The work was funded by the Fund for Medical Research and Education, Wayne State University, Detroit, MI.

1. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3x10 Seed 5 תאים HUVEC ב 10 מ&quot;ל של מדיום הגידול להשלים 10 בבקבוק 75 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 כדי מפגש 70-80%. </li></ol> 2. Assay גיבוש אבובית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשרה או המטריצה ​​מופחתת-factor (GFR) הצמיחה התאית או תאי מטריקס רגיל לילה על קרח על 4 מעלות צלזיוס. הערה: למען הקיצור &#39;מטריקס&#39; מעתה לשמש כפנייה היא GFR ו מטריקס רגיל. התהליך כדי להכין אותם הוא זהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור תרבות צלחות 96-היטב על קרח, ולהוסיף 50 μl של מטריקס מצונן היטב לכל משתמש טיפים מראש מקורר. הכן בשלושה עותקים של 5 בארות המכילות רק את תאי מטריקס הרגיל. הכן בשלושה עותקים אחרים של 5 בארות המכילות תאי מטריקס GFR בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת צלחת 96-היטב על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את HUVECsפעם עם פתרון שנאגרו-פוספט ללא סידן ומגנזיום (PBS), ולהוסיף 0.05% 1 מ&quot;ל טריפסין-EDTA. דגירת הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1-5 דקות, בדיקת התאים מכל רגע עד לעגל כלפי מעלה רוב התאים. לסלק את התאים על ידי הקשה על בקבוקון פעם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסיפו 5 מיליליטר בינוני בסיס (כלומר, מדיום גידול תא האנדותל בלי כלום (למשל, ספקים) אינם במקור) עם 1% עוברי שור סרום (FBS). אוספים את התאים בבקבוק ידי pipetting ולהעביר צינור 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות עם 2 מ&quot;ל בינוני הבסיס, לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ולהתאים את ריכוז התאים 2-3 x 10 5 תאים / מ&quot;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 μl של מעכב CXCR2 10x ריכוזי הבאים SB225002 במדיום הבסיסי: 11 מיקרומטר, 5.6 מיקרומטר, 1.1 מיקרומטר, 0.56 מיקרומטר ו 0 מיקרומטר (שליטה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 300 μl של ההשעיה HUVEC לתוך כל 5 micrצינורות ocentrifuge. להוסיף 33 μl של ריכוזי מעכב (11 מיקרומטר, 5.6 מיקרומטר, 1.1 מיקרומטר, 0.56 מיקרומטר ו 0 מיקרומטר) לתוך צינור אחד בכל המכיל את HUVECs, ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 50 μl של כל אחד המתלים תא (1-1.5 x 10 4 תאים) כדי בארות בודדות של מטריקס. פלייט כל השעיה בשלושה עותקי דגירה במשך 4-16 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4-16 שעות, לקחת 4 תמונות של הצינורות יצרו לכל טוב באמצעות מצלמת מיקרוסקופ הפוכה 11 (גדלה מקורית x 100). </li></ol> 3. Assay שיבוש אבובית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את תאי מטריקס וצלחות פי מפרט זהה גיבוש Tube Assay (שלבים 2.1 עד 2.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ההשעיה HUVEC כמתואר בשלבים 2.4- 2.4.2 של היווצרות צינור Assay ו aliquot לתוך צלחת 96-היטב המכיל את תאי מטריקס ב 50 μl לכל טוב. הערה: פלייט של בארות מספיקo כי יש 3 בארות לכל טיפול תרופתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים על תאי מטריקס עבור 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קח תמונות לפני תחילתו של טיפול תרופתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ריכוזי 2x של SB225002 מעכב CXCR2 כמתואר שלב 2.5 של assay היווצרות צינור, ולהוסיף 50 μl של כל ריכוז לכל טוב של 96 את הצלחת היטב המכיל את HUVECs. פלייט כל ריכוז בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצליחה במשך 2-12 שעות אחרות על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. קח 4 תמונות של הצינורות נוצרו בכל טוב באמצעות מצלמת מיקרוסקופ הפוכה (גדלה מקורית × 100) 11. </li></ol> 4. כימות נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת היווצרות צינור שנתפסו בתמונות על ידי מדידת אורך הצינור הכולל של צינורות בארבעה תחומים מיקרוסקופיים אקראי באמצעות תוכנת המצלמה מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה בתוכנת מצלמת מיקרוסקופ, ולחץ על &#39;הסברים ומדידות9 ;. בקטע &#39;אורך&#39;, בחרו בכלי &#39;קו פשוט&#39;. הקישו על התמונה, ואז למתוח קו לאורכו של הצינור, ואז קליק ימני. הערה: התוכנה תחשב אוטומטית את האורך של הקו בפיקסלים ולשים את הנתונים לקובץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על התהליך עבור כל קווי הצינור בתמונה על ידי בחירת הכלי &#39;קו פשוט&#39;. הקישו על התמונה, ואז למתוח קו לאורכו של הצינור, ואז קליק ימני. הערה: התוכנה תתעד את אורכו של כל קו ולהציג את הנתונים על המסך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי