אנו מודים לכל האנשים במעבדה שלנו שתרמו לייעל ולאמת את הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי INSERM ואת סוכנות המחקר הלאומי (ANR-09-JCJC-0116 ו ANR-11-BSV1-033-02). ET נתמכה במהלך הדוקטורט שלה על ידי מענק מחקר מהמשרד הצרפתי של השכלה גבוהות ומחקר.

1. הכנת פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 פורמלדהיד% ב PBS (מלח נמוכה) על ידי דילול 5.5 מ&quot;ל של פורמלדהיד 37% ב 14.5 מ&quot;ל של PBS. הכן 1 M גליצין, pH 8.0, על ידי המסת 3.8 גרם של גליצין ב 50 מ&quot;ל של PBS; לדלל את הפתרון הזה כדי לקבל גליצין 100 מ&quot;מ 1x PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 0.1% Triton-X100 ב 1x PBS. כן 20x המלוח סודיום ציטראט (SSC) באמצעות 3.0 M נתרן כלורי 0.30 M ציטראט Trisodium ערוך חיץ מים ללא יונים עם pH 7.0 במהירות של 25 ° C. לדלל חיץ זה ל X 1 ו 0.01x באמצעות מים ללא יונים. </li></ol> קיבוע 2. של תאים הערה: השתמשנו הקו הסלולרי HuH7 hepatocarcinoma במחקר זה, אך שיטה זו ישימה בתרביות תאים חסידות אחרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי HuH7 (בתרבית גלוקוז DMEM 1 גר &#39;/ ל, בתוספת 10% עוברי עגל בסרום 0.01% מניות פניצילין, סטרפטומיצין) ב 150,000 תאים לכל צלחת זכוכית תחתונה בגודל 35 מ&quot;מ ללא ציפוי. כשעובד על תא ראשוניתרבויות, משתמשים מנות מצופות קולגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר את המדיום לתרבות. שוטפים את התאים עם 1 מ&quot;ל של PBS ואת לשאוב. תקן את התאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של פורמלדהיד 10% ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) תחת תסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את התגובה עם 1 מ&quot;ל של 1 M גליצין ומערבבים ידי סיבוב. הסר את הפתרון התגובה להפסיק לשטוף את התאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 1x PBS; להתסיס ידי סיבוב לשאוב. הוסף 1 מ&quot;ל של 100 מ&quot;מ גליצין לתאים דגירה אותם במשך 15 דקות ב RT תחת תסיסה, ולאחר מכן לשאוב. הערה: הפרוטוקול ניתן לעצור כאן ואת הצעדים הבאים יכולים להידחות ליום אחר. במקרה זה, להוסיף 1 מ&quot;ל של 100 גליצין מ&quot;מ ולשמור על 4 מעלות צלזיוס, אם יהיה צורך בכך. </li></ol> 3. Permeabilization של תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 0.1% Triton-X100 ב PBS 1x, דגירה במשך 15 דקות ב RT תחת תסיסה, ולאחר מכן לשאוב. זמן דגירה זה יכול להיות מוגבר עד 15 - 20 דקות, כאשר עובדים על cultur תא הראשוניes (למשל, hepatocytes עכברים העיקרי). שוטפים את התאים על ידי הוספת 1 מ&quot;ל של 1x PBS; לשאוב. </li></ol> 4. חסימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl של פתרון לחסימת מדגם זה (המסופק על ידי בערכה); נפח זה יכול להיות מוגבר על מנת לכסות את המדגם. דגירת המנות למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקש את פתרון חסימת הנחה של המנות. נסה להשיג כרכים שיורית שווים עבור כל שקופית, מאחר שהדבר ישפיע על שחזור. אל תתנו דגימות להתייבש! </li></ol> 5. נוגדנים ראשוניים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדנים הראשוניים ב 1x PBS ולהוסיף פתרון המנות (נוגדן עכבר VDAC1: 1/100, נוגדן ארנבת IP3R1: 1/500). לחלופין, נוגדני GRP75 או CypD (נוגדני העכבר הן השתמשו ב 1/500) יכולים לשמש במקום VDAC1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הלילה בתא לחות ב 4 ° C.. שטפו את השקופיות פעמיים באמצעות טריס בופר עם 0.01% Tween (TBS-T). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. בדיקות Assay קשירת הסמיכות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקות assay קשירת סמיכות ניתנות על ידי ההערכה. בחר בדיקות על פי המין של נוגדנים ראשוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את בדיקות assay קשירת שתי הקרבה 1: 5 ב diluent נוגדן. אפשר לתערובת לשבת במשך 20 דקות ב RT. מוסיף את פתרון בדיקת assay בדילול קרבת קשירה. דגירה מנות בתא לחות מחומם מראש עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס. לשטוף את הכלים פעמיים עם-T TBS. </li></ol> 7. קשירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב מגיב איתור באתרו ערכת אדום טקסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות קשירת 5x (המסופקים על ידי בערכה) 1: 5 במים טוהר גבוהה ומערבבים היטב. לדלל את האנזים בפתרון קשירת 1x (המסופק על ידי בערכה) 01:40 ו מערבולת. חכה להוסיף את האנזים עד שהערב בנוסף הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון זה מדגם זה (40 μl עבור מנות זכוכית תחתונה בגודל 35 מ&quot;מ) דגירה את השקופיות צ&#39;אם לחות מחוממת מראשבער במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. שטפו את השקופיות פעמיים עם-T TBS. </li></ol> הגברה 8. הערה: היזהר, ריאגנטים רגיש לאור. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות הגברת 5x (המסופקות על ידי בערכה) 1: 5 במים טוהרים גבוהה. הסר את פולימראז מהמקפיא באמצעות לחסום הקפאה (-20 ° C). לדלל את פולימראז (המסופק על ידי בערכה) 1:80 בתמיסת מערבולת הגברת 1x. מוסיפים את פולימראז מיד לפני השימוש בתערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף פתרון זה מדגם זה (40 μl עבור מנות זכוכית תחתונה בגודל 35 מ&quot;מ). דגירה השקופיות בתא לחות מחומם מראש ל -100 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. קש פתרון הגברה-פולימראז ההנחה של השקופיות. </li></ol> כביסה 9. סופי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את השקופיות כביסה חיץ 1x SSC למשך 2 דקות. שטפו את השקופיות חיץ כביסה SSC 0.01x למשך 2 דקות. תנו את הכלים לייבוש ב RT בחושך. </li></ol> הכנת 10. הדמיה <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר השקופיות באמצעות בהיקף מינימאלי של הרכבה בינונית המכילים DAPI (מימי לא לחזק), להבטיח כי אין בועות אוויר להיתפס תחת להחליק את המכסה. ניתן להשתמש לק כדי לאטום את הקצוות. חכה כ -15 דקות לפני הניתוח באמצעות קרינה או מיקרוסקופ confocal (עירור: 594 ננומטר, פליטה: 624 ננומטר, גדלה: 63X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה, אחסן את השקופיות ב -20 ° C בחושך. </li></ol>

