אנו מודים כל הסגל של המתקן רצף של תפוקה גבוהה IGBMC, חבר קונסורציום "צרפת Génomique" (ANR10-INBS-09-08), כל שירותי כללית IGBMC בפרט הצוות של המתקן בעלי חיים IGBMC. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של CNRS, INSERM של AFM, le חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן, הצרפתים המדינה קרן דרך ANR תחת התוכנית d'Avenir Investissements מתויג ANR-10-IDEX-0002-02, Labex INRT ANR-10-IDEX-0001-02 ובפרמטר ANR-AR2GR-16-CE11-009-01. התורמים שחיים היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, ההחלטה לפרסם או אופן ההכנה של כתב היד. S. J נתמך על ידי le חדר מרווח וחדיש של הליגה הלאומית לסרטן ANR-AR2GR-16-CE11-009-01, ואת V.U על ידי l'Enseignement דה Ministère et de la Recherche. מזהה הוא "נבחרת labellisée" של לה חדר מרווח וחדיש הליגה הלאומית לסרטן.

עכברים הוחזקו בהתאם להנחיות מוסדיים לגבי טיפול ו שימוש של חיות מעבדה ועל פי הנחיות טיפול החיה הלאומית (הנציבות האירופית הוראת 86/609/CEE; צרפתית פוסק no.87-848). כל ההליכים אושרו על ידי ועדת האתיקה הארצית צרפתי.
 1. בידוד של רקמת שריר <ol><li>הקרבה 6 מבוגר אחד בן שבוע 8 העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם. Sterlise האיבר על ידי שטיפה זה עם 70% אתנול ומנתחים את שרירי הגפיים האחוריות (הסובך, Anterior השוקה, הארבע ראשי) באמצעות מלקחיים ומספריים הצבע בסדר. 
	הערה: עכבר אחד אמור להניב בסביבות 500 מ ג של רקמת.</li>
	<li>מינצ השרירים במבחנה 2 מ"ל המכיל 1 מ"ל של מאגר היפוטוניק קר כקרח כדי הכנה הומוגנית של קטן (&#60; 2-3 מ מ 3) חתיכות באמצעות בסדר מספריים ולהשאיר את הצינור רועדת על מסית העליון הספסל ב 4 מעלות צלזיוס במשך 5-10 דקות</li>
</ol> 2. פירוק רקמת הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>להעביר את homogenate צינור עגול-התחתון 14 מ"ל, resuspend מ ל מאגר היפוטוניק קר (ללא EDTA פרוטאז מעכב קוקטיילים ו- PMSF).
	<ol><li>Homogenise רקמת השריר טחון באמצעות של דאונס רופף (20-30 קווים בתוך 3 דקות) או מהמגן רקמה מכנית של 15-30 s ב- mL 14 סיבוב המדרגה צינורות. 
		הערה: היעילות של פירוק יכול להידרש בשלב זה על ידי מיקרוסקופ אור, אם נדרש, ניתן לבצע שיבושים נוספים-</li>
	</ol></li> <li>להעביר את homogenate 15 mL צינורות ומלא עוצמה 10 מ ל באמצעות מאגר היפוטוניק קר. לתקן את homogenate, כפי שמתואר להלן לפני שתמשיך עם העכבר הבאה.</li>
</ol> 3. קיבוע <ol><li>להוסיף פורמלדהיד הריכוז הסופי של 1%, לנענע 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>להוסיף גליצין ריכוז סופי של 0.125 מ' כל צינור כדי לעצור את קיבוע ו- shake למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
</ol> 4. הכנה גרעינים הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>Homogenise קבוע lysate באמצעות של דאונס רופף (5-10 משיכות).
	<ol><li>העברת צינור 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג גרעינים ופסולת הסלולר.</li>
	</ol></li> <li>להסיר את תגובת שיקוע, resuspend בגדר במאגר היפוטוניק מ ל טריים. לסנן את lysate דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור 50 מ. מחדש לסנן את פילטרט של דרך מסננת תא 40 µm.</li>
	<li>להעביר את פילטרט של שפופרת 15 מ"ל ו צנטריפוגה ב 1,000 x g למשך 5 דקות ב 4 ° C כדי להשיג בגדר גרעינית. 
	הערה: בשלב זה, הגרעינים יכול להיות sonicated מיד או תצמיד קפוא כמו גלולה יבש חנקן נוזלי ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 5. Sonication <ol><li>להעריך את עוצמת הקול של בגדר גרעינית (בסביבות 50 µL עבור homogenisation מכני וגם דאונס) resuspend זה במאגר sonication עד 3-4 פעמים נפח הגרעין ארוזה ואת sonicate למשך 10-15 דקות ב 4 ° C באמצעות sonicator . 
	הערה: כרומטין יכול להיות מנותח מיד כמפורט להלן (6) או קפוא ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס</li>
</ol> 6. הערכת גודל המקטע כרומטין בעקבות Sonication הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>כדי דה-crosslink, לקחת 30 µL של כרומטין במבחנה 1.5 מ"ל ולהוסיף 20 µL 5 מ' NaCl. להשלים את אמצעי האחסון 500 µL, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
	<ol><li>למחרת לבצע טיפול עם 1 µL proteinase K (20 מ"ג/מ"ל מלאי), 10 µL 2 מ' טריס pH 6.8 ו- 10 µL של EDTA 0.5 M עבור h 1-42 מעלות צלזיוס בצע פנול-כלורופורם/כלורופורם החילוץ, לזרז את ה-DNA עם נפח 1 של נתרן acetat e (3 מ') ו- 2 כרכים של אתנול 100% עבור h אחד ב-80 מעלות צלזיוס או ללון ב-20 מעלות צלזיוס</li>
	</ol></li> <li>גלולה ה-DNA על ידי צנטריפוגה-13,500 g x עבור 15 דקות Decant תגובת שיקוע, לשטוף את צניפה ביסודיות עם אתנול 70% קר, צנטריפוגה שוב על 5 דק Decant תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר.</li>
	<li>Resuspend בגדר באמצעי האחסון המקורי (30 µL) טה המאגר. למדוד את ריכוז הדנ א בספקטרופוטומטר על ידי ספיגת-260 ננומטר/280 ננומטר. Pipette 500-1, 000 ng של ה-DNA יחד עם סולם גודל ה-DNA על מסלולים נפרדים של 1.5% agarose ג'ל ולבצע אלקטרופורזה כדי להעריך את גודל המקטע כרומטין. 
	הערה: גודל המקטע צריך להיות בין 200-500 בסיסים, צריך להיות אין שברי משקל מולקולרי גבוה לזיהוי המתאימים כדי לא או גרוע-מפוצלים הדנ א. אם נדרש, הפתרון כרומטין (שלב 5) יכול להיות מחדש sonicated למשך זמן ארוך יותר ובדקתי אז מחדש כמתואר לעיל עד גודל אופטימלי מתקבל.</li>
</ol> 7. Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) הערה: נא עיין טבלה 1 עבור כל מאגר יצירות.
<ol><li>Sepharose לחסום חלבון G חרוזים מאת aliquoting 1 מ"ל של slurry 50% אתנול. צניפה החרוזים על ידי צנטריפוגה ב 400 x g עבור 1 דקות ב- benchtop צנטריפוגה, לשטוף עם 1 מ"ל של טה צנטריפוגה מאגר ב 400 x g וחזור לשטיפה של
	<ol><li>לאחר צנטריפוגה את השני, להשעות מחדש ב 1 מ"ל שבב מאגר דילול עם 25 µL של BSA (מניות 20 מ"ג/מ"ל), 20 µL שמרים tRNA (מניות 10 mg/mL). לחסום את החרוזים לפחות 2 שעות לפני השימוש על ידי סיבוב (40-60 rpm) ב-4 מעלות צלזיוס</li>
		<li>µG לדלל 50 של כרומטין (שלב 5) 8-10 פעמים באמצעות שבב דילול מאגר. להוסיף 50 µL של slurry חרוז חסומים ולאחר תקופת דגירה של 2 h סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x ב 4 ° C כדי להשיג כרומטין מאושר מראש ואת להעביר אותו צינור טריים.</li>
