור שינוי של ביטוי גנים. בטן חתך קטן, האונה הערמונית הקדמי מאתר חשוף, נגיפים מוזרקים לתוך האונה. חמישה ימים לאחר הניתוח, ניתוח קליפים ניתן להסיר מן העור, ניתן לנתח את סרטן הערמונית מ- 8 שבועות לאחר. בסך הכל, זה הליך מהיר וחסכוני, יש השפעה קטנה על העכבר ומאפשר הגידול גדול יותר לפתח מבלי להתפשר על העכבר.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>26175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,5 ml U-100 insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>324825</td>
			<td>for virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>300013</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G 1/2&#39;&#39; needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>304000</td>
			<td>for anesthesia injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 Polysorb Suture</td>
			<td>Medtronic</td>
			<td>GL889</td>
			<td>to close the peritoneum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterilized surgery drape</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone-Iodine Prep Pad</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-669-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming machine</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>GT415</td>
			<td>to shave the abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11252-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Micro Needle Holder</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12500-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14094-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow Pattern Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11002-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Handle incl. Clips</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-01</td>
			<td>to close the skin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wound Clip System Remover</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>12030-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>different models have been used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antisedan</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medetomidinhydrochlorid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Midazolam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>obtained from the animal facility</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye ointment</td>
			<td>Takeda</td>
			<td>7242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Virus (AAV, AV)</td>
			<td>multiple suppliers</td>
			<td></td>
			<td>virus used in this protocol is an in-house production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAKT antibody</td>
			<td>CST</td>
			<td>4060</td>
			<td>used 1:200 dillution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP anitbody</td>
			<td>CST</td>
			<td>2956</td>
			<td>used 1:100 dillution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

virus delivery of crispr guides to the murine prostate for gene alteration

עם השכיחות הגוברת של סרטן הערמונית, זיהוי של הגידול מנהלי התקנים חדשים או מאפננים היא קריטית. מודלים מהונדס גנטית עכבר (GEMM) עבור סרטן הערמונית מונעים על ידי גידול הטרוגניות ואת הדינמיקה שלה microevolution מורכבים. סרטן הערמונית המסורתית העכבר דגמים הכוללים, בין השאר, germline, הסתרה מותנה, ביטוי הטרנסגניים oncogenes ומודלים xenograft. דור של מוטציות דה נובו מודלים אלה הוא מורכב, זמן רב ויקר. בנוסף, רוב המודלים המסורתיים יעד הרוב המכריע של האפיתל הערמונית, ואילו האדם סרטן הערמונית הוא ידוע להתפתח ארוע בודד ברק תת קבוצה קטנה של תאים. מודלים יקר צריך לדמות לא רק סרטן הערמונית חניכה, אלא גם סדר מחלה מתקדמת.
כאן נתאר שיטת למטרה מספר תאי האפיתל הערמונית על ידי תאים transducing על ידי נגיפים. המשלוח של וירוס מהונדס הערמונית מאתר מאפשרת שינוי של ביטוי גנים epithelia הערמונית. וירוס סוג וכמות בזאת יגדירו את מספר תאים ממוקדות עבור שינוי גנטי על ידי transducing כמה תאים לטקס החניכה סרטן ותאים רבים עבור ריפוי גנטי. באמצעות הזרקת המבוסס על ניתוח באונה הקדמי, דיסטלי מן המסלול בדרכי השתן, הגידול במודל זה ניתן להרחיב מבלי ופוגע הפונקציה השתן של החיה. יתר על כן, על ידי מיקוד רק ערכת משנה של הערמונית תאים אפיתל הטכניקה מאפשר משובט הרחבה של הגידול, ולכן מחקה גידול אנושי חניכה, התקדמות, כמו גם פלישה דרך קרום הבסיס.
טכניקה חדשנית זו מספק מודל חזק סרטן הערמונית עם שיפור הרלוונטיות פיזיולוגיים. סבלם של בעלי החיים היא מוגבלת, שכן אין גידול נוסף נדרש, מונה בסך הכל בעלי חיים מצטמצם. באותו הזמן, ניתוח של גנים מועמדים חדשים מסלולים היא מואצת, וזה בתורו עלות גבוהה יותר יעיל.