<ol>
	<li>Bravo-Sagua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+communication:+signaling+crossroads+between+homeostasis+and+disease.">Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 50, 55-59 (2014).</li><li>Giorgi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+membranes:+composition,+molecular+mechanisms,+and+physiopathological+implications.">Mitochondria-associated membranes: composition, molecular mechanisms, and physiopathological implications.</a> Antioxidants &amp; redox signaling. 22, 995-1019 (2015).</li><li>Phillips, M. J., Voeltz, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+ER+membrane+contact+sites+with+other+organelles.">Structure and function of ER membrane contact sites with other organelles.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 17, 69-82 (2016).</li><li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RTM+resistance+to+potyviruses+in+Arabidopsis+thaliana:+natural+variation+of+the+RTM+genes+and+evidence+for+the+implication+of+additional+genes.">The RTM resistance to potyviruses in Arabidopsis thaliana: natural variation of the RTM genes and evidence for the implication of additional genes.</a> PLoS One. 7, 39169 (2012).</li><li>Mannella, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+dynamics+of+the+mitochondrial+inner+membrane+cristae.">Structure and dynamics of the mitochondrial inner membrane cristae.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 542-548 (2006).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria.">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> The Journal of cell biology. 174, 915-921 (2006).</li><li>Mannella, C. A., Buttle, K., Rath, B. K., Marko, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopic+tomography+of+rat-liver+mitochondria+and+their+interaction+with+the+endoplasmic+reticulum.">Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum.</a> Biofactors. 8, 225-228 (1998).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2++responses.">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280, 1763-1766 (1998).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4, 1582-1590 (2009).</li><li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface.">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39, 121-132 (2010).</li><li>Szabadkai, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-mediated+coupling+of+endoplasmic+reticulum+and+mitochondrial+Ca2++channels.">Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels.</a> J Cell Biol. 175, 901-911 (2006).</li><li>Tubbs, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membrane+(MAM)+integrity+is+required+for+insulin+signaling+and+is+implicated+in+hepatic+insulin+resistance.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) integrity is required for insulin signaling and is implicated in hepatic insulin resistance.</a> Diabetes. 63, 3279-3294 (2014).</li><li>Paillard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressing+Mitochondria-Reticulum+Interactions+Protects+Cardiomyocytes+From+Lethal+Hypoxia-Reoxygenation+Injury.">Depressing Mitochondria-Reticulum Interactions Protects Cardiomyocytes From Lethal Hypoxia-Reoxygenation Injury.</a> Circulation. 128, 1555-1565 (2013).</li><li>Rieusset, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+calcium+transfer+from+ER+to+mitochondria+links+alterations+of+mitochondria-associated+ER+membrane+integrity+to+hepatic+insulin+resistance.">Disruption of calcium transfer from ER to mitochondria links alterations of mitochondria-associated ER membrane integrity to hepatic insulin resistance.</a> Diabetologia. 59, 614-623 (2016).</li><li>Allalou, A., Wahlby, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BlobFinder,+a+tool+for+fluorescence+microscopy+image+cytometry.">BlobFinder, a tool for fluorescence microscopy image cytometry.</a> Computer methods and programs in biomedicine. 94, 58-65 (2009).</li><li>Theurey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria-associated+endoplasmic+reticulum+membranes+allow+adaptation+of+mitochondrial+metabolism+to+glucose+availability+in+the+liver.">Mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes allow adaptation of mitochondrial metabolism to glucose availability in the liver.</a> Journal of molecular cell biology. , (2016).</li><li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria.">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456, 605-610 (2008).</li><li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation.">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li><li>De Pinto, V., Messina, A., Lane, D. J., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+anion-selective+channel+(VDAC)+in+the+plasma+membrane.">Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) in the plasma membrane.</a> FEBS letters. 584, 1793-1799 (2010).</li><li>Kaul, S. C., Taira, K., Pereira-Smith, O. M., Wadhwa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mortalin:+present+and+prospective.">Mortalin: present and prospective.</a> Experimental gerontology. 37, 1157-1164 (2002).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated by immunofluorescence before the proximity ligation assay experiments in order to ensure specificity and to find the correct working dilutions. We also note that the dilution of antibodies needs to be systematically adjusted when using a new proximity ligation assay kit or a new antibody batch. We chose to use in situ detection Texas red reagents, but it is also possible to use reagents in other wavelengths or to use the HRP/Novared kit for bright-field detection. We used this option to analyze ER-mitochondria interactions in paraffin-embedded liver samples16, enabling the visualization of ER-mitochondria interactions as red-brownish dots, thus overcoming the difficulty of working on liver tissue that presents marked autofluorescence.
Compared to conventional imaging approaches6,7,17, the in situ proximity ligation assay18 avoids using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins that could induce some artefacts. Furthermore, it offers improved selectivity because it requires dual recognition and increased sensitivity. It includes DNA amplification as a component for detecting the target protein by using fluorescence microscope. Finally, the procedure is fast, suitable for multiple-condition testing, reproducible, and consistent. Indeed, we systematically found very reproducible results when targeting several pairs of proteins (VDAC/IP3R, GRP75/IP3R, CypD/IP3R) at the MAM interface or when using alternative strategies (electron microscopy analysis, subcellular fractionation, or co-immunoprecipitation)12,13,16, strongly supporting the robustness of the technique and its ability to monitor organelle coupling. Nevertheless, as some targeted proteins (e.g., VDAC and GRP75) have been reported to be present in other intracellular structures19,20, we cannot completely exclude unspecific signals if IP3R is not far away from these structures. However, co-localization studies of each targeted proteins with specific labeling of respective organelles have been performed in HuH7 cells12, and the majority of the signal was merged in each case, suggesting that another localization of proteins, if present, is minor. Therefore, we recommend that this possibility is tested in each investigated cell or tissue and that the proximity ligation assay is performed with the three pairs of antibodies to totally confirm the results. In addition, the expression level of each targeted proteins should be investigated in each case to determine whether the modulation of organelle proximity is linked to a structural modification or to variation in the expression levels of the targeted proteins.
Until now, the lack of adapted analytical methods has prevented dynamic monitoring of ER-mitochondria contact in health and disease. Now, we think that the use of this in situ proximity ligation assay should allow a better understanding of the physiological regulation of ER-mitochondria interactions, as well as of their role in pathological contexts.