	</ol></li> <li>Immunoprecipitation, להוסיף את הכמות המתאימה של נוגדן ראשוני (למשל, 1-2 µg לכל µg 10 של כרומטין), דגירה בין לילה עם סיבוב ב-4 מעלות צלזיוס 
	הערה: הכמות האופטימלית של נוגדן המומלצים על ידי הספק או יכול להיקבע מדעית על ידי ביצוע שבב-qPCR עם כמויות שונות של נוגדן עד העשרה האופטימלי הוא ציין. גם חלבון G sepharose עשויים להיות מוחלפים על ידי חלבון א' sepharose בהתאם סוג המשנה של הנוגדן בשימוש.</li>
	<li>להוסיף את החרוזים חסומים ביום המחרת, תקופת דגירה של h 1 עם סיבוב (40-60 rpm) ב-4 ° C. צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s הצניפה החרוזים, להסיר את תגובת שיקוע, ולהתחיל את השבב שוטף.</li>
	<li>שבב שוטף: לבצע את מנקי הבאים עם המאגרים: פעם אחת עם מאגר מלח נמוכה, ואז פעמיים עם מאגר מלח גבוהה, פעמיים עם מאגר LiCl, ולבסוף פעמיים עם מאגר טה.
	<ol><li>לבצע כל כביסה 10 דקות עם סיבוב (40-60 rpm) ב 4 ° C, גלולה החרוזים בין כל כביסה על ידי צנטריפוגה ב 400 g x עבור 20-30 s ומפרידה ספסל-top-</li>
	</ol></li> <li>, • תנאי להסיר בכביסה האחרונה, resuspend את החרוזים במאגר 250 µL • תנאי (הטרי) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר תוך כדי טלטול.</li>
	<li>צנטריפוגה 400 x g ולאסוף eluate בשפופרת טריים. ביצוע זה צעד פעמיים ולאחר מכן דה-crosslink eluate בין לילה עם 20 µL M NaCl 5 ו- A RNase 1 µL (10 mg/mL), לטיפול עם proteinase K, פנול-כלורופורם/כלורופורם תכונות נוספלהתנהג כמו לשלב 6.</li>
	<li>Resuspend ב µL 50 טה המאגר ולעשות שימוש aliquots שבב-qPCR לפי פרוטוקולים סטנדרטיים 15 כדי לבדוק את האיכות של השבב.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Wade, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Transcription+Regulatory+Networks+with+ChIP-seq+and+RNA-seq.">Mapping Transcription Regulatory Networks with ChIP-seq and RNA-seq.</a> Adv Exp Med Biol. 883, 119-134 (2015).</li><li>Alpern, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAF4,+a+subunit+of+transcription+factor+II+D,+directs+promoter+occupancy+of+nuclear+receptor+HNF4A+during+post-natal+hepatocyte+differentiation.">TAF4, a subunit of transcription factor II D, directs promoter occupancy of nuclear receptor HNF4A during post-natal hepatocyte differentiation.</a> Elife. 3, e03613 (2014).</li><li>Martianov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+occupancy+of+an+extended+repertoire+of+CREM+and+CREB+binding+loci+in+male+germ+cells.">Cell-specific occupancy of an extended repertoire of CREM and CREB binding loci in male germ cells.</a> BMC Genomics. 11, 530 (2010).</li><li>Achour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+identity+genes+regulated+by+super-enhancers+are+preferentially+down-regulated+in+the+striatum+of+Huntington's+disease+mice.">Neuronal identity genes regulated by super-enhancers are preferentially down-regulated in the striatum of Huntington's disease mice.</a> Hum Mol Genet. 24 (12), 3481-3496 (2015).</li><li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TEAD+transcription+factors+are+required+for+normal+primary+myoblast+differentiation+in+vitro+and+muscle+regeneration+in+vivo.">TEAD transcription factors are required for normal primary myoblast differentiation in vitro and muscle regeneration in vivo.</a> PLoS Genet. 13 (2), e1006600 (2017).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Dacwag-Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N., DiMario, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Myogenesis: Methods and protocols. 798, 517-531 (2012).</li><li>Dimauro, I., Pearson, T., Caporossi, D., Jackson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+protocol+for+the+subcellular+fractionation+of+skeletal+muscle+cells+and+tissue.">A simple protocol for the subcellular fractionation of skeletal muscle cells and tissue.</a> BMC Res Notes. 5, 513 (2012).</li><li>Thomas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAK1+and+CtBP1+Regulate+the+Coupling+of+Neuronal+Activity+to+Muscle+Chromatin+and+Gene+Expression.">PAK1 and CtBP1 Regulate the Coupling of Neuronal Activity to Muscle Chromatin and Gene Expression.</a> Mol Cell Biol. 35 (24), 4110-4120 (2015).</li><li>Kuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+glucocorticoid+receptor-binding+sites+in+myotubes+identifies+gene+networks+modulating+insulin+signaling.">Genome-wide analysis of glucocorticoid receptor-binding sites in myotubes identifies gene networks modulating insulin signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (28), 11160-11165 (2012).</li><li>Whyte, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Master+transcription+factors+and+mediator+establish+super-enhancers+at+key+cell+identity+genes.">Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes.</a> Cell. 153 (2), 307-319 (2013).</li><li>Benhaddou, A., Keime, C., Ye, T., Morlon, A., Michel, I., Jost, B., Mengus, G., Davidson, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+TEAD4+regulates+expression+of+myogenin+and+the+unfolded+protein+response+genes+during+C2C12+cell+differentiation.">Transcription factor TEAD4 regulates expression of myogenin and the unfolded protein response genes during C2C12 cell differentiation.</a> Cell Death and Differentiation. 19 (2), 220-231 (2011).</li><li>Cowling, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+dynamin+2+expression+rescues+X-linked+centronuclear+myopathy.">Reducing dynamin 2 expression rescues X-linked centronuclear myopathy.</a> J Clin Invest. 124 (3), 1350-1363 (2014).</li><li>. ChIP Analysis Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html">https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/epigenetics-noncoding-rna-research/chromatin-remodeling/chromatin-immunoprecipitation-chip/chip-analysis.html</a> (2017)</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