בדיקת כל צינור בתמונה, לחץ על &#39;יצוא&#39;, ולאחר מכן בחר &#39;אורך לגיליון אלקטרוני&#39;. הערה: הנתונים אורך ייוצאו גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את כל אורכי הצינור מתוך הגיליון האלקטרוני כדי לקבל את אורך הצינור הכולל. חישוב ולהקליט את האורך הממוצע של החצוצרות. הערה: ארבעה משכפל מומלץ עם ממוצע וסטיית תקן שנקבע. </li></ol> 5. תאים כאשר התאוששו מן התרבות תא מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות ולבצע assay היווצרות צינור (ראה סעיף 2) בקנה מידה גדול יותר כמו צלחת 96 גם לא תניב ספירת תאי מספיק. במשך 12 צלחות היטב, השתמש 500 μl של מטריקס ו 500 μl של השעית תא HUVEC (1.5x10 5 תאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת התאים למשך 4-16 שעות כדי להרכיב צינורות. ואז, לשאוב את מדיום תרבית תאים. יש לשטוף את התאים עם 1 מ&quot;ל של PBS 1x קר ללא סידן ומגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של קרח קר PBS-2.5 mM EDTA חיץ על תרבות ולשמור על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסלק את התאים תערובת תאי מטריקס מצלחת באמצעות קצה פיפטה 1,000 μl עם קצה לחתוך, ולאחר מכן להעביר צינור 15 מ&quot;ל קר, לשטוף היטב עם 4 מ&quot;ל של קרח קר PBS-2.5 mM EDTA ולשים לתוך הצינור . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכניסים את הצינורות על קרח למשך 1-4 שעות ו להפוך את הצינור כמה פעמים עד שכל תאייםמטריקס נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 1,620 XG ב 0 ° C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות את כדורי תא עם 1 מ&quot;ל קר PBS לצינור 1.ml על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגות שוב במשך 5 דקות ב 3000 XG ב 0 מעלות צלזיוס, אז להשליך את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את התאים -80 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Sharma, B., Nawandar, D. M., Nannuru, K. C., Varney, M. L., Singh, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CXCR2+enhances+chemotherapeutic+response,+inhibits+mammary+tumor+growth,+angiogenesis,+and+lung+metastasis.">Targeting CXCR2 enhances chemotherapeutic response, inhibits mammary tumor growth, angiogenesis, and lung metastasis.</a> Mol Cancer Ther. 12 (5), 799-808 (2013).</li><li>Birbrair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type-2+pericytes+participate+in+normal+and+tumoral+angiogenesis.">Type-2 pericytes participate in normal and tumoral angiogenesis.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 307 (1), 25-38 (2014).</li><li>Ferrara, N., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+as+a+therapeutic+target.">Angiogenesis as a therapeutic target.</a> Nature. 438 (7070), 967-974 (2005).</li><li>Speyer, C. L., Hachem, A. H., Assi, A. A., Johnson, J. S., DeVries, J. A., Gorski, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabotropic+glutamate+receptor-1+as+a+novel+target+for+the+antiangiogenic+treatment+of+breast+cancer.">Metabotropic glutamate receptor-1 as a novel target for the antiangiogenic treatment of breast cancer.</a> PLoS One. 9 (3), 88830 (2014).</li><li>Gu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Apurinic/Apyrimidinic+Endonuclease+siRNA+Inhibits+the+Angiogenesis+Induced+by+X-Ray+Irradiation+in+Lung+Cancer+Cells.">Human Apurinic/Apyrimidinic Endonuclease siRNA Inhibits the Angiogenesis Induced by X-Ray Irradiation in Lung Cancer Cells.</a> International Journal of Medical Sciences. 10 (7), 870-882 (2013).</li><li>Manjunathan, R., Ragunathan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chicken+chorioallantoic+membrane+as+a+reliable+model+to+evaluate+osteosarcoma-an+experimental+approach+using+SaOS2+cell+line.">Chicken chorioallantoic membrane as a reliable model to evaluate osteosarcoma-an experimental approach using SaOS2 cell line.</a> Biol Proced Online. 17, 10 (2015).</li><li>Nidhyanandan, S., Boreddy, T. S., Chandrasekhar, K. B., Reddy, N. D., Kulkarni, N. M., Narayanan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphodiesterase+inhibitor,+pentoxifylline+enhances+anticancer+activity+of+histone+deacetylase+inhibitor,+MS-275+in+human+breast+cancer+in+vitro+and+in+vivo.">Phosphodiesterase inhibitor, pentoxifylline enhances anticancer activity of histone deacetylase inhibitor, MS-275 in human breast cancer in vitro and in vivo.</a> Eur J Pharmacol. 764, 508-519 (2015).