מיטוכונדריה reticulum endoplasmic (ER) אינה אברונים עצמאי בתא, אבל הם פועלים מבניים והן מבחינה תפקודית באתרי קשר המוגדרים ממברנות reticulum endoplasmic הקשורים המיטוכונדריה (MAM). למעשה, MAMs מתאימות באזורים שבהם קרום של ER ו המיטוכונדריה apposed מקרוב, המאפשר אינטראקציות בין חלבונים משני הצדדים. עם זאת, את הקרומים של אברונים אלה אינם מתאחים בתוך אזורים אלה, כך שהם שומרים ישויות נפרדות שלהם. MAMs לשחק תפקיד מכריע סידן (Ca 2 +) והעביר פוספוליפידים מ ER מיטוכונדריה, המשפיע חילוף אנרגיה ותא הישרדות 1-3. העמותה בין ER ואת המיטוכונדריה היה דמיינו לראשונה בשנות ה -1970 עם מיקרוסקופ אלקטרונים. מאז, מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים 4,5, טומוגרפיה אלקטרון 6,7 או חיסוני לוקליזציה של fluorophore ER ואת המיטוכונדריה ספציפיs / חלבוני ניאון 8 שימשו קלאסי ללמוד אינטראקציות ER-המיטוכונדריה. כלי שימושי נוסף לניתוח MAM מבוסס על השימוש חלוק subcellular. זה מאפשר בידוד של שברים MAM ידי ultracentrifugation ההפרש מצמידים את שיפוע Percoll 9. עם זאת, המוצר הסופי מכיל שברי MAM מועשרים, ולא שברים טהורים. בסך הכל, האסטרטגיות אלה אינן רגישות במיוחד ו / או כמותית, והם לא מקובל בקלות הקרנה גדולה. לחלופין, גישות גנטיות באמצעות linkers הבין-אברון ניאון סמים מושרה צמחו, אבל הם אינם מאפשרים ניתוח של אינטראקציות אברון ברמות ביטוי אנדוגני של חלבונים 10. בהתבסס על תגלית של Szabadkai של המתחם IP3R / GRP75 / VDAC בבית MAM 11, פיתחנו שיטה כמותית לנתח אינטראקציות ER-המיטוכונדריה. השתמשנו ב ligati הקרבה באתרועל assay כדי לזהות ולכמת אינטראקציות בין VDAC1 ו IP3R1, שני חלבונים אברון-משטח מעורב במתחם -channeling Ca 2+ על הממשק MAM בתאים קבוע 12. בקצרה, העמקנו VDAC1 על קרום המיטוכונדריה החיצוני (עכבר אנטי VDAC1 נוגדן ראשוני) ו IP3R1 על הממברנה ER (ארנב נוגדן ראשוני נגד IP3R1) (איור 1, לוח א &#39;). לאחר מכן, על פי assay, הוספנו שני אנטי עכבר IgG נגד ארנב (עכבר בדיקות assay קשירת ארנב קרבה), אשר מצומדות כדי רחבות oligonucleotide משלימות. אם שני החלבונים הממוקדים הם במרחק מתחת ל -40 ננומטר, oligonucleotides יכול להכליא עם oligos מחבר הנוסף לאחר מכן לאפשר את היווצרות של תבנית ה- DNA מעגלי (איור 1, לוח ב &#39;). מולקולת הדנ&quot;א חוזר זה ligated מוגבר, יצירת מוצר דנ&quot;א חד-גדילי המצורפת קוולנטית לאחד חלליות הקרבה (איור 1, ג פאנל) </strong&gt;. היות והמרחק בין ER ואת המיטוכונדריה בממשק MAM נע בין 10 ננומטר ל -25 6 ננומטר, קשירת הקרבה והגברה ניתן לעשות, מה שמוביל לגילוי הבאים עקב הכלאה של בדיקות oligonucleotides אדום שכותרתו טקסס (איור 1, פאנל ד ). נקודה פלורסנט מייצגת אינטראקציות בין VDAC1 / IP3R1, ובכך מאפשר כימות של באתרו ER-המיטוכונדריה אינטראקציות בתאים בודדים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> איור 1: איור סכמטי של איתור של endoplasmic אינטראקציות reticulum-המיטוכונדריה ידי ב assay קשירת Situ קרבה. א) נוגדן עכבר עיקרי המכוון נגד VDAC1 ו נוגדן ראשוני ארנב המכוון נגד IP3R1 יכול להיקשר אפיטופים שלהם בסמיכות בממשק MAM, ב) התוספת של זוג חלליות קשירת קרבהמכוון נגד עכבר IgG ארנב. בדיקות אלה יש מצורפות גדילי דנ&quot;א שיכול ליצור תבניות עבור קשירת oligos מחבר. ג) גדיל DNA המעגלי שיקום לאחר הקשירה יכול להיות מוגבר ו ד) מדמיין ידי מיקרוסקופ כנקודת פלורסנט באמצעות oligonucleotides האדום שכותרתו טקסס. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> דומה בניסויים assay קשירת הקרבה באתרו ניתן לבצע עם זוג GRP75 / IP3R1 של נוגדנים, כמו גם cyclophilin D (CypD) / נוגדנים IP3R1, בהתחשב בכך CypD הוצגה אינטראקציה עם מורכבות IP3R / GRP75 / VDAC בממשק MAM 12-14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="919">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">F-8775</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Glycine</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">G-8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Triton</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">T8532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">35mm Glass bottom culture dishes</td>
			<td style="width:169px;">MatTeK corporation</td>
			<td style="width:187px;">P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Blocking solution</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92004 or DUO-92002</td>
			<td>provided in the Duolink PLA probes, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">VDAC1 antibody</td>
			<td style="width:169px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;">ab14734</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">IP3R1-H80 antibody</td>
			<td style="width:169px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:187px;">sc28614</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">CypD antibody</td>
			<td style="width:169px;">Abcam</td>
			<td style="width:187px;">ab110324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Grp75 antibody</td>
			<td style="width:169px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:187px;">sc13967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">TBS 10X</td>
			<td style="width:169px;">euromedex</td>
			<td style="width:187px;">ET220</td>
			<td>Dilute to obtain 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Tween 100X</td>
			<td style="width:169px;">euromedex</td>
			<td style="width:187px;">2001-B</td>
			<td>dilute in TBS to obtain 0,01%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PLA Probes Mouse MINUS</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92004</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">PLA Probes Rabbit PLUS</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92002</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Duolink detection reagents red</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ligation solution</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Ligase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Amplification solution</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Polymerase</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO-92008</td>
			<td>Part of the Duolink detection reagents red, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Duolink Mounting Medium</td>
			<td style="width:169px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">DUO80102</td>
			<td>Duolink, Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Softwares:</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Blob-finder software</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis&#160;at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project&#160;ENLIGHT&#160;and&#160;&#160;Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">ImageJ software</td>
			<td style="width:169px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