כדי להעריך וירוס משלוח הערמונית מאתר, דגימות נותחו 3 חודשים אחרי הניתוח. עכברים Rosa26-LSL-Cas9-EGFP12 מבטאים את ה-GFP בתאים נחשפו Cre לחלבון מבוטא על ידי הוירוס. הדגימות הערמונית נבחנו עם מיקרוסקופ פלורסצנטיות כדי לזהות אזורים עם GFP אות (איור 2 א). האות ה-GFP מציין פעילות Cre האפיתל הערמונית אבל לא אם ג'ין עריכה יש כבר המושרה על ידי מדריך CRISPR. Immunohistochemical מקטעים הראה תחומי פעילות של תאים עם ביטוי גבוהה של pAKT (איור 2B), המציינת את אובדן Pten13. Immunofluorescence משותפת צביעה של pAKT ו- GFP לזהות תאים חיובית כפולה (איור 2C). זה אישר את הטרנספורמציה של תאי הערמונית על ידי וירוס Adeno-הקשורים. באופן כללי, תוצאות אלו מראות כי vivo ב CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה ניתן לבצע גם האפיתל הערמונית באמצעות וירוס Adeno-הקשורים ו העכבר Rosa26-LSL-Cas9-EGFP.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57525/57525fig1.jpg"> איור 1: איור של ההליך- ההליך מבוצע העכבר Rosa26-LSL-Cas9-EGFP שנוצרו על-ידי פלאט. et al. 12 הערמונית הקדמי (AP) מחוברת של שלפוחית הזרע (SV). חלקיקי וירוס לבטא מדריך RNA וחלבון Cre מוזרקים לתוך הערמונית הקדמי לשנות ביטוי גנים. <a href="/files/ftp_upload/57525/57525fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57525/57525fig2.jpg"> איור 2: שינוי גנטי בערמונית מאתר באמצעות משלוח הוירוס orthotopic. עכברים Rosa26-LSL-Cas9-EGFP זכר בן שבוע 7 הוזרקו בווירוס Adeno-הקשורים המכיל מדריך RNA Pten , קידוד חלבון Cre. דוגמאות נותחו 3 חודשים לאחר הזרקת וירוס. (א) GFP פלורסצנטיות הדמיה של הערמונית הקדמי. (B) היסטולוגית סעיף (4 מיקרומטר) מוכתם pAKT (חום) מסמן את האזור המשובטים עם אובדן Pten הביטוי. תיבת מקווקו מסמן את ההגדלה גבוה הגיש. (ג) Immunofluorescence מכתים GFP (ירוק), pAKT (אדום). חומצות הגרעין היו מוכתמים דאפי. משמאל: כתמים שאינם המוזרק הקדמי האונה מציג אין אות GFP או pAKT. מימין: צביעת של האונה מוזרק מציג שיתוף לוקליזציה של GFP (צביעת cytoplasmic) ו pAKT (לוקליזציה קרום התא). (ד) עכבריםflox/flox Ptenמוזרק עם אדנו לבטא-Cre. H & E מכתים של מקטע היסטולוגית (4 מיקרומטר) של האונה קדמי 6 חודשים לאחר הלידה וירוס. אליפסה מנוקד מסמן את האזור של ציון גבוה neoplasia intraepithelial הנרתיק של הערמונית. לפרטים ראה הפניה 9. <a href="/files/ftp_upload/57525/57525fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration at JoVE.com

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.

וירוס משלוח של מדריכים CRISPR הערמונית מאתר עבור שינוי גנטי

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.6K Views.  Aarhus University. פרוטוקול זה מתאר שיטה שהוקם למסירה וירוס מאתר הערמונית. באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9, ביטוי גנים או Cre recombinase מסירה, הטכניקה מאפשרת שינוי orthotopic של ביטוי גנים, מיישם מודל העכבר חדשניים עבור סרטן הערמונית.

Video: Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

A Mouse Model of Fatigue Induced by Peripheral Irradiation

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. Here we describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. With appropriate shielding, the irradiation targets the lower abdominal/pelvic region of the mouse, sparing the brain, in an effort to model radiation treatment received by individuals with pelvic cancers. We deliver an irradiation dose that is sufficient to induce fatigue-like behavior in mice, measured by voluntary wheel-running activity (VWRA), without causing obvious morbidity. Since wheel running is a normal, voluntary behavior in mice, its use should have little confounding effect on other behavioral tests or biological measures. Hence, wheel running can be used as a feasible outcome measure in understanding the behavioral and biological correlates of fatigue. CRF is a complex condition with frequent comorbidities, and likely has causes related both to cancer and its various treatments. The methods described in this paper are useful for investigating radiation-induced changes that contribute to the development of CRF and, more generally, to explore the biological networks that can explain the development and persistence of a peripherally-triggered but centrally-driven behavior like fatigue.