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper+improves+the+anti-angiogenic+activity+of+disulfiram+through+the+EGFR/src/VEGF+pathway+in+gliomas.">Copper improves the anti-angiogenic activity of disulfiram through the EGFR/src/VEGF pathway in gliomas.</a> Cancer Lett. Aug. , (2015).</li><li>Park, H. J., Zhang, Y., Georgescu, S. P., Johnson, K. L., Kong, D., Galper, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+umbilical+vein+endothelial+cells+and+human+dermal+microvascular+endothelial+cells+offer+new+insights+into+the+relationship+between+lipid+metabolism+and+angiogenesis.">Human umbilical vein endothelial cells and human dermal microvascular endothelial cells offer new insights into the relationship between lipid metabolism and angiogenesis.</a> Stem Cell Rev. 2 (2), 93-102 (2006).</li><li>de Wit, C., Fautz, C., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR+for+retrovirus-like+particle+quantification+in+CHO+cell+culture.">Real-time quantitative PCR for retrovirus-like particle quantification in CHO cell culture.</a> Biologicals. 28 (3), 137-148 (2000).</li><li>Jaffe, E. A., Nachman, R. L., Becker, C. G., Minick, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+endothelial+cells+for+derived+from+umbililcal+veins.+Identification+by+morphologic+and+immunologic+criteria.">Culture of human endothelial cells for derived from umbililcal veins. Identification by morphologic and immunologic criteria.</a> J Clin Invest. 52 (11), 2745-2756 (1973).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מתי לבצע assay זה, זה הכרחי כדי לשמור על תאי מטריקס על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס בכל עת, אלא אם כן צוין אחרת. אם תאי מטריקס מותר לחמם מעל 4 מעלות צלזיוס, זה יהיה לפלמר, ואת assay ייהרס. כמו כן, חשוב להבטיח שכל דבר בא במגע (למשל, טיפים pipet, צלחת) עם תאי מטריקס היא מראש מקורר מהסיבה הנ&quot;ל. מספר תאי זרע בכל טוב הוא קריטי, מעט מדי תאים לא ינתנו באינטרנט הצפוי במדגם השליטה, יותר מדי תאים יהוו צבירי תאים גדולים או בשכבה ואת assay לא יהיה תוקף. גורם חשוב נוסף בהצלחת assay זהו המספר מעבר התא של HUVECs. המספר מעבר תמיד צריך להיות נמוך מעשרה, אחרת היווצרות צינור חזקה עשויה שלא להתרחש. בנוסף, יש לוודא, כי מדיום תרבית תאים בשימוש לא פג, או התאים לא יהיו בת קיימא. Alternatively, אפשר aliquot המדיום ומרכיביו ולאחסן אותם ב -20 ° C לשמר לתקופה של זמן לאחר תאריך התפוגה. כמובן, זה עדיין עדיף להשתמש במדיום לפני מועד התפוגה כמו כל הנהלים, יש כמה חסרונות ביצוע assay היווצרות צינור תא האנדותל. אחת הבעיות הגדולות היא, כי ישנם סוגים שונים של תאי אנדותל ומטריצות תמיכה, התוצאות של assay יכול להשתנות במידה רבה בהתאם לסוג של התא מטריצה ​​משמש. לתאי אנדותל בשימוש (HUVECs, HAECs או HMVECs) הם תאים ראשוניים, הם יקרים כדי לקבל ויש השתנות לעומת תאים הונצח. התאים הראשוניים יש קטעים מוגבלים לשימוש, ולכן אינם מתאימים לניסויים אנגיוגנזה לטווח ארוך 14. לקבלת נתונים אמינים, אחד תמיד צריך להשתמש את אותם סוגים עבור assay. כמו עם אחרים מבחני חוץ גופית, התוצאות של assay היווצרות צינור צריך להיות conוייצב vivo, כי תוצאות של בתנאים המבוקרים ומלאכותיים של תרביות רקמה דו ממדים לא תמיד להשתקף biosystem המורכב של אורגניזם חי. כמו כן, חשוב לזכור כי זה סוג של assay ניתן להשתמש רק כדי להדגים היווצרות צינור תא האנדותל, ולא צריך לשמש כדי לבדוק אחרים, שאינם אנדותל, תאי להרכיב צינור. assay זוהי שיטה פשוטה ומהירה למדי לכמת פוטנציאל angiogenic של תרכובת. היא גם יוצרת פלטפורמה עבור ניסויים נוספים, כמו לבד, זה לא להניב מידע לגבי המנגנון הספציפי שבו למתחם למעשה משפיע על תהליך גיבוש הכלי. עם זאת, השימוש של מטריצות תאיות מגוונות היא דוגמא כיצד להמשיך ליצור מסגרת שאלות מחקר אשר אינו נפוצה. ישנן גישות כדי לחקור את המנגנונים ביו-כימיות הספציפיות של המתחם כולל מעכבים ספציפיים למקד מרכיביםמסלול אנגיוגנזה. גישה אחרת עשויה להיות לחלץ RNA מתאי אנדותל ולהשתמש RT-PCR (Real Time PCR) 12 לנתח שינויים של ביטוי גנים אשר עלול לגרום להתנהגות צמיחה שנצפתה assay. יישומים עתידיים של שיטה זו כוללים טרנספקציה HUVECs ליצור מבחנים לדפוק למטה לצעדים ספציפיים של מסלול אנגיוגנזה. קיים פוטנציאל ליישם את הגישה הזאת כדי ללמוד את מסלול lymphangiogenesis. על ידי שינוי הרכיבים התאים מטריקס, האינטראקציה של מטריקס תהליך הסלולר התומכים אנגיוגנזה בסרטן ניתן הובהר נוספת. הפקת רנ&quot;א וחלבונים מתא אנדותל בתנאים מסוימים אלה מספקות נתונים מדידים נוספים מתאימים הדמית נתונים.