study of endoplasmic reticulum and mitochondria interactions by in situ proximity ligation assay in fixed cells

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

בהתבסס על הניסיון שלנו באמצעות פרוטוקול זה, אנחנו יכולים בבטחה ממליצים על שיטה זו עבור להדמיה וכימות של אינטראקציות ER-המיטוכונדריות בתאים קבועים. נציג תמונות של באינטראקציות ER-המיטוכונדריה assay-דמיינו קשירת הקרבה באתרו הקו הסלולרי HuH7 hepatocarcinoma, באמצעות כמה זוגות של נוגדנים, מוצגים. כפי שניתן לראות בתרשים 2 על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כל נקודה אדומה מייצגת אינטראקציה בין שני החלבונים ממוקדים, גרעינים מופיעים בכחול. כביקורת שלילית, השימוש רק נוגדן אחד עיקרי שהוביל אין אות (איור 2, לוח א &#39;), אימות הדרישה להכרה הכפולה עבור בדור אות assay קשירת הקרבה באתרו. קלאסי, ננתח אינטראקציות ER-המיטוכונדריה באמצעות זוג VDAC1 / IP3R1 של נוגדנים (איור 2, לוח ב &#39;). דומה experimen assay קשירת הקרבה באתרוts יכול גם להתבצע עם GRP75 / IP3R1 או CypD / IP3R1 זוגות נוגדנים (איור 2, ג לוחות ד, בהתאמה), מאז GRP75 הוא המלווה צימוד VDAC ו IP3R בממשק MAM 11 ו CypD הודגם לקיים אינטראקציה עם VDAC / GRP75 / IP3R Ca 2+ -channeling 12-14 מורכבים. כימות נקודות ניאון יכול להתבצע באמצעות אחת בועה-Finder 15 או תוכנה ImageJ. כמו הגרעינים של תאים מסומנים בכחול, quantifications של אינטראקציות המיטוכונדריה ER לכל תא מתאים לבצע. אנחנו ביסודיות תוקף assay זה 12, ואנחנו יכולים להסיק כי חלבונים ממוקד אלה הם מועמדים טובים כדי לחקור אינטראקציות ER-המיטוכונדריה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig2.jpg" /> איור 2: ויזואליזציה של VDAC1 / IP3R1, GRP75 / IP3R1 ו CypD / IP3R1 אינטראקציות על ידי באתרו הסמיכות Ligation Assay בתאי HuH7. גרעין תא יופיע בכחול, ואת יחסי גומלין בין שני החלבונים הממוקדים מתוארים אדומה (בהגדלת 63X; סרגל = 20 מיקרומטר). אנו מראים כי VDAC1, GRP75, ו CypD אינטראקציה עם IP3R1. כביקורת שלילית, אנו מראים כי רק נוגדן אחד עיקרי אינו מוביל קרינה אדומה. כדי לאמת את assay, מספר פקדים אחרים בוצעו על מנת להוכיח כי VDAC1, GRP75, ו CypD לא אינטראקציה עם חלבונים ER אחרים וכי IP3R1 אינה אינטראקציה עם חלבונים המיטוכונדריה אחרים (מידע לא מוצג, ראו נ&quot;צ. 9 ו -13). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54899/54899fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells at JoVE.com

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

study-endoplasmic-reticulum-mitochondria-interactions-situ-proximity

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

24.5K Views.  Lund University.  כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ער...