We describe a method using targeted peripheral irradiation to induce fatigue-like behavior in mice. The selected non-lethal irradiation dose leads to a week-long reduction in voluntary wheel-running activity.

במודל עכבר של עייפות הנגרם על ידי הקרנה ההיקפית

Cancer-related fatigue (CRF) is a distressing and costly condition that often affects patients receiving cancer treatments, including radiation therapy. ...

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis and to identify novel therapeutic targets. To investigate molecular events that drive the progression from primary cancer to metastasis, we have developed a bitransgenic mouse model, RIP-Tag; RIP-tva. In this mouse model, the rat insulin promoter (RIP) drives the expression of the SV40 T antigen (Tag) and the receptor for subgroup A avian leukosis virus (tva) in pancreatic &#946; cells. The mice develop pancreatic neuroendocrine tumors with 100% penetrance through well-defined stages that are similar to human tumorigenesis, with stages including hyperplasia, angiogenesis, adenoma, and invasive carcinoma. Because RIP-Tag; RIP-tva mice do not develop metastatic disease, genetic alterations that promote metastasis can be identified easily. Somatic gene transfer into tva-expressing, proliferating pancreatic &#946; premalignant lesions is achieved through intracardiac injection of avian retroviruses harboring the desired genetic alteration. A titer of &#62;1 x 108 infectious units per ml is considered appropriate for in vivo infection. In addition, avian retroviruses can infect cell lines derived from tumors in RIP-Tag; RIP-tva mice with high efficiency. The cell lines can also be used to characterize the metastatic factors. Here we demonstrate how to utilize this mouse model and cell lines to assess the functions of candidate genes in tumor metastasis.

Identification and Characterization of Metastatic Factors by Gene Transfer into the Novel RIP-Tag; RIP-tva Murine Model

We present a protocol to demonstrate a novel somatic gene transfer system utilizing RIP-Tag; RIP-tva mouse model to study the function of genes in metastasis. The avian retroviruses are delivered intracardiacally to ensure gene transfer into pre-malignant, noninvasive lesions of pancreatic &#946; cells in adult mice.

זיהוי ואפיון הגורמים גרורתי על ידי העברה גנטית לתוך הרומן RIP-התג; RIP-מס ערך מוסף דגם מאתר

Metastatic cancer accounts for 90% of deaths in patients with solid tumors. There is an urgent need to better understand the drivers of cancer metastasis ...

Generation of Prostate Cancer Cell Models of Resistance to the Anti-mitotic Agent Docetaxel

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a common mechanism of disease progression and a prognostic-determinant feature of malignant tumors. In prostate cancer (PC), resistance to MTAs such as the taxane Docetaxel dictates treatment failure as well as progression towards lethal stages of disease that are defined by a poor prognosis and high mortality rates. Though studied for decades, the array of mechanisms contributing to acquired resistance are not completely understood, and thus pose a significant limitation to the development of new therapeutic strategies that could benefit patients in these advanced stages of disease. In this protocol, we describe the generation of Docetaxel-resistant prostate cancer cell lines that mimic lethal features of late-stage prostate cancer, and therefore can be used to study the mechanisms by which acquired chemoresistance arises. Despite potential limitations intrinsic to a cell based model, such as the loss of resistance properties over time, the Docetaxel-resistant cell lines produced by this method have been successfully used in recent studies and offer&#160;the opportunity to advance our molecular understanding of acquired chemoresistance in lethal prostate cancer.

Resistance to cancer therapies contributes to disease progression and death. Determining the mechanistic underpinnings of resistance is crucial for improving therapeutic response. This manuscript details the protocol to generate taxane-resistant cell models of prostate cancer (PC) to help dissecting the pathways involved in progression to Docetaxel resistance in PC patients.

דור של סרטן הערמונית תאים מודלים של ההתנגדות דוסטקסול סוכן אנטי mitotic

Microtubule targeting agents (MTAs) are a mainstay in the treatment of a wide range of tumors. However, acquired resistance to chemotherapeutic drugs is a ...

