This work is supported by the National Institutes of Health (NIH) grants R01DK093953 (X.L.), P30NS069271, BRFSG-2014-07 (X.L.). C.J. is partially supported by American Heart Associate pre-doctoral fellowship (14PRE20380168, to C.J.).

1. גיליון ממברנה הכנה קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גליונות קרום שכותרתו עם iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את קידוד פלסמיד דנ&quot;א iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 23 תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולריות סטנדרטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות INS-1 תאים על # 1.5 18 מ&quot;מ עגול coverslips מראש מצופה 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל פיברונקטין כדי 50-70% confluency הבאים פרוטוקולים תרבית תאים INS-1 תקן 38,39. Transfect התאים יום לאחר 50 עד 70% confluency הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Transfect עם iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 באמצעות מגיב transfection ליפוזום הבאים פרוטוקולים של היצרן. לאחר transfection, לאפשר לתאים לגדול במשך 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, coverslips מעיל (על-צד אחד) עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל של 500 מיקרוגרם / Poly-D- ליזין מ&quot;ל (PDL; מדולל ב DH 2 O) במשך 1-2 שעות. ואז לנקז PDL על ידי הצבת נייר טישו עלבקצה coverslip. מניחים את coverslips על צלחת מתכת מראש צונן (4 ° C) לשימוש מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים טרום טרנספקציה INS-1 גדל על coverslips עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל קר כקרח בופר פוספט מלוחים (PBS) המכיל 1 מ&quot;מ EGTA. חזור על לשטוף שלוש פעמים ומסננים PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את coverslips עם תאים בתרבית (תא בצד פונה כלפי מטה) על coverslips מצופה PDL על צלחת מתכת מראש צונן עם פינצטה. השאירו את הצלחת במקרר (4 מעלות צלזיוס) במשך 7 - 10 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף את coverslips מצופה PDL (איור 2). הערה: זמן הדגירה צריך להיות בטווח של 7 - 10 דקות עבור התקשרות טובה יותר של התאים על פני השטח מצופה PDL. סביבת המקרר יבשה דגירה לא צריכה להיות ארוכה מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את לוחית המתכת מהמקרר. לקלף בעדינות את coverslip המכיל את התאים מראש transfected באמצעות פינצטה. זה מייצר שכבה דקה של גיליון קרום התא עלPDL מצופה coverslip. לשטוף בעדינות את הסדינים הממברנה עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS ולאחר מכן לתקן עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל קר כקרח 4% paraformaldehyde (PFA) + 0.2 glutaraldehyde% (GA) ב PBS במשך 15 דקות ב 4 ° C. זהירות: Paraformaldehyde ו glutaraldehyde רעילים. לטפל בהם במנדף עם העור ומשקפי מגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, תמונה הסדינים קרום מיד (ראה סעיף 3) או לאחסן ב ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל PBS ב 4 ° C. הערה: לאחר תיקון גיליון הקרום, לא תהיה שיווי משקל מחייב של בדיקות PH מ cytosol ו- PI (4,5) P 2. בדיקות PH כבול תהיינה לנתק בהדרגה מגיליון הממברנה מפוזר לתוך התמיסה (למרות שזה עלול לקחת ימים עד שבועות). לכן, מומלץ תמונת הדגימות הקבועות מייד אחרי הכנת מדגם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן גליונות קרום עבור PI (4,5) P 2 תיוג נוגדן ספציפי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות INS-1 תאים על 1.5 #, 18 מ&quot;מ עגול coverslips מראש מצופה 30 &amp;# 181; g / ml פיברונקטין 50% מפגש -70%. תאים Transfect עם DNA פלסמיד למחרת כמתואר בשלב 1.1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים מ 1.1.4 ל 1.1.7 כמתואר לעיל. הערה: בצע את ההליכים הבאים ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את coverslips המכיל גיליונות PM קבוע שלוש פעמים עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל קר כקרח PBS המכיל 50 מ&quot;מ NH 4 Cl. להרוות את הסדינים עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל borohydride נתרן 0.1% ב PBS במשך 7 דקות, ולשטוף עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל PBS (ללא 50 מ&quot;מ NH 4 Cl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את דגימות עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל חסימת פתרון (פתרון PBS המכיל 5% (v / v) בסרום עז נורמלי, 5% (v / v אלבומין בסרום שור) ו -50 מ&quot;מ NH 4 Cl) במשך 45 דקות. ואז, דגירה עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל העיקרי PI (4,5) P 2 נוגדנים (1: 300 דילול) בחסימת פתרון עבור שעה 