Video: Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, form a complex with Smad4 and translocate to the nucleus where they function as transcription factors to initiate BMP specific downstream effects 1. Traditional immuno-fluorescence techniques with antibodies against phospho-Smad peptides exhibit low sensitivity, high background and offer gross quantification as they rely on intensity of the antibody signal particularly if this is photosensitive fluorescent. In addition, phospho-Smads may not all be in complex with Smad4 and engaged in active transcription.
In situ PLA is a technology capable of detecting protein interactions with high specificity and sensitivity 2-4. This new technology couples antibody recognition with the amplification of DNA surrogate of the protein. It generates a localized, discrete signal in a form of spots revealing the exact position of the recognition event. The number of signals can be counted and compared providing a measurement. We applied in situ PLA, using the Duolink kit, with a combination of antibodies that allows the detection of the BMP signaling effectors phospho-Smad1/5/8 and Smad4 only when these are in proximity i.e. in a complex, which occurs only with signaling activation. This allowed for the first time, the visualization and measurement of endogenous BMP signaling with high specificity and sensitivity in a time course experiment under BMP4 stimulation.

Detection of Signaling Effector-Complexes Downstream of BMP4 Using in situ PLA, a Proximity Ligation Assay

Here we show how to use Proximity Ligation Assay (PLA), with a combination of antibodies to visualize Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling in fixed cells. This technique allowed us to follow the nuclear accumulation of endogenous BMP activated effector-complexes and quantify their levels over time under BMP4 stimulation.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

BMPs are responsible for a wide range of developmental and biological effects. BMP receptors activate (phosphorylate) the Smad1/5/8 effectors, which then, ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

עשה זאת בעצמך התקן להבראת דוגמאות Cryopreserved בטעות ירד לתוך טנקים אחסון קריוגני

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum (ER). However, the visualization of these mRNAs can be challenging. This is especially true when only a fraction of the mRNA is ER-associated and their distribution to this organelle is obstructed by non-targeted (i.e. "free") transcripts. In order to monitor ER-associated mRNAs, we have developed a method in which cells are treated with a short exposure to a digitonin extraction solution that selectively permeabilizes the plasma membrane, and thus removes the cytoplasmic contents, while simultaneously maintaining the integrity of the ER. When this method is coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH), one can clearly visualize ER-bound mRNAs by fluorescent microscopy. Using this protocol the degree of ER-association for either bulk poly(A) transcripts or specific mRNAs can be assessed and even quantified. In the process, one can use this assay to investigate the nature of mRNA-ER interactions.

Here we describe a method to visualize endoplasmic reticulum-associated mRNAs in mammalian tissue culture cells. This technique involves the selective permeabilization of the plasma membrane with digitonin to remove cytoplasmic contents followed by fluorescent in situ hybridization to detect either bulk poly(A) mRNA or specific transcripts.

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, and multiwell-based assays are used to measure transcription factor activity. However, these assays are nonquantitative, lack specificity, may involve the use of radiolabeled oligonucleotides, and may not be adaptable for the screening of inhibitors of DNA binding. On the other hand, using a quantitative DNA-binding enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA) assay, we demonstrate nuclear protein interactions with DNA using the RUNX2 transcription factor that depend on specific association with consensus DNA-binding sequences present on biotin-labeled oligonucleotides. Preparation of cells, extraction of nuclear protein, and design of double stranded oligonucleotides are described. Avidin-coated 96-well plates are fixed with alkaline buffer and incubated with nuclear proteins in nucleotide blocking buffer. Following extensive washing of the plates, specific primary antibody and secondary antibody incubations are followed by the addition of horseradish peroxidase substrate and development of the colorimetric reaction. Stop reaction mode or continuous kinetic monitoring were used to quantitatively measure protein interaction with DNA. We discuss appropriate specificity controls, including treatment with non-specific IgG or without protein or primary antibody. Applications of the assay are described including its utility in drug screening and representative positive and negative results are discussed.

We developed a quantitative DNA-binding, ELISA-based assay to measure transcription factor interactions with DNA. High specificity for the RUNX2 protein was achieved with a consensus DNA-recognition oligonucleotide and specific monoclonal antibody. Colorimetric detection with an enzyme-coupled antibody substrate reaction was monitored in real time.

כמותי Assay לחקר חלבון: אינטראקציות-DNA, רגולטורים גלו תעתיק של ביטוי גנים, ולזהות חומרים אנטי סרטניים רומן

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

ההדמיה confocal של הבזקים בודדים מיטוכונדריאלי Superoxide בלב שלם או<em&gt; בVivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video