על מנת לקבל את החומרים המזינים הדרושים להישרדות, גידולים ממאירים דורשים גישה לזרם הדם של החולה. כדי לקבל גישה זו, תאים סרטניים משחררים אותות כימיים המעודדים צמיחה של כלי דם חדשים לגידול, ובכך חטיפת תהליך פיזיולוגי נורמלי המכונה אנגיוגנזה 2. זוהי גם דרך כלי הדם שנוצרו באמצעות אנגיוגנזה כי גרורות (כלומר, התפשטות הסרטן לאיברים אחרים) יכול להתרחש. בגלל התהליך של אנגיוגנזה הוא כל כך חיוני להתקדמות של רחב מגוון של סרטן מסוג זה, היא יעד אטרקטיבי במחקר טיפול נגד סרטן 3. שיטה אחת בשימוש לכמת אנגיוגנזה היא למדוד את היכולת של תאים ובתאים אנדותל להקים צינורות כאשר הניח על תאי מטריקס. בגלל היווצרות של צינורות אלה היא צעד מוקדם קריטי אנגיוגנזה, בדיקת תנאי הסביבה (למשל, נוכחות או העדר שיתוף נתוןmpound) שיכולים לעורר או לעכב היווצרות צינור מספק תובנה צעדים ספציפיים שניתן להתמקד בהם כדי לעכב אנגיוגנזה. את assay היווצרות צינור תא האנדותל הוא אחת השיטות 4 הנפוץ ביותר במבחנה אשר מודד את היכולת של התאים כדי ליצור צינורות. זהו assay פשוט, הדורש רכיבים מעטים יחסית ותקופת תרבות קצרה 5. ואולי הכי חשוב, עם זאת, הוא כי הנתונים שנצברו סוג זה של assay הוא לכימות. דוגמא לשימוש של assay היווצרות צינור כרוך להשוות את ההתפתחות של צינורות מתאי אנדותל כלי דם גדלו על תאי מטריקס לעומת גורם גדילה המופחת (GFR) מטריקס. המטריצה ​​התאית היא חומר קרום דמוי במרתף מבודד מתאי סרקומה המרכיבים העיקריים שלה הם laminin, קולגן מהסוג IV, גורמי גדילת proteoglycans. יש תרכובות מסוימות השפעות שונות על היכולת של התא כדי ליצור צינורות כאשר בסביבה עם גורמי גדילה מופחתים proteoglycans סולפט heparan המופחת (HSPGs). HSPGs הם מרכיב של מטריקס אשר מצטמצם משמעותית מטריקס GFR. כדוגמה, אם ההשערה כי מעכבי אנגיוגנזה, כגון SB225002, החוסם את קולטן CXCR2, חלשים היכולת ניכרת לקטוע היווצרות צינור כאשר HSPGs נמצאים בשפע, אז השוואה בין פעילות היווצרות צינור ב תאי מטריקס ו מטריקס GFR הוא חשוב לבחון את האפשרות של עיכוב אנגיוגנזה באמצעות השלט של HSPGs. מבחני אחרים המשמשים בדרך כלל כדי לקבוע את ההשפעות של תרכובות על אנגיוגנזה נמצאים שיטות vivo. דוגמאות בולטות לכך הן קרום חומוס chorioallantoic (רמ&quot;א) assay 6 באמצעות ביצי תרנגולת, ואת Matrigel vivo ב תקע assay אנגיוגנזה 7 באמצעות עכברים. בעוד שיטות in vivo למדוד אנגיוגנזה tממדים hree והם יותר נציג של גוף האדם לעומת assay היווצרות צינור חוץ גופית, הם סובלים את הפגם של הדורש באופן משמעותי יותר זמן הם הרבה יותר קשה לבצע. הן assay CAM ואת assay תקע תאיים לקחת לפחות שבוע 8 לעשות, ואילו השוואה, assay היווצרות צינור יכול להיעשות ביום אחד והוא אינו דורש שימוש בבעלי חיים. חשוב לציין כי תאי אנדותל נעשה שימוש בדוח זה הם תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVEC). תאים אלה ממלאים תפקיד מרכזי ניבט כלי דם ואת צמיחת כלי דם, והם מקבילים במידה מספקת לתאי אנדותל בסרטנים לשמש לשם הערכת פעילות אנטי-אנגיוגנזה היא במבחנה בניסויי vivo 9. תאים אחרים כגון לתאי אנדותל כלי דם עיקריים עשויים לשמש גם. כמו כן, חשוב לציין כי חוץ מזה שיש תחתוןרמות של HSPGs, מטריקס GFR גם הפחיתה רמות של רכיבים רבים בהשוואה מטריקס רגיל. זה כולל, אך אינו מוגבל: EGF, IGF-1, PDGF, ו TGF-beta. אלה ניסויי ביצוע לומדים את המשמעות של תרכובות אלה ביחס אנגיוגנזה עשויים להיות מעוניינים להשתמש מטריקס GFR.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>EGM-2 complete growth medium (EGM-2 bullet kit CC-3162 )</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>NC9525043</td>
			<td>HUVEC complete growth medium: EGM-2 base medium mixed with BBE (Bovine Brain Extract), hEGF (Human Epidermal Growth Factor), Hydrocortisone, GA-1000 (Gentamicin, Amphotericin-B), 2% FBS (Fetal Bovine Serum), VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), hFGF-&#946; (Human Fibroblast Growth Factor Beta), R3-IGF-1 (Long R Insulin-like Growth Factor One), Ascorbic Acid, and Heparin.&#160; Aliquot the medium and its components and store them at -20 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML Growth Factor Reduced (GFR); 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40230&#160;</td>
			<td>Growth Factor Reduced (GFR) extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC , warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATRIGEL MATRIX 10ML ; 10mL; LDEV-Free</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>CB-40234&#160;</td>
			<td>extracellular matrix, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in 4 &#176;C&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB225002</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>559405</td>
			<td>CXCR2 inhibitor, keep in&#160;&#160; -20 oC, warm in room temperature&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)&#160;</td>
			<td>ScienCell Research Laboratories&#160;</td>
			<td>8000</td>
			<td>culture it according reference&#160; 10.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin 0.05%-EDTA phenol red</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25300-054</td>
			<td>keep in 4 oC, warm&#160; in 37 oC&#160; before use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon ECLIPSE Ti</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements AR 4.20.02 64 bit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Inverted Research Microscope software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph-pad Prism 5</td>
			<td>GraphPad Software, Inc.</td>
			<td></td>
			<td>scientific 2D graphing and&#160;statistics software, to calculate IC50.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