כאן נתאר פרוטוקול הרומן להכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר הבוגרים ולהראות כי כרומטין הזה מתאים ניסוי שבב לזהות איגוד פקטור שעתוק והשינויים היסטון קוולנטיות גרעינים סיבי השריר. פרוטוקול זה כרוך במספר שלבים קריטיים. הראשונה היא הפרעה רקמות שניתן לבצע דאונס או באמצעות הטיית מכני. הטיית מכני יותר לשחזור ומהירה, ולכן הוא שיטת הבחירה. יחד עם זאת, אם אין מכשיר מתאים זמין, הפרעה יכול גם להתבצע על ידי douncing, שבו הערכת היעילות של פירוק תחת המיקרוסקופ מומלץ לפני שתמשיך לשלב קיבוע. קיבוע של כל רקמה lysates, יותר מאשר הקיבעון של גרעינים בודדים, מותר sonication לשחזור יותר בכמויות קטנות יותר עבור משכי זמן קצר. אנחנו גם בחר לתקן את lysates לאחר הפרעה במקום לתקן את הרקמות לפני שיבושים, כפי שתואר על ידי תומאס. et al. 10 מראש תיקון הרקמה כתוצאה יעילות מופחתת של homogenisation. פרוטוקול זה מבוסס על חיתוך מכני הוא גם מהיר יותר הצעת פתרונות אחרים, כגון עיכול collagenase, בהם מעורבים דגירה ממושך של הרקמה ביתור 37 ° C8. במהלך תקופה זו יכולה להתרחש שינויים באיגוד פקטור שעתוק וביטוי גנים. תיקון הגרעינים מהר ככל האפשר חיוני ולכן ללכוד יותר בנאמנות את מצב פיזיולוגי נורמלי.
שלב קריטי השני הוא הטיהור של גרעינים מן הקבוע lysate. בשביל זה, סינון רציפים של הפתרון lysate קבוע, תחילה דרך מסננת תא מיקרומטר 70 לסלק ההריסות גדול ולאחר מכן דרך מסננת תא 40 µm לפנות את הפסולת בסדר, מונע סתימת strainers את ומגדיל את התשואות של גרעינים שהושג. ברגע מטוהרת על-ידי סינון, הגרעינים הם sonicated, לקבוע את גודל מקטע דנ א לאחר דה-crosslinking. הכנה טיפוסי של הגפיים האחוריות שני של עכבר אחד מניבה 100 µg של כרומטין. איגוד את lysates של עכברים עד 3 עשוי לשפר את התשואה על ידי הקטנת ההפסדים במהלך ההכנה. ההליך זה יעיל, שכן היא מאפשרת ההתאוששות של עד 75% של ה-DNA גנומי כמו כרומטין (נתונים לא מוצג).
שבב ניסויים שנועדו להעריך איגוד פקטור שעתוק והפגינו שינויים epigenetic ההתאמה של פרוטוקול זה ללמוד הכונה ב גרעינים סיבי השריר. אותות שבב-seq חזק וחזק Pol II, H3K27ac נוצרו מכרומטין, המאפשר זיהוי של סיבי השריר זהות גנים על ידי שלהם ייחודי H3K27ac ו- Pol II פרופילים7. רמות גבוהות יותר של H3K27ac ו- II פול פוט את הגנים המתבטא בחום גרעינים סיבים, לעומת גנים ביטוי בלוויין או תאי אנדותל, הראה כי האות בא בעיקר גרעינים סיבים. זה אושר גם על ידי האובדן של שבב Tead4 אות באמצעות כרומטין של עכברים איפה שזה היה במפורש לא פעיל בתוך סיבי השריר. למרות זאת, חלש יותר, אבל בבירור מעל רקע אותות, עבור תא בלוויין סמנים כגון Vcam1, Pax7 (נתונים לא מוצג) יכולים להתגלות מציג את כרומטין של תאים אלה הוא גם ההווה. אנו צופים כי הפרוטוקול שלנו צריך להיות מתאים טכניקות אחרות המשתמשות כרומטין פורמלדהיד-קבוע כגון 3 C/4 C וטכניקות היק כרומטין קונפורמציה הלכידה. השימוש בפרוטוקול שלנו עבור שילוב שבב-seq עבור גורמי שעתוק והשינויים כרומטין עם כרומטין קונפורמציה לכידת אמור בעתיד לאפשר הבנה מפורטת של ג'ין מנגנוני הרגולציה סיבי השריר, איך אלה עשויים להיות מוסדרים . נסערת לגירויים פיזיולוגיים, כגון פעילות גופנית, צום, עשיר בשומן, denervation, או במחלה, על-ידי שימוש כרומטין שהוכנו גנטית שונה עכברים מתרבה מחלות כמו centronuclear X-linked מיופתיה14.
לסיכום, פרוטוקול זה בעלות נמוכה, היעילה מאפשר את ניתוקה של גרעינים סיבי השריר שניתן sonicated מיד או קפוא ב- 80 ° C לשימוש נסתר. השימוש כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה סיפקה הראשונה הגנום רחב שבב-seq הנתונים סיבי השריר7 , יקל על מחקרים עתידיים על הכונה בתוך הרקמה הזו.