1. לשטוף שלוש פעמים (10 דקות בכל פעם) עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל PBS המכיל 50 מ&quot;מ NH 4 Cl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל משני F (ab &#39;) ועכבר 2-עז-אנטינוגדן מצומדות עם fluorophores (1: 300) בחסימת המאגר עבור שעה 1. לשטוף שלוש פעמים עם ~ 0.5 - 1 מ&quot;ל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות פוסט לתקן עם PFA 4% + 0.2% GA במשך 15 דקות, ולאחר מכן לשטוף דגימות שלוש פעמים עם PBS (7 דקות בכל פעם). המשך לסעיף 3 הדמיה או לאחסן ב ~ 0.5 ~ 1 מ&quot;ל PBS ב 4 ° C לשימוש מאוחר יותר. הערה: הכן דגימות ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש 4% PFA + 0.2% מקבע GA לשמר את החלוקה הפיזיולוגית של phosphoinositides ב PM. הכנה או קיבעון RT עם 4% PFA בלבד עלולה לגרום להפרעות משמעותיות (איור 4). </li></ol></li></ol> 2. הכנת תרבית תאים עבור Live- תא הדמיה עם δ1 mEOS3.1-PH PLC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פלסמיד דנ&quot;א המקודד את δ1 mEOS3.1-PH PLC כפי שתואר לעיל 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות INS-1 תאים על 1.5 18 מ&quot;מ # עגולים coverslips מראש מצופה 30 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פיברונקטין עד שהם מגיעים 50% -70% confluency בא פרוטוקולי תרבית תאי INS-1 תקן 38,39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, transfect תאים INS-1 עם PLC mEOS3.1-PH δ1 פלסמיד דנ&quot;א באמצעות מגיב transfection ליפוזום בעקבות פרוטוקול של ייצור. דגירה במשך 48 שעות לפני ההדמיה. </li></ol> 3. PALM רכישת תמונה של פחים ממברנות בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת התמונה PALM של גליונות הממברנה הערה: כאן, הקרינה השתקפות פנימית מוחלטת (TIRF) מיקרוסקופ מערכת מבוססת SMLM (שמן 100X, APO, NA = 1.49, WD 0.12 מ&quot;מ) 23 משמש לכל רכישת התמונה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הדמיה, לדלל 1 μl של פתרון חרוז ניאון ב 10 מ&quot;ל PBS + 50 מ&quot;מ MgCl 2. הוסף 200 μl מדולל פתרון לתוך תא הדמיה דגימות תאים המכילים (בצעדיו 1.1.8 / 1.2.6) במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשטוף עם PBS שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מערכת הדמיה PALM. בשנת תוכנת ההדמיה הקשורה, בחר &quot;בערוץ iRFP &amp;# 34; כפתור (642 ננומטר לייזר עירור, 700/75 ננומטר פליטה). מצא קרום התא להביע בדיקות PH בערוץ iRFP. הערה: גיליון הממברנה צריך חרוז ניאון בקרבת מקום. זה נדרש עבור תיקון להיסחף אחר כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלחצן &quot;הלכיד&quot; לאסוף תמונת TIRF קונבנציונלית של קרום התא בערוץ iRFP כהפניה לשיקום דמותה עתידי. הגדרת זווית TIRF נורמלית (כלומר, לאחר שהגיע הזווית הקריטית, להפוך -1.5 מעלות) על ידי הקלדת 2140 בזווית TIRF הגדרת הדמיה. השתמש זווית הגדרה זו עבור כל השלבים אלא אם צוין אחרת. הערה: במערכת TIRF המתוארת כאן, 3,500 היא הזווית האנכית עד 2,200 הוא הזווית הקריטית TIRF, ואת 2140 היא הזווית הנורמלית TIRF, המהווה 1.5 תואר יותר לאחר זווית קריטית TIRF. זווית TIRF הצרה שהוזכרה להלן ב 3.2.3 היא בגודל 2120, המהווה 2 אחר תואר לאחר שהגיע זווית קריטית TIRF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לערוץ PAmCherry1 ידי לחיצה הכפתור ערוץ דואר RFP (561 ננומטר עירור, 600/50 ננומטר מסנן פליטה). התאם את פס הגלילה בפנקס &quot;AOTF&quot; כל הדרך בצד ימין יש תאורה מלוא העוצמה של לייזר 561 ננומטר במשך 10-20 שניות כדי להלבין את הקרינה קרום ברקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הגדרת המצלמה האופטימלית (binning 2x2) בלשונית &quot;פורמט&quot; ואת פרוטוקול הרכישה מהיר בלשונית &quot;ND רצף הרכישה&quot; (בדרך כלל 10,000-40,000 תמונות ב 20 הרץ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל רכישת תמונות PAmCherry1 (561 ננומטר לייזר בהספק מלא, 50 msec / מסגרת) עם הפעלת לייזר סימולטני 405 ננומטר ברמה נמוכה (0.1% - 1%) על ידי לחיצה על כפתור &quot;הפעל כעת&quot;. התאם את עוצמת ליזר 405 ננומטר כדי שנקודות פרט מבודדות מרחבית בכל מסגרת ניתנות לזיהוי בקלות. הערה: מספר PAmCherry1 מולקולות activatable פוחת בהדרגה במהלך רכישה. 405 עוצמת ליזר ננומטר צריכה להיות בהדרגה כדי לשמור על הצפיפות האופטימלית של אותות מולקולה בודדים בכלמִסגֶרֶת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך רכישת תמונות עד אין אות מולקולת PAmCherry1 יחידה הופעל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמית PALM בתאים חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, לדלל חרוזי ניאון לתוך תא ההדמיה למשך 10 דקות כמתוארות בשלב 3.1.1. ואז להתחיל הדמית PALM ידי פתיחת תוכנת ההדמיה הקשורה. הערה: השתמש תא הדמיה מגנטית שחרור מהיר עבור דימות תאים חיים. לשמור על מרכז השדה הדמיה ב 35 ° C עם בקר טמפרטורה מתחת זלוף מתמיד עם חיץ תאיים (פתרון תאיים: 135 mM NaCl, 5.6 KCl מ&quot;מ, 2.6 מ&quot;מ CaCl 2, 1.2 מ&quot;מ MgCl 2, 3 גלוקוז מ&quot;מ, 20 מ&quot;מ HEPES; pH = 7.