strategic endothelial cell tube formation assay: comparing extracellular matrix and growth factor reduced extracellular matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

<html> ניכר, בריא היווצרות צינור אנדותל ניתן בניגוד בקלות היווצרות צינור עכבות בתמונות מיקרוסקופ. היווצרות צינור בריאה מופיעה כרשה מאורגנת של המבנים נימי דמוית (איור 1). לשם השוואה, היווצרות צינור עכבות בא לידי ביטוי כמו תאים מפוזרים (איור 2). נתוני assay היווצרות צינור הוא לכמת על ידי מדידת אורך הצינור הכולל של צינורות נימים (טבלה 1). מלבד אורך הצינור הכולל, אורך צינור הממוצע, המספר הכולל של צינורות, או המספר הכולל של נקודות הסניף ניתן למדוד. היווצרות צינור מובני מניב אורך צינור נטו יותר מאשר צמיחת צינור עכבות מפוזרת. באיור 3, עקומת מנה תגובה מאפשר חישוב של IC 50 תחת תנאי הניסוי של HUVECs על תאי מטריקס GFR ו מעכב CXCR2 SB225002. &gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig1.jpg" /> איור 1. האנדותל t Ube היווצרות תא מטריקס והצמיחה מופחת גורם (GFR) מטריקס. שתי תמונות להראות היווצרות צינור מוצלחת על תאי מטריקס (א) ו מטריקס GFR (B). הרשת מחוברת צינורות מראה בבירור כי הצמיחה של צינורות היא בריאה HUVECs אלה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54074/54074fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig2.jpg" /> איור 2. עיכוב של היווצרות צינור על-מופחת גורם תאי וצמיחה (GFR) תאי מטריקס ידי SB225002 CXCR2 מעכב (5.6 מיקרומטר). שתי תמונות להראות צינורהיווצרות כי כבר מעוכבים על ידי SB225002 CXCR2 מעכב (5.6 מיקרומטר) על תאי מטריקס (א) ו מטריקס GFR (B). הגושים הבודדים של תאי HUVEC לראות להראות את התמונה כי התאים לא היו מסוגלים ליצור את צינורות הצורך להתחבר זה לזה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54074/54074fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54074/54074fig3.jpg" /> מנת איור 3. עקומת תגובה על-מופחת גורם גדילה (GFR) מטריקס. ציר ה- X מראה אורך צינור ואת ציר Y מראה את ריכוז מעכב CXCR2. עקומת מנת התגובה מראה כי תגובת HUVEC לבולמי CXCR2 על תאי מטריקס GFR תלויה במינון. IC 50 (המעכב מקסימאלי וחציריכוז y) חושב באמצעות תוכנת 13 וניתן לעומת עקומת מנת תגובה עבור מטריקס, למשל. IC 50 הוא ריכוז מעכב כי מקטין את התגובה ל -50%. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Growth Factor המופחת (GFR) תאי מטריקס ו מעכב (4 משכפל כל אחד) </td><td> סה&quot;כ Tube אורך ממוצע (פיקסלים) (1 פיקסל = 0.34 מיקרומטר) </td><td> סטיית תקן </td><td> P ערך </td></tr><tr><td> GFR מלא תאי מטריקס </td><td> 2447 </td><td> 168.174 </td><td></td></tr><tr><td> GFR תאי מטריקס + 0.56 מיקרומטר SB225002 </td><td> 1422.5 </td><td> 185.4218 </td><td> 0.000395 </td></tr><tr><td>GFR תאי מטריקס + 1.1 מיקרומטר SB225002 </td><td> 1004 </td><td> 126.1784 </td><td> 2.14 x 10 -5 </td></tr><tr><td> GFR תאי מטריקס + 5.6 מיקרומטר SB225002 </td><td> 519.25 </td><td> 129.6368 </td><td> 4.19 x 10 -6 </td></tr><tr><td> GFR תאי מטריקס + 11 מיקרומטר SB225002 </td><td> 393.75 </td><td> 212.6857 </td><td> 1.21 x 10 -5 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. כימותי אורכי צינור מוחלטים על צמיחה מופחתת גורם (GFR) מטריקס בתנאים משתנים. חלק של טבלה באמצעות אורכי צינור הכוללת שנרשמו דגימות גדלו על תאי מטריקס GFR עם ריכוזים שונים של מעכב CXCR2. מן הנתונים עולה כי מעכב CXCR2 עושה לעכב היווצרות צינור. הוצאות כוללים ערכים הקשורים כגון ממוצע של ארבע חזרות, סטיית התקן, וערך P. נמדד בפיקסלים להראותהנתונים מיוצאים. ניתן לחשב 50 IC באמצעות תוכנה סטטיסטית 13. (1 פיקסל = 0.34 מיקרומטר)