Immunoprecipitation כרומטין (ChIP) מצמידים תגובת שרשרת של פולימראז כמותית (qPCR), רצף תפוקה גבוהה (צ'יפ-seq) הפכו את השיטות של הבחירה ללמוד שעתוק ו epigenetic בקרת גנים ברקמות שונות סוגי תאים1. טכניקה זו מאפשרת הגנום כולו פרופיל של שינויים כרומטין קוולנטיות, תפוסת variant היסטון שעתוק מקדם האיגוד2,3.
בזמן ביצוע שבב של תאים בתרבית וותיקה, השבב של רקמות יונקים נשאר יותר מאתגר. הכנת כרומטין שבב כרוך במספר שלבים קריטיים צריך להיות מותאם לכל סוג הרקמה והתא. כרומטין ניתן להכין את lysates הסלולר של תאים בתרבית או טיהור הבאים בגרעין. במקרה של רקמות יונקים, פירוק יעיל קיבוע פורמלדהיד, טיהור של גרעינים הם קריטיים כדי להבטיח התאוששות אופטימלי של כרומטין. יתר על כן, לבחור לתקן הגרעינים לפני או אחרי טיהור שלהם צריך להיקבע השפעול. למרות משוכות אלה, שבב בוצעה בהצלחה רקמות כמו הכבד, testis, או המוח4,5,6. במקרה של שריר השלד, שיבוש כזה עמיד פיזית טישו, אשר מוצגים תכולה גבוהה של חלבונים מבניים, ובידוד של הגרעינים שלה הוא מאתגר במיוחד. בהתחשב סגוליות זה, פרוטוקולים ממוטב בשביל לרקמות אחרות לא נותנים תוצאות משביעות רצון לשרירי השלד.
כאן נתאר פרוטוקול לבודד את השבב-כיתה כרומטין של רקמת שריר השלד העכבר המערבת פיזית לשבש את הרקמה, קיבוע פורמלדהיד, ולאחר מכן הבידוד של גרעינים, sonication. היעילות של שיטה זו להכין כרומטין מתאים שבב מרקמות זה הודגם על-ידי ביצוע שבב-qPCR וצ'יפ-seq עבור שונים גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות7.
טכניקה חדשה זו הרבה יותר מהר מאשר פרוטוקול שדווחה בעבר8 הכוללת זמן collagenase עיכול צעדים אשר במהלכו, שינויים לוקליזציה גנומית של גורמי שעתוק, שינויים בביטוי הגנים יכול להתרחש. מהירות שבה הם הגרעינים מבודד ו קבוע הופך את השיטה המתוארת כאן אטרקטיביים במיוחד להכין כרומטין הלוכד יותר בנאמנות את המדינה יליד תפוסת גנומית. יתר על כן, למרות שיש שיטות נוספות כרומטין בידוד חלבון או חילוץ של רקמת שריר יש כבר מתואר8,9,10 ומשמש לניסויים שבב-qPCR את הגנים הנבחר, אין שבב-seq נתונים דווחה השימוש בהם. שיטת דיווח כאן מתאים שעתוק מקדם, היסטון השינוי שבב-seq, ולכן צריכה להיות גם מתאים 3 / 4C או היק כרומטין קונפורמציה ללכוד יישומים.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>T 25 digital ULTRA-TURRAX</td>
			<td>T 18 ULTRA-TURRAX</td>
			<td>0009022800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE SARL</td>
			<td>P7626-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail-EDTA Free</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>11873580001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Sepharose beads</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-3296</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P-2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 70um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>431751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainers 40um</td>
			<td>Corning BV</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde EM grade</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase A</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12091039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>P3803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>B4287-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast tRNA</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>R5636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycogen Blue</td>
			<td>AMIBION</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pol II ChIP Antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3K27ac ChIP Antibody</td>
			<td>Active Motif</td>
			<td>39133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tead4 ChIP Antibody</td>
			<td>Aviva Systems Biology</td>
			<td>(ARP38276_P050)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH CHIMIE</td>
			<td>I-3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E220 Focused Ultrasonicator</td>
			<td>Covaris E220</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Additional items</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loose Dounce</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml and 50 ml falcon tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml round bottom tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml and 2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m and 40 &#956;m cell strainers (Corning)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved protocol for chromatin immunoprecipitation from mouse skeletal muscle