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce decellularized tongue extracellular matrix (TEM) which provides functional scaffolds for TSCC construction. TEM provides an in vitro niche for cell growth, differentiation, and cell migration. The microstructures of native extracellular matrix (ECM) and biochemical compositions retained in the decellularized matrix provide tissue-specific niches for anchoring cells. The fabrication of TEM can be realized by deoxyribonuclease (DNase) digestion accompanied with a serious of organic or inorganic pretreatment. This protocol is easy to operate and ensures high efficiency for the decellularization. The TEM showed favorable cytocompatibility for TSCC cells under static or stirred culture conditions, which enables the construction of the TSCC model. A self-made bioreactor was also used for the persistent stirred condition for cell culture. Reconstructed TSCC using TEM showed the characteristics and properties resembling clinical TSCC histopathology, suggesting the potential in TSCC research.

Fabrication of Tongue Extracellular Matrix and Reconstitution of Tongue Squamous Cell Carcinoma In Vitro

A method is shown here for the preparation of the tongue extracellular matrix (TEM) with efficient decellularization. The TEM can be used as functional scaffolds for the reconstruction of a tongue squamous cell carcinoma (TSCC) model under static or stirred culture conditions.

ייצור של הלשון מטריצה חוץ-תאית, שיחזור של הלשון קרצינומה של תאים קשקשיים במבחנה

In order to construct an effective and realistic model for tongue squamous cell carcinoma (TSCC) in vitro, the methods were created to produce ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and transgenic genetically engineered mouse models. Unlike subcutaneous tumors, orthotopic tumors contain more clinically accurate vasculature, tumor microenvironment, and responses to multiple therapies. In contrast to genetically engineered mouse models, orthotopic models can be performed with lower cost and in less time, involve the use of highly complex and heterogeneous mouse or human cancer cell lines, rather that single genetic alterations, and these cell lines can be genetically modified, such as to express imaging agents. Here, we present a protocol to surgically injecting a luciferase- and mCherry-expressing murine prostate cancer cell line into the anterior prostate lobe of mice. These mice developed orthotopic tumors that were non-invasively monitored in vivo and further analyzed for tumor volume, weight, mouse survival, and immune infiltration. Further, orthotopic tumor-bearing mice were surgically castrated, leading to immediate tumor regression and subsequent recurrence, representing castration-resistant prostate cancer. Although technical skill is required to carry out this procedure, this syngeneic orthotopic model of both androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer is of great use to all investigators in the field.

The goal of this protocol is to demonstrate the intra-prostatic injection of prostate cancer cells, with subsequent castration. Orthotopic pre-clinical models of androgen-dependent and castration-resistant prostate cancer are critical to study the disease in the context of a clinically relevant tumor microenvironment and an immunocompetent host.

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Phosphopeptide Enrichment Coupled with Label-free Quantitative Mass Spectrometry to Investigate the Phosphoproteome in Prostate Cancer

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction pathways and is tightly regulated by kinases and phosphatases. Therefore, characterizing the phosphoproteome may provide insights into identifying novel targets and biomarkers for oncologic therapy. Mass spectrometry provides a way to globally detect and quantify thousands of unique phosphorylation events. However, phosphopeptides are much less abundant than non-phosphopeptides, making biochemical analysis more challenging. To overcome this limitation, methods to enrich phosphopeptides prior to the mass spectrometry analysis are required. We describe a procedure to extract and digest proteins from tissue to yield peptides, followed by an enrichment for phosphotyrosine (pY) and phosphoserine/threonine (pST) peptides using an antibody-based and/or titanium dioxide (TiO2)-based enrichment method. After the sample preparation and mass spectrometry, we subsequently identify and quantify phosphopeptides using liquid chromatography-mass spectrometry and analysis software.

This protocol describes a procedure to extract and enrich phosphopeptides from prostate cancer cell lines or tissues for an analysis of the phosphoproteome via mass spectrometry-based proteomics.

העשרה Phosphopeptide בשילוב עם ספקטרומטר מסה ללא תווית כמותיים כדי לחקור את Phosphoproteome סרטן הערמונית