Watch this Scientific Journal Video about Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix at JoVE.com

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Assay גיבוש האנדותל תא Tube אסטרטגי: השוואת מטריקס ו- Growth Factor מופחתת מטריקס

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

strategic-endothelial-cell-tube-formation-assay-comparing

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

13.3K Views.  Wayne State University School of Medicine. This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

Video: Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events in cardiac myocytes such as proliferation and apoptosis require an accurate identification of cardiac myocyte nuclei to analyze cellular renewal in homeostasis and in pathological conditions2. Here, we provide a method to isolate cardiomyocyte nuclei from post mortem tissue by density sedimentation and immunolabeling with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) and subsequent flow cytometry sorting. This strategy allows a high throughput analysis and isolation with the advantage of working equally well on fresh tissue and frozen archival material. This makes it possible to study material already collected in biobanks. This technique is applicable and tested in a wide range of species and suitable for multiple downstream applications such as carbon-14 dating3, cell-cycle analysis4, visualization of thymidine analogues (e.g. BrdU and IdU)4, transcriptome and epigenetic analysis.

Cardiac nuclei are isolated via density sedimentation and immunolabeled with antibodies against pericentriolar material 1 (PCM-1) to identify and sort cardiomyocyte nuclei by flow cytometry.

הבידוד של גרעיני Cardiomyocyte מרקמות שלאחר המוות

Identification of cardiomyocyte nuclei has been challenging in tissue sections as most strategies rely only on cytoplasmic marker proteins1. Rare events ...