אנו מתארים פרוטוקול לשחזור ויעיל עבור הכנת כרומטין של שריר השלד העכבר למבוגרים, טישו פיזית עמיד עם תכולה גבוהה של חלבונים מבניים. שרירי הגפיים ביתור של עכברים בוגרים הן משובשות פיזית על ידי מכני homogenisation, או שילוב של הא ו douncing, במאגר היפוטוניק לפני פורמלדהיד קיבוע של התא lysate. גרעינים קבוע כבר טהור לפי מחזורים נוספים homogenisation מכני, סינון רציפים כדי להסיר שאריות תאים או douncing. גרעינים מטוהרים יכול להיות sonicated באופן מיידי או בשלב מאוחר יותר לאחר הקפאה. יכול להיות sonicated ביעילות כרומטין, הוא השיג מתאימה לניסויים immunoprecipitation כרומטין, כפי שהודגמה בעזרת הפרופילים עבור גורמי שעתוק RNA פולימראז II, שינוי היסטון קוולנטיות. האירועים איגוד זוהה באמצעות כרומטין שהוכנו על ידי פרוטוקול זה הם בעיקר אלה מתרחשים גרעינים סיבי השריר למרות נוכחותם של כרומטין של הלווין האחר הקשורים סיבים ותאי אנדותל. פרוטוקול זה לכן מותאם ללמוד הכונה בשריר השלד העכבר למבוגרים.