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלחצן ערוץ GFP (525/50 ננומטר פליטה). זהה את קרום התא להביע בדיקות ניאון מבוסס על ניאון ירוק mEOS3 תחת 488 עירור לייזר ננומטר. ודא כי חרוזי ניאון בקרבת מקום גם כלולים במהלך ההדמיה, שכן הוא נדרש מאוחר יותר עבור DRI מחוברתיקון רגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחצו על כפתור &quot;לכידת&quot; לאסוף תמונה TIRF של קרום התא mEOS3 ערוץ (ירוק) כדימוי התייחסות. השתמש תאורת עירור רדודה גל חולפת (לאחר שהגיע הזווית הקריטית, להפוך עוד 2 מעלות) על ידי הקלדת 2120 בזווית TIRF הגדרת הדמית תא חי. הערה: זו מקטינה את הקרינה מן mEos3-PH מאוגד ב cytosol סמוך קרום הפלזמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to &quot;ערוץ RFP&quot; כפתור (561 ננומטר עירור, 600/50 ננומטר פליטה). השתמש ליזר ננומטר מלא כוח 561 אקונומיקת קרינת רקע של סדיני הקרום עבור 10 ~ 20 שניות עם הגלילה של &quot;כרית AOTF&quot; (ראה 3.1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל רכישת התמונה על ידי לחיצה על כפתור &quot;הפעל כעת&quot; בערוץ אדום (561 ננומטר מלוא העוצמה, שקיעה ב- 10 msec / מסגרת של &quot;המצלמה&quot; הגדרת טאב) עם הפעלת לייזר סימולטני 405 ננומטר. התאם את עוצמת הלייזר 405 ננומטר להפעיל נקודות מופרדים מרחביתבכל מסגרת. הערה: ככל התמורה לרכישה, un-המרה mEOS3.1-PH PLC δ1 מספר מולקולה לאט פוחתת. בהדרגה להגדיל את כוח לייזר 405 ננומטר כדי לייעל את האות מולקולה בודדת. אורך רכישת ההדמיה תלוי במטרת הניסוי. לרכוש תמונות ברציפות במשך 5 דקות בתנאים רגילים. אם רכישה יותר נדרשת, לאסוף ערימות תמונה מרובות במקום ערימת תמונה אחת, גדולה. גודל הקובץ של כל ערימת תמונה לא יעלה על 4 GB או שזה ישפיע אנליזת תוכנה מאוחר יותר. </li></ol></li></ol> 4. עיבוד תמונה SMLM ושיקום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את קבצי תמונה (.tif ערימות תמונה) לתחנת ניתוח תמונה. הפעל את התוכנית שחזור תמונה (שנכתב מותאם אישית) ב- Matlab כפי שתואר לעיל 37 ו טען את ערימת התמונה על ידי לחיצה על הכרטיסייה &quot;קובץ&quot; בתפריט הראשי, ולאחר מכן &quot;פתח&quot;, ואז &quot;קובץ חדש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי locaLize אירועים מולקולריים בודדים מכל מסגרת. הגדר סינון סף עוצמת עם מספר הסף (1-10) ב &quot;אדוה&quot;. בדוק את הגדרות פרמטר האופטימליות לגילוי נקודת ראייה לפני השחזור. לאחר מכן עבור אל הכרטיסייה &quot;PALM&quot; ולחץ על &quot;תהליך צעד אחד&quot; להתחיל שחזור תמונה. הערה: עוצמת סף לגילוי נקודה הוא שרירותי ובלתי תלוי על ניסיון אישי. מספר מחקרים עשויים להידרש ליצור סף זיהוי אופטימלי כי לא מרימים מדי מוסמכות (DIM) נקודות ולא מסננת יותר מדי נקודות מוסמכות (בהירות). התאם ופרמטרים נוספים כדי לייעל ניתוח נתונים. כאן, מרחק בשכונה (נקודות קרינה במסגרות שהכנות במרחק משולבות) מוגדר 65 ננומטר (1/2 רוחב פיקסל) ותאים כמו מולקולה בודדת. מסגרות גאפ (אירועי מולקולה בודדים שהתרחשו במרחק מסגרות ושכונה אלה אוחדו מצויד כאירוע מולקולה בודד) הןלהגדיר כמו 26 מסגרות (1.3 שניות) עבור הדמיה PAmCherry1 40. התאם פרמטר אלה על פי המאפיינים של בדיקות מולקולה בודדות רכישה בשיעור להימנע יתר לספור 40 SMLM. לשים תיקון להיסחף עם חרוזי ניאון במהלך השחזורים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמית סדיני הממברנה הקבועים שכותרתו ידי iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1, לשחזר את ערימות תמונה כולה מאותו גיליון קרום לתמונה סופר-רזולוציה יחידה 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת דוגמיות תא החיות שכותרתו ידי mEOS3.1-PH PLC δ1, להפריד את ערימת התמונה כולה לתוך כמה ערמות קטנות של 1,000 מסגרות כך שניתן 1,000 רצופת מסגרת מחסנית משוחזרת כתמונת סופר-רזולוציה יחידה, אשר בעל רזולוציה זמנית של 10 שניות. בסופו של דבר, לשלב את כל התמונות בסדרה פעם לתוך ערימה בסדרת הגמר זמן 23. הערה: הדמית PALM לחיות תאים, מספר קטן של בדיקות מופעלות אסור לזוז או לניתקמ PI (4,5) P 2 PM לפני הלבנה. כדי להסביר את דגימת היתר של החלליות, לשלב אותות מולקולה בודדים במסגרות השכנה בתוך 130 ננומטר (במקום 65 ננומטר) לתוך אירוע פליטת יחיד במהלך ניתוח תמונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קבלת התמונות המשוחזרות, לבצע ניתוח תמונה עוד יותר עם התכנית האישית נכתב Matlab לכמת צפיפות מולקולה, צפיפות מייקרו-תחום / גודל, וניתוח אשכול עם מתאם זוג 41. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