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated cartilage lesions lead to ongoing pain, negatively affect the quality of life and predispose for osteoarthritis. During the last decades, several surgical techniques have been developed to treat such lesions. However, until now it was not possible to achieve a full repair in terms of covering the defect with hyaline articular cartilage or of providing satisfactory long-term recovery 2-4. Therefore, articular cartilage injuries remain a prime target for regenerative techniques such as Tissue Engineering. In contrast to other surgical techniques, which often lead to the formation of fibrous or fibrocartilaginous tissue, Tissue Engineering aims at fully restoring the complex structure and properties of the original articular cartilage by using the chondrogenic potential of transplanted cells. Recent developments opened up promising possibilities for regenerative cartilage therapies.
The first cell based approach for the treatment of full-thickness cartilage or osteochondral lesions was performed in 1994 by Lars Peterson and Mats Brittberg who pioneered clinical autologous chondrocyte implantation (ACI) 5. Today, the technique is clinically well-established for the treatment of large hyaline cartilage defects of the knee, maintaining good clinical results even 10 to 20 years after implantation 6. In recent years, the implantation of autologous chondrocytes underwent a rapid progression. The use of an artificial three-dimensional collagen-matrix on which cells are subsequently replanted became more and more popular 7-9.
MACT comprises of two surgical procedures: First, in order to collect chondrocytes, a cartilage biopsy needs to be performed from a non weight-bearing cartilage area of the knee joint. Then, chondrocytes are being extracted, purified and expanded to a sufficient cell number in vitro. Chondrocytes are then seeded onto a three-dimensional matrix and can subsequently be re-implanted. When preparing a tissue-engineered implant, proliferation rate and differentiation capacity are crucial for a successful tissue regeneration 10. The use of a three-dimensional matrix as a cell carrier is thought to support these cellular characteristics 11.
The following protocol will summarize and demonstrate a technique for the isolation of chondrocytes from cartilage biopsies, their proliferation in vitro and their seeding onto a 3D-matrix (Chondro-Gide, Geistlich Biomaterials, Wollhusen, Switzerland). Finally, the implantation of the cell-matrix-constructs into artificially created chondral defects of a rabbit's knee joint will be described. This technique can be used as an experimental setting for further experiments of cartilage repair.

An experimental technique for the treatment of chondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of autologous chondrocytes seeded on a matrix is a well-accepted method for the remodeling and repair of articular cartilage lesions providing satisfying long-term results. Matrix-assisted autologous chondrocyte transplantation (MACT) offers a standardized and clinically established implantation method.

השתלת chondrocyte אוטולוגיים מטריקס בסיוע לשיפוץ ותיקון פגמי Chondral בדגם ארנב

Articular cartilage defects are considered a major health problem because articular cartilage has a limited capacity for self-regeneration 1. Untreated ...

Focus Formation: A Cell-based Assay to Determine the Oncogenic Potential of a Gene

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent growth potential, and the ability to form tumors in experimental animals1. In NIH 3T3 cells, the Ras signal transduction pathway is known to trigger many of these events, what is known as Ras transformation. The introduction of an overexpressed gene in NIH 3T3 cells may promote morphological transformation and loss of contact inhibition, which can help determine the oncogenic potential of that gene of interest. An assay that provides a straightforward method to assess one aspect of the transforming potential of an oncogene is the Focus Formation Assay (FFA)2. When NIH 3T3 cells divide normally in culture, they do so until they reach a confluent monolayer. However, in the presence of an overexpressed oncogene, these cells can begin to grow in dense, multilayered foci1 that can be visualized and quantified by crystal violet or Hema 3 staining. In this article we describe the FFA protocol with retroviral transduction of the gene of interest into NIH 3T3 cells, and how to quantify the number of foci through staining. Retroviral transduction offers a more efficient method of gene delivery than transfection, and the use of an ecotropic murine retrovirus provides a biosafety control when working with potential human oncogenes.

The Focus Formation Assay provides a straightforward method to assess the transforming potential of a candidate oncogene.

להתמקד גיבוש: Assay מבוסס תאים כדי לקבוע את הפוטנציאל שבעור של ג&#39;ין

Malignant transformation of cells is typically associated with increased proliferation, loss of contact inhibition, acquisition of anchorage-independent ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

אדם Dupuytren של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבות לחקר myofibroblasts והתאי מטריקס האינטראקציות

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that self-renew while giving rise to more differentiated progeny. Understanding and targeting these cancer stem cells in breast cancer, which may possess enhanced chemo- and radio-resistance compared to the non-stem tumor bulk, has become an important research area. Markers including CD44, CD24, and ALDH activity can be assessed using fluorescence activated cell sorting (FACS) to prospectively isolate cells that display enhanced tumorigenicity when implanted into immunocompromised mice: the mammosphere assay has also become widely used for its ability to retrospectively identify sphere-forming cells that develop from single stem cell-like clones. Here we outline approaches for the appropriate culturing of mammospheres from cell lines or primary patient samples, their passaging, and calculations to estimate sphere forming efficiency (SFE). First we discuss key considerations and pitfalls in the appropriate planning and interpretation of mammosphere experiments.