כדי לבודד גרעין האטום, ביצענו המגון מכני של רקמת שריר גזור, טחון לסופרן או 15 או 45, ב rpm 18,000, 22,000 (ראה טבלה של חומרים). בכל תנאי, יכול להיות מופרדים גרעיני רקמת הלבלב, אבל התשואה היה אופטימלי באמצעות המהירות נמוכה יותר (איור 1 א'-ב'). הגרעינים יכול גם להיות מוכנים על ידי douncing למשך 3-5 דקות (איור 1A, והנתונים לא מוצג), אבל המגון מכנית היא השיטה של בחירה, כמו תשואות אופטימלית של הגרעינים ניתן להשיג קצת כמו 15 s, המאפשר של רווח חשוב של זמן במיוחד אם מספר דוגמאות צריך להיות מעובד (איור 1B). באמצעות פרוטוקול זה, עד ל- 2.7 x 10 גרעינים7 מ- 500 מ ג של רקמות (שווה ערך לרקמות של העכבר 1) יכול להיות מבודד כדי להפיק 100 µg של כרומטין.
כדי למטב את פיצול כרומטין מן הגרעינים קבוע, אנו sonicated במשך 5 עד 20 דקות. תחת ההגדרות (ראה טבלה של חומרים), 10 דקות sonication היה אופטימלי ליצירת כרומטין עם גודל המקטע ממוצע של 250 bp (איור 2). שלב זה צריך להיות מוטבת השפעול לוקח בחשבון את סוג sonicator בשימוש.
כדי להעריך את איכות כרומטין שריר שהוכן על-ידי הפרוטוקול המתואר לעיל, שבב-qPCR וצ'יפ-seq הניסויים בוצעו נגד גורמי שעתוק, שינוי היסטון או RNA פולימראז II (Pol II). שבב-qPCR כנגד הקולטן glucocorticoid (גר), נוכחות או היעדרות של דקסאמתאזון (דקס) טיפול חשף חזקה העשרה תלויי-דקס GR-אלמנטים הרגולציה של הגנים Redd1 ו- Murf1 ידועים להיות דקס, GR מוסדר סיבי שריר11, בעוד אין אות נראתה testis ספציפי Prm1 האמרגן משמש פקד שלילי (איור 3 א).
שבב-qPCR נגד acetylated ליזין 27 של היסטון H3 (H3K27ac), שינוי קוולנטיות ב משפרי פעיל, היזמים, הראה העשרה חזקה על האמרגן Desmin (Des) הפעיל בתוך סיבי השריר, בהשוואה שלילי intergenic אזור בקרה (איור 3B). H3K27ac שבב-seq חשף רמה גבוהה של הסימן הזה לאורך כל לוקוס Des , אופייני של רקמות מוסדר 'סופר-enhancer' זהות ג'ין12 (איור 4A). באופן דומה, פול פוט II שבב-seq הראו רמות גבוהות של תעתיק II Pol-לוקוס זה.
שבב-qPCR עבור גורם שעתוק Tead4, אשר ממלא תפקיד חשוב בבידול myogenic13,7, חשף את העשרת באתרי שתואר לעיל מחייב Ccnd1 , Ifrd1 (גנים איור 3C). חשוב לציין, העשרה צומצם באמצעות כרומטין מקריסטלים של עכברים איפה Tead4 היה סלקטיבי מוחלש של סיבי שריר (Tead4יהודית דולינסקי-/-)7 (איור 3C). ניתוחים של שבב-seq נתונים הן Tead1 והן Tead4 הראו את הכריכה שלהם לאתר האמרגן של הגן Kdm5a באמצעות כרומטין מפראי-סוג שריר, ואילו האות Tead4, אבל לא את זה של Tead1, H3K27ac או Pol II, אבד באמצעות של כרומטין מ שרירי Tead4יהודית דולינסקי-/- עכברים (איור 4B). באופן דומה, איגוד Tead1 ו- Tead4 על רכיב תקינה במורד הזרם של הגן Adssl1 נתפסת עם כרומטין מפראי-סוג שריר, ואילו איגוד Tead4 אבד באופן סלקטיבי באמצעות כרומטין מ Tead4יהודית דולינסקי-/- שרירים ( איור 4C). מקרים אלה ממחישים כי האות Tead4 ראיתי את הנתונים שבב-seq באו מ מחייב בתוך סיבי השריר.
כדי לקבוע את התרומה של סוגי תאים אחרים הקשורים עם סיבי השריר על פי התוצאות שבב-seq, אנחנו העריכו את אותות H3K27ac ו- Pol II-הגן Vcam1 הפעיל תאי לוויין שריר, Pecam1, סימן תאי אנדותל של כלי הדם המשקים את השרירים. לעומת רמות גבוהות לראות את הגנים או des Adssl1 , הרמות של H3K27ac ו- II Pol לראות גנים Vcam1 וגם Pecam1 היו הרבה נמוך (איור 4A ו- 4C איור). ההבדלים גדולים שידור עבור סיבי השריר לידי ביטוי גנים בהשוואה לאלו הביע ברקמות המשויך ציינו כי האות בשבב פוגשות את כרומטין שהוכנו באמצעות פרוטוקול המתואר לעיל נובע בעיקר איגוד אירועים סיבי השריר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56504/56504fig1.jpg"> 
איור 1: טיהור של גרעינים של העכבר למבוגרים שריר. (א) lysates רקמות מתקבל על ידי homogenisation מכני (18,000 סל ד, 45 s) ואת המגון דאונס (30 קווים/3 דקות) היו מוכתמים trypan blue והנצפית תחת מיקרוסקופ דיגיטלי תמונות נלקחו בשבי בהגדלה X 20. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב') מספר גרעינים המתקבל 500 מ ג של רקמות (המקביל של העכבר 1) לאחר הכנה תחת התנאים המצוינים, סל ד 18,000, 22,000 15 ו 45 s או 3 דקות של douncing. קווי שגיאה לייצג זאת אומרת ± S.E.M. עבור n = 3 עכברים המגון מכני, n = 3 עכברים עבור douncing. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56504/56504fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56504/56504fig2.jpg"> 
איור 2: אימות של גודל המקטע כרומטין. גרעינים בודדים היו sonicated 5, 10, 15 או 20 דקות כמצוין. לאחר דה-crosslinking, טיהור, גודל מקטע דנ א היה מוערך על ידי agarose ג'ל אלקטרופורזה בנוכחות אתידיום ברומיד. מ' הוא סמן הדנ א. גודל. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56504/56504fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56504/56504fig3.jpg"> 
איור 3: שימוש כרומטין עבור שבב-qPCR. (א) עכברים היו נתונים כדי זריקות הצפק התוך של הרכב או דקסמתזון (10 מ"ג/ק"ג), לאחר 1.5 h, כרומטין הוכן משרירי הגפיים האחוריות. העשרה בשבב ב GR היעד גנים Redd1 של Murf1, לעומת האמרגן? מה לעזאזל קרה שליטה שלילי (Prm1), מסומן כמו % של קלט זירז. (B) שבב היה לבצע עבור H3K27ac ו- IgG נוגדנים שליטה מנותח על האמרגן Desmin, לעומת אזור בקרה שלילית intergenic. (ג) Tead4 שבב בוצעה כרומטין שריר המתקבל פראי סוג ועכברים נוקאאוט ספציפיים שרירים Tead4 (Tead4יהודית דולינסקי-/-), ניתחו באתרים איגוד Tead4 ב היזמים Ccnd1 ו- Ifrd1 , בהשוואה ל- אזור intergenic הבקרה. בניסויים כל, כרומטין של עכברים 3 היה איחדו, קווי שגיאה מייצגים זאת אומרת ± S.E.M ב מבחן T של סטודנט עבור משכפל טכני 3. ערך P &#60; 0.001* *, &#60; 0.0001 * * *; . אן. אס, שאינם משמעותיים. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56504/56504fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56504/56504fig4.jpg"> 
איור 4: פרופילים גנומית של סיבי השריר כרומטין. (א) צילומי מסך מתוך University של קליפורניה בסנטה קרוז דפדפן הגנום של לוקוסים המצוין הממחישות את רמות גבוהות יותר H3K27ac ו- Pol II-הגן Desmin, לידי מאוד סיבי השריר, לעומת הגנים Vcam1 ו- Pecam1 הביע בתאים בלוויין ו אנדותל תאים, בהתאמה. (B) UCSC תצלומי מסך לוקוסים המצוין הממחישות קשירה של Tead1 ו Tead4, וכן H3K27ac של פול פוט השנייה, בכרומטין של פראי-סוג (WT) השריר בהשוואה לזה של Tead4יהודית דולינסקי-/- שריר (MT), איפה סלקטיבי אבדן האיגוד Tead4 נצפתה. הנתונים שבב-seq מאויר זמינה GSE82193 במסד הנתונים GEO. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56504/56504fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>שם מאגר</td>
			<td colspan="3">קומפוזיציה</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="6">מאגר היפוטוניק</td>
			<td colspan="3">10 מ מ HEPES-קו (pH 7.3)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">10 מ מ אשלגן כלורי</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">MgCl 5 מ מ2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">0.1% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">0.1 מ מ PMSF (טרי נוסף)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">קוקטייל מעכב פרוטאז (PIC) 1 x (נוסף טריים)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">Sonication מאגר</td>
			<td colspan="3">1% מרחביות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">10 מ מ EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">20 מ מ טריס-HCl pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">150 מ מ NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">0.1% נתרן Deoxycholate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1% טריטון X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">טרי הוסיף 0.1 מ מ PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PIC 1 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="7">מאגר דילול צ'יפ</td>
			<td colspan="3">0.01% מרחביות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1.1% טריטון X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1.2 מ מ EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">מ מ 16.7 pH8 HCl טריס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">167 מ NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">טרי הוסיף 0.1 מ מ PMSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">PIC 1 x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">מאגר מלח נמוכה</td>
			<td colspan="3">0.1% מרחביות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1% טריטון X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">500 מ מ EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">20 מ מ pH8 HCl טריס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">150 מ מ NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">מאגר מלח גבוהה</td>
			<td colspan="3">0.1% מרחביות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1% טריטון X-100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">500 מ מ EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">20 מ מ pH8 HCl טריס</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">500 מ מ NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">מאגר LiCl</td>
			<td colspan="3">250 מ מ LiCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1% NP-40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">1 מ מ EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">10 מ מ טריס HCl pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">• תנאי מאגר</td>
			<td colspan="3">1% מרחביות</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">NaHCO 100 מ מ3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>מאגר טריס-EDTA (טה)</td>
			<td colspan="3">50 מ מ טריס HCl pH 8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">1 מ מ EDTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: מאגר של יצירות.