לפתרון בעיות, שני תהליכים צריכים תשומת לב נוספת: ייצור גיליון הממברנה קיבעון מדגם. כפי שתואר בפרוטוקול, זמן הדגירה של coverslips בשלב 1.1.6 חשוב לייצור גיליון הממברנה. זמן דגירה אופטימלית תחת תנאי הניסוי שלנו הוא 7-10 דקות (איור 2). זמן רב יותר מאשר דגירת 10 דקות יהיה לייצר תאים שלמים במקום סדיני הקרום על coverslips PDL ו דגירה קצרה יוביל פחות או סדינים לא קרום על coverslips מצופה PDL. כפי שתואר בפרוטוקול, את fixatives וטמפרטורה במהלך קיבעון הם קריטיים לשמירה על חלוקת PI (4,5) P 2 PM. קיבוע ב RT או שימוש 4% -PFA לבדו יכול לעוות את חלוקת השומנים נורמלי PM. על ידי יישום מיקרוסקופיה PALM קרום לחקר ליפידים, אנו מסוגלים לקיים את חלוקת בקנה מידה ננומטרי של PI (4,5) P 2, phosphoinositide מפתח שמתווך מכל יסוד פעילות הסלולר. פריסה המרחבית זה של PI (4,5) P 2 עם מילויי ריכוז מוגבלים בתאי INS-1 מספקת מסגרת חשיבה מחודשת אינטראקציות שומני חלבון ואירועי איתות מקומיות של PI (4,5) P 2 בתאים אלה. יתר על כן, על פי שיטה בעבודה זו יכולה לחול גם על מחקר פוספוליפידים בממברנה אחר עם בדיקות נכונות, ובכך, מתן כלי רומן ללמוד phosphoinositides בתהליכים ביולוגיים. שימוש יריעות קרום בעבודה זו עוקף שני נושאים עיקריים מחקרים מורפולוגיים פוספוליפידים: טיפול דטרגנט וזיהום אות פוטנציאל מן cytosol. דטרגנטים לעיתים קרובות לגרום אשכולות ו אובדן משמעותי של אות פוספוליפידים PM. הזיהום של אות cytosolic הוא בעייתי במיוחד במקרה של phosphoinositides שפע הנמוך על 23 PM, כגון PI (3,4,5) P 3 ו PI (3,4) P 2. דגימות גיליון ממברנה מסוגלות circumvent הבעיות הללו מבלי לשבש מבנים משמעותיים הקשורים קרום הפלזמה, כגון meshwork יקטינו קליפת המוח ובורות מצופה clathrin 42,43. ההתפלגות הומוגנית היחסית של PI (4,5) P 2 PM היא בהסכם טוב עם מחקרי EM ההקפאה מהירים אחרים באמצעות GST-PH PLC בדיקות δ1 בקרום פיברובלסטים 44. חשוב לציין כי תנאי עיבוד מדגם פסולים יכולים לייצר תוצאות מטעות. ראשית, חשוב לבצע את פעולות קיבעון בטמפרטורה נמוכה יותר (4 ° C) ולהשתמש מקבע GA לייצור גיליון הממברנה. כפי שניתן לראות בתרשים 3, טמפרטורה חמה קיבעון PFA ללא GA אינה מספיקה כדי לתקן phosphoinositides ב PM התא. זה יכול לעוות את PI בשלמותה (4,5) P 2 הפצה וליצור אשכולות חדו כי לא נצפו בתאים חיים בתנאים פיסיולוגיים. שנית, השימוש של PAmCherry1 כמולחקור את SMLM, ולא בדיקות אחרות, הוא מכריע הדמיה PALM כמותית. היתרון של יישום PAmCherry1 מגיע מנכסים צילום פיזי מולקולרי יחיד היטב מאופיין שלה 35,40,45, כגון בהירות, יעילות צילום הפעלה גבוהה יותר מכל, מוגבלת מאוד צילום מהבהב. מאפיינים אלה מאפשרים לנו לחסל חפצי אשכול פוטנציאליים צילום המהבהב וכמותית לנתח את הצפיפות המולקולרית של PI הממברנה (4,5) P 2. גישה זו גם יש מגבלות. ראשית, שיטת גיליון הקרום השתמשה במחקר זה לא תחקה את חלוקת פיזיולוגיים מלאה של PI (4,5) P 2 כי התא מופר לפני ההדמיה. עם זאת, הדמית PALM לחיות שלנו מציגה את חלוקת הומוגנית יחסית דומה של PI (4,5) P 2, תומכות התוצאות שנצפו עם דגימות וכו הממברנה. שנית, כפי שדנו בעבודה הקודמת שלנו 23, SMLM דורש מומחיות הדמיה מיותר על חיפושtention להימנע חפצי הדמיה שעלולה להתעורר מתהליכים שונים, כוללים הבדיקות בשימוש, הכנת מדגם קיבעון, דגימת תמונה ושחזור. לבסוף, על פי בדיקות המבוססות על תחומי PH ונוגדנים היו בשימוש נרחב במחקרי phosphoinositide 46,47 אפשריים עדיין לא שכל PI (4,5) P 2 בקרום ניתן לאתרם באמצעות גישה זו. לדוגמא, PI (4,5) P 2 מחויבי חלבונים אנדוגניים אחרים עשוי לא להיות נגיש בדיקות PH או נוגדנים, וזה עלול לגרום הערכה נמוכה מדי של PI (4,5) P 2 בשל הפרעת השטח של לחקור את עצמם. דרך חלופית של PI תיוג (4,5) P 2 תהיה באמצעות Top-פלואוריד PI (4,5) P 2 48, אנלוגי P 2 מראש שכותרתו PI (4,5) עם שינוי על הזנב של המקורי PI (4,5) P 2. עם זאת, ניתן להמיר במהירות לתוך תת phosphoinositide אחרות של חילוף החומרים בתא חי מהר מאז טבעת אינוסיטול שלה זהה endogenouPI של (4,5) P 2. זה מעלה את החשש אם PI מראש שכותרתו זה (4,5) אנלוגי P 2 בתאים חיים יכול לייצג נאמנה PI (4,5) P 2 ולא מוצרים מטבולית שלה. לכן, למרות מספר מגבלות, בדיקות המבוססות על תחומי PH עדיין בין הבדיקות הטובות ביותר כי כבר בשימוש נרחב כדי לפקח PI (4,5) הפצת P 2 ודינמיקה על ראש ממשלת תאים. היישום העתידי של מתודולוגיה זו ניתן להרחיב את לימודי phosphoinositide אחרים, כגון PI (3,4,5) P 3 ו PI (3,4) P 2. לסיכום, גישת SMLM הרומן משמשת כאן פותחת דרכים חדשות ללמוד phosphoinositide בתאים. באמצעות PI (4,5) P 2 כדוגמה, אנחנו מדגימים את המאפיינים הייחודיים של הדמיה PALM במחקר מורפולוגי וכמותית של מולקולות קרום התא, כמו גם חסרונות. גישה זו ניתן להתאים מולקולות אחרות של אינטרסים יהיו יישומים רחבים בביולוגיה של תא.