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

הערכת פנוטיפים מישורים-Cell-קוטביות ב Ciliopathy עכבר Mutant שבלול

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Three-Dimensional Culture Assay to Explore Cancer Cell Invasiveness and Satellite Tumor Formation

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells often generates unwanted artifacts. Therefore, cell culture in a three-dimensional (3D) environment, often using extracellular matrix components, emerged as an interesting alternative due to its close similarity to the native in vivo tissue or organ. We developed a 3D cell culture system using two compartments, namely (i) a central compartment containing cancer cells embedded in a collagen gel acting as a pseudo-primary macrospherical tumor and (ii) a peripheral cell-free compartment made of a fibrin gel, i.e. an extracellular matrix component different from that used in the center, in which cancer cells can migrate (invasion front) and/or form microspherical tumors representing secondary or satellite tumors. The formation of satellite tumors in the peripheral compartment is remarkably correlated to the known aggressiveness or metastatic origin of the native tumor cells, which makes this 3D culture system unique. This cell culture approach might be considered to assess cancer cell invasiveness and motility, cell-extracellular matrix interactions and as a method to evaluate anti-cancer drug properties.

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

Mammalian cell culture in monolayers is widely used to study various physiological and molecular processes. However, this approach to study growing cells ...

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage and that carries factor VIII in the circulation. VWF is synthesized by endothelial cells and is either released constitutively into the plasma or is stored in specialized organelles, called Weibel-Palade bodies (WPBs), for on-demand release in response to hemostatic challenge. Procoagulant and proinflammatory stimuli can rapidly induce WPB exocytosis and VWF release. The majority of VWF released by endothelial cells circulates in the plasma; however, a proportion of VWF is anchored to the endothelial cell surface. Under conditions of physiological shear, endothelial-anchored VWF can bind to platelets, forming a VWF-platelet string that may represent the nidus of thrombus formation. A flow chamber system can be used to visually observe the release of VWF from endothelial cells and the subsequent platelet capture in a manner that is reproducible and relevant to the pathophysiology of VWF-mediated thrombus formation. Using this methodology, endothelial cells are cultured in a flow chamber and are subsequently stimulated with secretagogues to induce WPB exocytosis. Washed platelets are then perfused over the activated endothelium. The platelets are activated and subsequently bind to elongated VWF strings in the direction of fluid flow. Using extracellular histones as a procoagulant and proinflammatory stimulus, we observed increased VWF-platelet string formation on histone-treated endothelial cells compared to untreated endothelial cells. This protocol describes a quantitative, visual, and real-time assessment of the activation of VWF-platelet interactions in models of thrombosis and hemostasis.

In this paper, we describe a method to assess endothelial von Willebrand factor release and the subsequent platelet capture under fluid shear stress in response to inflammatory stimuli using an in vitro flow chamber system.

חוקרים פון Willebrand גורם פתופסיולוגיה באמצעות מודל קאמרית זרימה של פון Willebrand פקטור-טסיות מחרוזת היווצרות

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular respiration, oxidative metabolism, signal transduction, and apoptosis. Consequently, mitochondrial dysfunction is reported to play an important role in the antifungal drug tolerance and virulence of pathogenic fungi. Recent data have also led to the recognition of the importance of the mitochondria as an important contributor to fungal pathogenesis. Despite the importance of the mitochondria in fungal biology, standardized methods to understand its function are poorly developed. Here, we present a procedure to study the basal oxygen consumption rate (OCR), a measure of mitochondrial respiration, and extracellular acidification rates (ECAR), a measure of glycolytic function in C. albicans strains. The method described herein can be applied to any Candidaspp. strains without the need to purify mitochondria from the intact fungal cells. Furthermore, this protocol can also be customized to screen for inhibitors of mitochondrial function in C. albicans strains.

Bio-energetics Investigation of Candida albicans Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Here, we present a stepwise protocol to investigate the mitochondrial respiration and glycolytic function in Candida Albicans using an extra flux analyzer.

ביו-energetics החקירה של קנדידה אלביקנס משתמש בזמן אמת חוץ-תאית השטף ניתוח

Mitochondria are essential organelles for the cellular metabolism and survival. A variety of key events take place in mitochondria, such as cellular ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunofluorescence התוויות של האדם ומורין נויטרופילים מלכודות ממומנת ב-פרפין רקמה מוטבעת

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...