Watch this Scientific Journal Video about Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle at JoVE.com

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

פרוטוקול משופרת עבור כרומטין Immunoprecipitation של שרירי השלד העכבר

פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

improved-protocol-for-chromatin-immunoprecipitation-from-mouse

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K Views.  Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire. פרוטוקול חדש עבור הכנת כרומטין של שרירי השלד העכבר למבוגרים הותאם במחקר של הכונה של סיבי השריר על ידי כרומטין immunoprecipitation מוצג.

Video: Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit the large-scale identification and quantification of the proteins present in complex biological systems.The knowledge gained from a proteomic approach can potentially lead to a better understanding of the pathogenic mechanisms underlying diseases, allowing for the identification of novel diagnostic and prognostic disease markers, and, hopefully, of therapeutic targets. However, the cardiac mitral valve represents a very challenging sample for proteomic analysis because of the low cellularity in proteoglycan and collagen-enriched extracellular matrix. This makes it challenging to extract proteins for a global proteomic analysis. This work describes a protocol that is compatible with subsequent protein analysis, such as quantitative proteomics and immunoblotting. This can allow for the correlation of data concerning protein expression with data on quantitative mRNA expression and non-quantitative immunohistochemical analysis. Indeed, these approaches, when performed together, will lead to a more comprehensive understanding of the molecular mechanisms underlying diseases, from mRNA to post-translational protein modification. Thus, this method can be relevant to researchers interested in the study of cardiac valve physiopathology.

The protein composition of the human mitral valve is still partially unknown, because its analysis is complicated by low cellularity and therefore by low protein biosynthesis. This work provides a protocol to efficiently extract protein for the analysis of the mitral valve proteome.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור הפקת חלבונים מן שסתום מיטרלי האדם

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a challenge for ChIP due to technical difficulty in isolation of high-quality nuclei with minimal contamination of myofibrils. Previous protocols have attempted to purify nuclei before cross-linking, which incurs the risk of altered DNA-protein interaction during the prolonged nuclei preparation process. In the current protocol, we first cross-linked the skeletal muscle tissue collected from mice, and the tissues were minced and sonicated. Since we found that ultracentrifugation was not able to separate nuclei from myofibrils using cross-linked muscle tissue, we devised a sequential filtration procedure to obtain high-quality nuclei devoid of significant myofibril contamination. We subsequently prepared chromatin by using an ultrasonicator, and ChIP assays with anti-BMAL1 antibody revealed robust circadian binding pattern of BMAL1 to target gene promoters. This filtration protocol constitutes an easily applicable method to isolate high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle tissue, allowing consistent sample processing for circadian and other time-sensitive studies. In combination with next-generation sequencing (NGS), our method can be deployed for various mechanistic and genomic studies focusing on skeletal muscle function.

We present a filtration-based protocol to isolate high-quality nuclei from cross-linked mouse skeletal muscle wherein we removed the need for ultracentrifugation, making it easily applicable. We show that chromatin prepared from the nuclei is suitable for chromatin immunoprecipitation and likely chromatin immunoprecipitation sequencing studies.

שיטה המבוססת על סינון של הכנת גרעינים באיכות גבוהה מן שריר השלד צולבות צולבות עבור Immunoprecipitation הכרומטין

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

A Western Blotting Protocol for Small Numbers of Hematopoietic Stem Cells

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western blotting protocol was optimized and suitable for the analysis of small numbers of HSCs (500 - 15,000 cells). Phenotypic HSCs were purified, accurately counted, and directly lysed in Laemmli sample buffer. Lysates containing equal numbers of cells were analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the blot was prepared and processed following standard Western blotting protocols. Using this protocol, 2,000 - 5,000 HSCs can be routinely analyzed, and in some cases data can be obtained from as few as 500 cells, compared to the 20,000 to 40,000 cells reported in most publications. This protocol should be generally applicable to other hematopoietic cells, and enables the routine analysis of small numbers of cells using standard laboratory procedures.

A standard Western blotting protocol was optimized for analyzing as few as 500 hematopoietic stem or progenitor cells. Optimization involves careful handling of the cell sample, limiting transfers between tubes, and directly lysing the cells in Laemmli sample buffer.

מערבון סופג פרוטוקול עבור מספר קטן של תאי גזע Hematopoietic

Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells, with the mouse bone marrow containing only ~25,000 phenotypic long term repopulating HSCs. A Western ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

ניצול מערכת העשרה Immunoprecipitation מקיף כדי לזהות פרופיל אנדוגני שינוי Post-translational של חלבונים היעד

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

מדידת ופרשנות חמצן קצב הצריכה כולה לטוס הראש מקטעים

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic interactions among multiple proteins in a protein interaction network is technically difficult. Here, we present a protocol for Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI), which allows quantitative assessment of fold changes in protein interactions based on relative fluorescence measurements of Proteins in Shared Complexes detected by Exposed Surface epitopes (PiSCES). In QMI, protein complexes from cell lysates are immunoprecipitated onto microspheres, and then probed with a labeled antibody for a different protein in order to quantify the abundance of PiSCES. Immunoprecipitation antibodies are conjugated to different MagBead spectral regions, which allows a flow cytometer to differentiate multiple parallel immunoprecipitations and simultaneously quantify the amount of probe antibody associated with each. QMI does not require genetic tagging and can be performed using minimal biomaterial compared to other immunoprecipitation methods. QMI can be adapted for any defined group of interacting proteins, and has thus far been used to characterize signaling networks in T cells and neuronal glutamate synapses. Results have led to new hypothesis generation with potential diagnostic and therapeutic applications. This protocol includes instructions to perform QMI, from the initial antibody panel selection through to running assays and analyzing data. The initial assembly of a QMI assay involves screening antibodies to generate a panel, and empirically determining an appropriate lysis buffer. The subsequent reagent preparation includes covalently coupling immunoprecipitation antibodies to MagBeads, and biotinylating probe antibodies so they can be labeled by a streptavidin-conjugated fluorophore. To run the assay, lysate is mixed with MagBeads overnight, and then beads are divided and incubated with different probe antibodies, and then a fluorophore label, and read by flow cytometry. Two statistical tests are performed to identify PiSCES that differ significantly between experimental conditions, and results are visualized using heatmaps or node-edge diagrams.