Phosphoinositides לתרום חלק קטן של ליפידים קרום מוחלטים, אבל תפקיד קריטי במגוון של תהליכים תאיים. הם כוללים שבעה חברים נגזרו זירחון הפיך או dephosphorylation של הטבעות אינוסיטול על 3 rd, 4 וה 5 עמדות ה 1. Phosphatidylinositol 4-פוספט (PI4P) ו 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol (PI (4,5) P 2) הם שני phosphoinositides העיקריים שפועלים יחסית באופן עצמאי כמו שומנים הקובע של קרום התא התא (PM) 2,3. Phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate (PIP 3) הוא הרבה פחות בשפע מאשר PI4P ו PI (4,5) P 2, אבל יש לו פונקציות ייחודיות בתהליכים תאיים שונים כולל סרטן 4 וסוכרת 5. יש שומנים אלו אינטראקציות מולקולריות מורכבות עם effectors שלהם וחלבונים רבים אחרים. לכן, חשוב להבין את הארגון המרחבי של Pho אלהsphoinositides ב PM על בקנה מידה ננומטרי. ראיות מצטברות הראו כי קומפלקסי חלבונים או אשכולות מולקולה בתחומי PM המוקפים יכולים לשמש איתות 6 נקודות חמות. לדוגמה, 1a syntaxin, חלבון מפתח המווסת היתוך קרום 7-9, מציג ארגון מצרר PM. להבדיל מן הקונצנזוס של ארגון אשכול 1a syntaxin, הפריסה המרחבית של phosphoinositides ב PM שנויה במחלוקת. PI (4,5) דפוסי התפוצה P 2 נע בין אחיד 10-12, כתמים גדולים 13,14, כדי צפוף אשכולות 14-18, תלוי סוגי תאים ושיטות הניסוי נעשה שימוש. הארגון המרחבי של PI (4,5) P 2 ברזולוציה גבוהה יותר הוא גם לא עקבי. מחקר באמצעות מגורה פליטת-דלדול (STED) מיקרוסקופיה 19 חשף מספר רב של PI צפופה (4,5) P 2 ננו-אשכולות (~ 73 ננומטר קוטר) בין הסדינים PM של PC-12 תאים 20 </sעד&gt;. תוצאה זו שונה ממחקרים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני הקפאה מהירים (EM) 21,22, גישה השומרת על מבנה PM השלם של תאי חיים הרבה יותר טוב מאשר קיבוע כימי. הלה הראה בריכות נפרדות של PI (4,5) P 2; PI המרוכז יחסית (4,5) P 2 בבורות caveolae ומצופות וכן התפלגות אחידה על אזור PM השטוח. יתר על כן, PI ננומטריים (4,5) P 2 ארגון בסדינים הממברנה עשוי להיות שונה בתאי חיים קבועים. העבודה האחרונה שלנו הנושא הזה חקר בשני תאים קבועים ולחיות INS-1 באמצעות מיקרוסקופ לוקליזציה מולקולה בודדת (SMLM) 23. SMLM מבוסס על stochastically מיתוג בקבוצה קטנה בלבד של fluorophores בכל זמן נתון, כך יכול להיות מקומי fluorophores פרט עם דיוק גבוה. רבים גישות הדמיה סופר-רזולוציה פותחו באמצעות עקרונות דומים לעלות לגבול השתברות של מיקרוסקופ אור קונבנציונלי, כזהים photoactivation מיקרוסקופיה לוקליזציה (PALM) 24, הקרינה מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (FPALM) 25, מיקרוסקופיה אופטית שחזור סטוכסטיים (STORM) 26,27 ו STORM ישירה (dSTORM) 28. עם תמונה להחלפה או fluorophores photoactivatable (צבעים או חלבוני ניאון), טכניקות SMLM לאפשר למדענים מבנים ביולוגיים תמונה ברזולוציה ננומטר 24,29,30 עם וידאו שער בתאים חיים 31,32. באמצעות PI (4,5) P 2 כדוגמה, הצגנו את הגישה SMLM לחקור את הפיזור ננומטריים של phosphoinositides על PM. התחום PH של PLCδ1 (δ1 פוספוליפאז C) שקושר במיוחד כדי PI (4,5) P 2 הוא בדיקה ומבוססת עבור PI הדמיה (4,5) P 2 חלוקת המשנה הסלולר דינמיקה 33,34 ב PM . גנטיים אנחנו תייגנו תחום זה עם שני חלבוני ניאון, PAmCherry1 35 iRFP 36 </sup&gt; לייצר חלבון היתוך כפול צבע (iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1) (איור 1A-B). PAmCherry1 משמש החללית photoactivatable של תחום PH עבור דקל iRFP משמש כאינדיקטור בכלל לזהות תאים transfected לפני רכישת PALM . אנחנו מיישמים בדיקת ניאון כפול צבע זה הדמית SMLM בין סדיני הממברנה הקבועים. עבור הדמית PALM חייה, אנו מתויגים mEOS3 37 במקום PAmCherry1 לתחום PH PLCδ1 ליצור חללית mEOS3.1-PH PLCδ1 ליעילות ובהירויות הפוטון הטוב שלו (איור 1 ג-ד). הדמיה SMLM עם בדיקות הרומן אלה ראש ממשלת מפרישי אינסולין INS-1 תאים 38 חשף תיוג הומוגנית של PI (4,5) P 2 ברוב האזורים PM וכן PI מרוכז (4,5) P 2 microdomains כי מתערבבים בדלילות בתחומים PM שטוח וכמה מבנים דמויי filopodia 23. נההפצת noscale של PI (4,5) P 2 מספקת בסיס מבני חשיבה מחודש כיצד הוא מתפקד בתאים חיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="791">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;">Ti-U</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">sCMOS camera</td>
			<td style="width:199px;">Andor</td>
			<td style="width:184px;">Neo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spinning disk</td>
			<td style="width:199px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:184px;">CSU X-1, 10,000 rpm&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">&#160;High Power Monolithic Laser Combiner SP with 405, 488, 561 and 642 nm lasers.</td>
			<td style="width:199px;">Agilent</td>
			<td style="width:184px;">MLC400</td>
			<td style="width:193px;">laser original powers &#38; powers at the end of optical fiber) 
			405nm: 15 mW &#38; 13 mW; 
			488nm: 45 mW &#38; 42 mW; 
			561nm: 45 mW &#38; 40 mW; 
			640nm: 35 mW &#38; 16 mW.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">100X Objective</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td>APO 100X Oil, NA 1.49, WD 0.12mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nikon acquisition and analysis software(NIS Element)</td>
			<td style="width:199px;">Nikon</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Matlab</td>
			<td style="width:199px;">MathWorks</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coverslip</td>
			<td style="width:199px;">Warner</td>
			<td style="width:184px;">64-0714</td>
			<td>Round 18mm coverslip, #1.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td style="width:184px;">FC010-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Lipofectamin 3000(transfection reagent)</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">L3000-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:184px;">#16120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PI(4,5)P2 1st antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">secondary antibody&#160; F(ab&#8217;)2-goat-anti-mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td>A-21237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tetraspeck beads</td>
			<td style="width:199px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:184px;">T7279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">magnetic quick release imaging chamber&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:184px;">Cat#641994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">temperature controller</td>
			<td style="width:199px;">Warner Instruments</td>
			<td>TC-344C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EGTA</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">3780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NH4Cl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A0171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Goat serum</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KCl</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CaCl2*2H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:184px;">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MgCl2*6H2O</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">M9272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">H4034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Paraformaldyhyde</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:184px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule super-resolution imaging of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the plasma membrane with novel fluorescent probes