Phosphoproteomics involves the large-scale study of phosphorylated proteins. Protein phosphorylation is a critical step in many signal transduction ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, and intrinsic capability in intercellular delivery of various biomolecules. This work establishes an isolation protocol to achieve high yield and high purity of exosomes for siRNA delivery. Human Embryonic Kidney cells (HEK-293 cells) are cultured in bioreactor flasks and the culture supernatant (hereon referred to as conditioned medium) is harvested on a weekly basis to allow for enrichment of HEK-293 exosomes. The conditioned medium (CM) is pre-cleared of dead cells and cellular debris by differential centrifugation and is subjected to ultracentrifugation onto a sucrose cushion followed by a washing step, to collect the exosomes. Isolated HEK-293 exosomes are characterized for yield, morphology and exosomal marker expression by nanoparticle tracking analysis, protein quantification, electron microscopy and flow cytometry, respectively. Small interfering RNA (siRNA), fluorescently labeled with Atto655, is loaded into exosomes by electroporation and excess siRNA is removed by gel filtration. Cell uptake in PANC-1 cancer cells, after 24 h incubation at 37 &#176;C, is confirmed by flow cytometry. HEK-293 exosomes are 107.0 &#177; 8.2 nm in diameter. The exosome yield and particle-to-protein ratio (P:P) ratio are 6.99 &#177; 0.22 &#215; 1012 particle/mL and 8.3 &#177; 1.7 &#215; 1010 particle/&#181;g, respectively. The encapsulation efficiency of siRNA in exosomes is ~ 10-20%. Forty percent of the cells show positive signals for Atto655 at 24 h post-incubation. In conclusion, exosome isolation by ultracentrifugation onto sucrose cushion offers a combination of good yield and purity. siRNA could be successfully loaded into exosomes by electroporation and subsequently delivered into cancer cells in vitro. This protocol offers a standard procedure for developing siRNA-loaded exosomes for efficient delivery to cancer cells.

An exosome is a new generation of drug delivery carriers. We established an exosome isolation protocol with high yield and purity for siRNA delivery. We also encapsulated fluorescently labelled non-specific siRNA into exosomes and investigated the cellular uptake of siRNA-loaded exosomes in cancer cells.

הכנה של Exosomes siRNA מסירה תאים סרטניים

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Three-Dimensional Bone Extracellular Matrix Model for Osteosarcoma

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with diagnostic or prognostic difficulties. OS comprises genotypically and phenotypically heterogeneous cancer cells. Bone microenvironment elements are proved to account for tumor heterogeneity and disease progression. Bone extracellular matrix (BEM) retains the microstructural matrices and biochemical components of native extracellular matrix. This tissue-specific niche provides a favorable and long-term scaffold for OS cell seeding and proliferation. This article provides a protocol for the preparation of BEM model and its further experimental application. OS cells can grow and differentiate into multiple phenotypes consistent with the histopathological complexity of OS clinical specimens. The model also allows visualization of diverse morphologies and their association with genetic alterations and underlying regulatory mechanisms. As homologous to human OS, this BEM-OS model can be developed and applied to the pathology and clinical research of OS.

The bone extracellular matrix (BEM) model for osteosarcoma (OS) is well established and shown here. It can be used as a suitable scaffold for mimicking primary tumor growth in vitro and providing an ideal model for studying the histologic and cytogenic heterogeneity of OS.

עצם תלת-ממדי מטריצה חוץ-תאית מודל אוסטאוסרקומה

Osteosarcoma (OS) is the most common and a highly aggressive primary bone tumor. It is characterized with anatomic and histologic variations along with ...

Evaluating the Differentiation Capacity of Mouse Prostate Epithelial Cells Using Organoid Culture

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation capacity of mouse prostate basal and luminal cells during development, tissue-regeneration and transformation. However, evaluating cell-intrinsic and extrinsic regulators of prostate epithelial differentiation capacity using a lineage tracing approach often requires extensive breeding and can be cost-prohibitive. In the prostate organoid assay, basal and luminal cells generate prostatic epithelium ex vivo. Importantly, primary epithelial cells can be isolated from mice of any genetic background or mice treated with any number of small molecules prior to, or after, plating into three-dimensional (3D) culture. Sufficient material for evaluation of differentiation capacity is generated after 7-10 days. Collection of basal-derived and luminal-derived organoids for (1) protein analysis by Western blot and (2) immunohistochemical analysis of intact organoids by whole-mount confocal microscopy enables researchers to evaluate the ex vivo differentiation capacity of prostate epithelial cells. When used in combination, these two approaches provide complementary information about the differentiation capacity of prostate basal and luminal cells in response to genetic or pharmacological manipulation.

Mouse prostate organoids represent a promising context to evaluate mechanisms that regulate differentiation. This paper describes an improved approach to establish prostate organoids, and introduces methods to (1) collect protein lysate from organoids, and (2) fix and stain organoids for whole-mount confocal microscopy.

הערכת יכולת בידול של העכבר תאים אפיתל הערמונית באמצעות תרבות אורגאיד

The prostate epithelium is comprised predominantly of basal and luminal cells. In vivo lineage tracing has been utilized to define the differentiation ...