Quantitative Multiplex Immunoprecipitation (QMI) uses flow cytometry for sensitive detection of differences in the abundance of targeted protein-protein interactions between two samples. QMI can be performed using a small amount of biomaterial, does not require genetically engineered tags, and can be adapted for any previously defined protein interaction network.

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen consumption is typically used as the criterion measurement in this regard, two metabolic breakpoints that reflect changes in the dynamics of lactate production/consumption as the work rate is increased are perhaps more relevant for endurance athletes from a functional standpoint. Exercise economy, which represents the rate of oxygen consumption relative to performance of submaximal work, is also an important parameter to measure for endurance-athlete assessment. Ramp incremental tests comprising a gradual but rapid increase in work rate until the limit of exercise tolerance is reached are useful for determining these parameters. This type of test is typically performed on a cycle ergometer or treadmill because there is a need for precision with respect to work-rate incrementation. However, athletes should be tested while performing the mode of exercise required for their sport. Consequently, swimmers are typically assessed during free-swimming incremental tests where such precision is difficult to achieve. We have recently suggested that stationary swimming against a load that is progressively increased (incremental tethered swimming) can serve as a &#34;swim ergometer&#34; by allowing sufficient precision to accommodate a gradual but rapid loading pattern that reveals the aforementioned metabolic breakpoints and exercise economy. However, the degree to which the peak rate of oxygen consumption achieved during such a protocol approximates the maximal rate that is measured during free swimming remains to be determined. In the present article, we explain how this rapidly incremented tethered-swimming protocol can be employed to assess the cardiorespiratory capacity of a swimmer. Specifically, we explain how assessment of a short-distance competitive swimmer using this protocol revealed that his rate of oxygen uptake was 30.3 and 34.8 mL&#8729;min-1&#8729;kg-1BM at his gas-exchange threshold and respiratory compensation point, respectively.

As opposed to measurement during free swimming, which presents inherent challenges and limitations, determination of important parameters of cardiorespiratory function for swimmers can be made using a more feasible and easier to administer tethered-swimming rapidly incremented protocol with gas exchange and ventilatory data collection.

פרוטוקול מקסימלי בעל שחייה בצמיחה מהירה באמצעות שחיה על הערכת שחיינים

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of this method, in comparison to other approaches, is its ability to monitor translation by precisely mapping the position and number of ribosomes on a mRNA transcript.
In this article, we describe the consecutive stages of sample collection and preparation for RIBO-seq method in bacteria, highlighting the details relevant to the planning and execution of the experiment.
Since the RIBO-seq relies on intact ribosomes and related mRNAs, the key step is rapid inhibition of translation and adequate disintegration of cells. Thus, we suggest filtration and flash-freezing in liquid nitrogen for cell harvesting with an optional pretreatment with chloramphenicol to arrest translation in bacteria. For the disintegration, we propose grinding frozen cells with mortar and pestle in the presence of aluminum oxide to mechanically disrupt the cell wall. In this protocol, sucrose cushion or a sucrose gradient ultracentrifugation for monosome purification is not required. Instead, mRNA separation using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by the ribosomal footprint excision (28-30 nt band) is applied and provides satisfactory results. This largely simplifies the method as well as reduces the time and equipment requirements for the procedure. For library preparation, we recommend using the commercially available small RNA kit for Illumina sequencing from New England Biolabs, following manufacturer&#39;s guidelines with some degree of optimization.
The resulting cDNA libraries present appropriate quantity and quality required for next generation sequencing (NGS). Sequencing of the libraries prepared according to the described protocol results in 2 to 10 mln uniquely mapped reads per sample providing sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is quick and relatively easy and can be performed with standard laboratory equipment.

Here we describe the stages of sample collection and preparation for RIBO-seq in bacteria. Sequencing of the libraries prepared according to these guidelines results in sufficient data for comprehensive bioinformatic analysis. The protocol we present is simple, uses standard laboratory equipment and takes seven days from lysis to obtaining libraries.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, mitochondria exist in a series of complex morphologies, ranging from small oval organelles to a broad, reticulum-like network. Understanding how the mitochondrial reticulum expands and develops in response to diverse stimuli such as alterations in energy demand has long been a topic of research. A key aspect of this growth, or biogenesis, is the import of precursor proteins, originally encoded by the nuclear genome, synthesized in the cytosol, and translocated into various mitochondrial sub-compartments. Mitochondria have developed a sophisticated mechanism for this import process, involving many selective inner and outer membrane channels, known as the protein import machinery (PIM). Import into the mitochondrion is dependent on viable membrane potential and the availability of organelle-derived ATP through oxidative phosphorylation. Therefore its measurement can serve as a measure of organelle health. The PIM also exhibits a high level of adaptive plasticity in skeletal muscle that is tightly coupled to the energy status of the cell. For example, exercise training has been shown to increase import capacity, while muscle disuse reduces it, coincident with changes in markers of mitochondrial content. Although protein import is a critical step in the biogenesis and expansion of mitochondria, the process is not widely studied in skeletal muscle. Thus, this paper outlines how to use isolated and fully functional mitochondria from skeletal muscle to measure protein import capacity in order to promote a greater understanding of the methods involved and an appreciation of the importance of the pathway for organelle turnover in exercise, health, and disease.

Mitochondria are key metabolic organelles that exhibit a high level of phenotypic plasticity in skeletal muscle. The import of proteins from the cytosol is a critical pathway for organelle biogenesis, essential for the expansion of the reticulum and the maintenance of mitochondrial function. Therefore, protein import serves as a barometer of cellular health.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...