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a determinant phosphoinositide of the plasma membrane (PM), and it is required to modulate ion channels, actin dynamics, exocytosis, endocytosis, intracellular signaling, and many other cellular processes. However, the spatial organization of PI(4,5)P2 in the PM is controversial, and its nanoscale distribution is poorly understood due to the technical limitations of research approaches. Here by utilizing single molecule localization microscopy and the Pleckstrin Homology (PH) domain based dual color fluorescent probes, we describe a novel method to visualize the nanoscale distribution of PI(4,5)P2 in the PM in fixed membrane sheets as well as live cells.

חוסר הוודאות לוקליזציה (σ) של מערכת סופר-רזולוציה שלנו הוא 14.73 23 ננומטר. השוואה ישירה בין TIRF ותמונות PALM הפגינו שיפור משמעותי של רזולוציה מרחבית. איור 3 א-ב &#39;מראה את התמונות PI (4,5) P 2 TIRF נציג שכותרתו עם PI (4,5) נוגדן P 2 ו iRFP-PAmCherry1-PH PLC δ1 בסדינים קרום טיפוסי תאים חיים. התמונות עם מיקרוסקופיה TIRF קונבנציונאלי בסדינים קרום דומות להפליא לאלה תאים שלמים חיים שכותרתו עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (EGFP) מתויג תחומים PH (EGFP-PH PLCδ1) (איור 3 ג). כל הדגימות הראו חלוקה שווה של בדיקות. לעומת זאת, קיבעון הלא אופטימלי של הדגימות הביא PI הצפופה החדה (4,5) P 2 אשכולות וירידה בעוצמת אות (איור 4). בתנאי קיבעון אופטימליים, tהוא תמונות ברזולוצית סופר של PI (4,5) P 2 תאים קבועים (איור 5) חשף חלוקה הומוגנית של בדיקות ב חלק ניכר של אחר הצהריים עם מילויי ריכוז מוגבלים בלבד. כמה תיקוני קרום מועשרים PI (4,5) P 2 בדיקות חולקו בדלילות היו בגדלים שונים. תמונות PALM תא חי להציג חלוקה מרחבית דומה לזו של תאים קבועים (איור 6). ניתוח מפורט של PI (4,5) P 2 אותות מעל תוצאות בזמן בדינמיקה מהירה באזורים מקומיים, ללא שינויים משמעותיים השפע שלהם באזורים רחבים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig1.jpg" /> Scheme באיור 1. עבור בדיקות ניאון נעשה שימוש במחקר זה. (AB) iRFP-PAmCherry1-PH החללית δ1 PLC המשמשים בניסויים גיליון הממברנה קבוע. במהלך הדמיה TIRF קונבנציונאלי (א), 640 ננומטר<html> לייזר משמש כדי לעורר את iRFP (Ex: ננומטר 692; Em: 713 ננומטר). תמונה TIRF נלקח במצב זה משמש כתמונת התייחסות TIRF הדמיה סופר-רזולוציה מתקבל על ידי הדמיה PALM (B). לייזר 405 ננומטר משמש צילום להפעיל את fluorophore PAmCherry1 ו לייזר 561 ננומטר משמש כדי להלהיב PAmCherry1 (Ex: 564 ננומטר; Em: 595 ננומטר) עבור הדמיה PALM. (CD) mEos3.1-PH חללית PLCδ1 המשמש בניסויי התא החיים. (ג) במהלך הדמיה TIRF קונבנציונאלי, לייזר 488 ננומטר משמש כדי להלהיב mEOS3.1 (Ex: 506 ננומטר; Em: 519 ננומטר). (ד) לאחר photoconversion ידי ליזר 405 ננומטר, mEos3.1 הופך בצורה האדומה (Ex: 573 ננומטר; Em: 584 ננומטר). ו ליזר 561 ננומטר משמש לרכישות PALM <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a> s / ftp_upload / 54,466 / 54466fig2.jpg &quot;/&gt; Scheme איור 2. להכנת גיליון קרום מ INS-1 תאים. (א) מניחים את coverslip עם תאים בתרבית פונה כלפי מטה על coverslip מצופה PDL ולחכות 7 ~ 10 דקות ב 4 ° C כדי לאפשר התקשרות התא אל PDL- coverslip מצופה. (ב) לקלף את coverslip העליון עם פינצטה ולתקן את גיליון הקרום מצורף coverslip מראש צופה PDL. (C) תמונה הדגימות עם TIRFM ופאלם. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig3.jpg" /> PI איור 3. (4,5) P 2 הארגון המרחבי דומה בין הסדינים הממברנה בתאים חיים שלמים תחת מיקרוסקופ TIRF קונבנציונאלי. (א)תמונת TIRF הטיפוסית של גיליונות הממברנה קבוע ב 4 ° C עם PFA 4% 0.2% GA. PI (4,5) P 2 סומן עם PI (4,5) P 2 נוגדן ספציפי. (ב) גיליון קרום מהתא INS-1 להביע iRFP-PAmCherry1-PH δ1 PLC. (C) תמונה TIRF של שני תאים שלמים לחיות להביע PLCδ1 EGFP-PH ברמות שונות. ברי סולם: (א): 3 מיקרומטר; (ב) ו- (ג):. 5 מיקרומטר <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig4.jpg" /> איור 4. PI (4,5) P 2 ארגון המרחבי בסדיני קרום רגיש לתנאי קיבעון משותפים. (א) גיליונות ממברנה קבועים על 37 מעלות צלזיוס עם 4% PFA לבדומסומן עם PI (4,5) P 2 נוגדנים ספציפיים (כמו באיור 3 א). (ב) ממברנה גיליון קבוע ב RT עם PFA לבד ומסומן עם PI (4,5) P 2 נוגדן ספציפי. ראוי לציין, כי אשכולות צפופים של PI (4,5) בדיקות P 2 גלויים לעין תחת מיקרוסקופ TIRF, בניגוד תמונות הקרינה אפילו הרבה יותר לראות באיור 3 א. ברי סולם: AB:. 3 מיקרומטר <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig5.jpg" /> איור 5. PALM הדמיה של PI (4,5) P 2 בדיקות מגלה הפצה בקנה מידה ננומטרי שלהם בתוך PM תא INS-1. (א) התמונה iRFP TIRF של גיליון קרום מתא INS-1 להביע iRFP-PAmCherry1-PH PLCδ1. (ב) מקביל תמונה בכף PM באותו האזור המבוסס על שחזור אות PAmCherry1. שימו לב PI הומוגנית (4,5) P 2 הפריסה המרחבית באזורים PM הגדולות וכמה PI (4,5) P 2 microdomains. (ג) תצוגה מוגדלת של האזור התאגרף (B). החצים מצביעים בדלילות microdomains PM מועשר PI (4,5) P 2 בדיקות. ברי סולם: A ו- B: 3 מיקרומטר; C: 500 ננומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54466/54466fig6.jpg" /> איור 6. הדמיה PALM בתאים INS-1 בשידור חי. (א) TIRF תמונה של PI (4,5) P 2 בתוך תא חי INS-1 להביע mEos3.1-PH PLCδ1. התמונה נרכשה במהירות במסלול הירוק לפני רכישת PALM (35 מעלות צלזיוס). (ב) Sequential לחיות תאים תמונות PALM ב -10 מרווח שניות. ריבועי להראות את הפרופילים העוצמים PI המקומי (4,5) צפיפות P 2 יחד באותה התנוחה ישר קו 1 במועדים שונים (ב) ו- (ג). הערת השינויים בעוצמת המקומית הגדולים שלהם בתוך 10 שניות. (ד) זמן כמובן של שינויי העצמה הממוצעים של PI (4,5) P 2 באזור הגדול (BOX2, מיקרומטר 3x3) ו עיגולים קטנים (3, 4, ו -5, 500 בקוטר ננומטר) ב (ב) במהלך 5 דקות של הדמית PALM (מסגרת / 10 שניות). הערת התנודות העוצמות המהירות של PI המקומי (4,5) P 2 בדיקות (עיגול 3, 4 ו -5) לעומת שינויים קטנים מאוד בתחום הרחב (התיבה 2). (ה) תמונות PALM המוגדל של אזור BOX2 (ב &#39;), במועדים מצוינים. החצים מצביעים PI (4,5) P 2 טלאים קרום מועשר לחץ ליצתנאי hysiological. ברי סולם: C: 3 מיקרומטר; E: 500 ננומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54466/54466fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes at JoVE.com

Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פלזמה ב ננומטר סולם .

הדמיה סופר-רזולוציה מולקולה בודדת של 4,5-bisphosphate phosphatidylinositol בקרום פלזמה עם רומן פלורסנט בדיקות

Phosphoinositides in the cell membrane are signaling lipids with multiple cellular functions. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) is a ...

single-molecule-super-resolution-imaging-phosphatidylinositol-45

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.4K Views.  University of Wisconsin-Madison.  PI (4,5) P 2 מסדיר פונקציות סלולריות שונות, אך הארגון ננו שלה בקרום פלזמת התא הוא הבין היטב. על ידי PI תיוג (4,5) P 2 עם בדיקה ניאון כפול צבע התמזגו תחום Pleckstrin הומולוגיה, אנו מתארים גישה חדשנית ללמוד את PI (4,5) P 2 הפריסה המרחבית בקרום פל?...

Video: Single-molecule Super-resolution Imaging of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in the Plasma Membrane with Novel Fluorescent Probes

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule level in multiparameter fluorescence detection (MFD) mode is presented here. MFD maximizes the usage of all &#34;dimensions&#34; of fluorescence to reduce photophysical and experimental artifacts and allows for the measurement of interdye distance with an accuracy up to ~1 &#197; in rigid biomolecules. This method was used to identify three conformational states of the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor to explain the activation of the receptor upon ligand binding. When comparing the known crystallographic structures with experimental measurements, they agreed within less than 3 &#197; for more dynamic biomolecules. Gathering a set of distance restraints that covers the entire dimensionality of the biomolecules would make it possible to provide a structural model of dynamic biomolecules.

A protocol for high-precision FRET experiments at the single molecule level is presented here. Additionally, this methodology can be used to identify three conformational states in the ligand-binding domain of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor. Determining precise distances is the first step towards building structural models based on FRET experiments.

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage by extracellular oxidants. This process of transporting electrons from intracellular reductants to extracellular oxidants is not well defined. Here we present spectrophotometric assays by C2C12 myotubes to monitor tPMET utilizing the extracellular electron acceptors: water-soluble tetrazolium salt-1 (WST-1) and 2,6-dichlorophenolindophenol (DPIP or DCIP). Through reduction of these electron acceptors, we are able to monitor this process in a real-time analysis. With the addition of enzymes such as ascorbate oxidase (AO) and superoxide dismutase (SOD) to the assays, we can determine which portion of tPMET is due to ascorbate export or superoxide production, respectively. While WST-1 was shown to produce stable results with low background, DPIP was able to be re-oxidized after the addition of AO and SOD, which was demonstrated with spectrophotometric analysis. This method demonstrates a real-time, multi-well, quick spectrophotometric assay with advantages over other methods used to monitor tPMET, such as ferricyanide (FeCN) and ferricytochrome c reduction.

The goal of this protocol is to spectrophotometrically monitor trans-plasma membrane electron transport utilizing extracellular electron acceptors and to analyze enzymatic interactions that may occur with these extracellular electron acceptors.

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a fluorescent dye and are spotted by a photodetector following their separation. Single molecule fluorescence imaging can provide ultrasensitive protein detection with its ability for visualizing individual fluorescent molecules. However, the application of this powerful imaging method to electrophoresis assays is hampered by the lack of ways to characterize the homogeneity of fluorescent labeling of each protein species across the proteome. Here, we developed a method to evaluate the labeling homogeneity across the proteome based on a single molecule fluorescence imaging assay. In our measurement using a HeLa cell sample, the proportion of proteins labeled with at least one dye, which we termed &#8216;labeling occupancy&#8217; (LO), was determined to range from 50% to 90%, supporting the high potential of the application of single molecule imaging to sensitive and precise proteome analysis.

Here, we present a protocol to assess the labeling homogeneity for each protein species in a complex protein sample at the single molecule level.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary mechanism of amyloid aggregate-induced toxicity in neurodegenerative diseases. However, most reports describing the mechanisms of membrane disruption are based on phospholipid model systems, and studies directly targeting events occurring at the level of biological membranes are rare. Described here is a model for studying the mechanisms of amyloid toxicity at the membrane level. For mitochondrial isolation, density gradient medium is used to obtain preparations with minimal myelin contamination. After mitochondrial membrane integrity confirmation, the interaction of amyloid fibrils arising from &#945;-synuclein, bovine insulin, and hen egg white lysozyme (HEWL) with rat brain mitochondria, as an in vitro biological model, is investigated. The results demonstrate that treatment of brain mitochondria with fibrillar assemblies can cause different degrees of membrane permeabilization and ROS content enhancement. This indicates structure-dependent interactions between amyloid fibrils and mitochondrial membrane. It is suggested that biophysical properties of amyloid fibrils and their specific binding to mitochondrial membranes may provide explanations for some of these observations.

Provided here is a protocol for investigating the interactions between native form, prefibrillar, and mature amyloid fibrils of different peptides and proteins with mitochondria isolated from different tissues and various areas of the brain.

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Production of Dynein and Kinesin Motor Ensembles on DNA Origami Nanostructures for Single Molecule Observation

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and others. Many of these functions require motors to operate in ensembles. Despite a wealth of knowledge about the mechanisms of individual cytoskeletal motors, comparatively less is known about the mechanisms and emergent behaviors of motor ensembles, examples of which include changes to ensemble processivity and velocity with changing motor number, location, and configuration. Structural DNA nanotechnology, and the specific technique of DNA origami, enables the molecular construction of well-defined architectures of motor ensembles. The shape of cargo structures as well as the type, number and placement of motors on the structure can all be controlled. Here, we provide detailed protocols for producing these ensembles and observing them using total internal reflection fluorescence microscopy. Although these techniques have been specifically applied for cytoskeletal motors, the methods are generalizable to other proteins that assemble in complexes to accomplish their tasks. Overall, the DNA origami method for creating well-defined ensembles of motor proteins provides a powerful tool for dissecting the mechanisms that lead to emergent motile behavior.

The goal of this protocol is to form ensembles of molecular motors on DNA origami nanostructures and observe the ensemble motility using total internal reflection fluorescence microscopy.

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Cytoskeletal motors are responsible for a wide variety of functions in eukaryotic cells, including mitosis, cargo transport, cellular motility, and ...

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve intracellular structures and the dynamics of biomolecules with ~20 nm precision. A prerequisite for SMLM are fluorophores that transition from a dark to a fluorescent state in order to avoid spatio-temporal overlap of their point spread functions in each of the thousands of data acquisition frames. BODIPYs are well-established dyes with numerous conjugates used in conventional microscopy. The transient formation of red-shifted BODIPY ground-state dimers (DII) results in bright single molecule emission enabling single molecule localization microscopy (SMLM). Here we present a simple but versatile protocol for SMLM with conventional BODIPY conjugates in living yeast and mammalian cells. This procedure can be used to acquire super-resolution images and to track single BODIPY-DII states to extract spatio-temporal information of BODIPY conjugates. We apply this procedure to resolve lipid droplets (LDs), fatty acids, and lysosomes in living yeast and mammalian cells at the nanoscopic length scale. Furthermore, we demonstrate the multi-color imaging capability with BODIPY dyes when used in conjunction with other fluorescent&#160;probes. Our representative results show the differential spatial distribution and mobility of BODIPY-fatty acids and neutral lipids in yeast under fed and fasted conditions. This optimized protocol for SMLM can be used with hundreds of commercially available BODIPY conjugates and is a useful resource to study biological processes at the nanoscale far beyond the applications of this work.&#160;

Conventional BODIPY conjugates can be used for live-cell single-molecule localization microscopy (SMLM) through exploitation of their transiently forming, red-shifted ground state dimers. We present an optimized SMLM protocol to track and resolve subcellular neutral lipids and fatty acids in living mammalian and yeast cells at the nanoscopic length scale.

קונבנציונלי BODIPY מעלה שערים עבור מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה ומעקב יחיד מולקולה

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed extensive studies of cap-dependent translation and its regulation, high resolution kinetic characterization of this translation pathway is still lacking. Recently, we developed an in vitro assay to measure cap-dependent translation kinetics with single-molecule resolution. The assay is based on fluorescently labeled antibody binding to nascent epitope-tagged polypeptide. By imaging the binding and dissociation of antibodies to and from nascent peptide&#8211;ribosome&#8211;mRNA complexes, the translation progression on individual mRNAs can be tracked. Here, we present a protocol for establishing this assay, including mRNA and PEGylated slide preparations, real-time imaging of translation, and analysis of single molecule trajectories. This assay enables tracking of individual cap-dependent translation events and resolves key translation kinetics, such as initiation and elongation rates. The assay can be widely applied to distinct translation systems and should broadly benefit in vitro studies of cap-dependent translation kinetics and translational control mechanisms.

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Tracking individual translation events allows for high-resolution kinetic studies of cap-dependent translation mechanisms. Here we demonstrate an in vitro single-molecule assay based on imaging interactions between fluorescently labeled antibodies and epitope-tagged nascent peptides. This method enables single-molecule characterization of initiation and peptide elongation kinetics during active in vitro cap-dependent translation.

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

הדמיה של מולקולה בודדת של עיבוי EWS-FLI1 המורכב על DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...