This work was supported by the European Commission project Indox-FP7-KBBE-2013-7-613549; a Cost-Action CM1303-Systems Biocatalysis; and the National Projects Dewry [BIO201343407-R] and Cambios [RTC-2014-1777-3].

1. בניית ספריית Mutant <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו את האזורים להיות חשופים Morphing בעזרת אלגוריתמים חישוביים המבוססים על מודלי הומולוגית מבנה או קריסטל הזמין 18. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאן, למקד שני אזורים של AAO מ Pleurotus eryngii עבור mutagenesis ו רקומבינציה אקראית (Met [α1] -Val109, Phe392-Gln566), תוך הגברה והשאר של הגן (844 נ&quot;ב) על ידי באיכות גבוהה PCR (איור 1). הערה: מקטעים אחדים ניתן ללמוד על ידי Morphing באופן עצמאי או בשילוב 16. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את האזורים שהותקפו על ידי מוטגנים PCR. צור חפיפה בין אזורים ובין מגזרים (~ 50 נ&quot;ב כל אחד) על ידי superimposing PCR תגובות של האזורים המוגדרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן PCR מוטגנים של מגזרים ממוקדים נפח סופי של 50 μl המכילים תבנית ה- DNA (0.92 ng / μl), 90 תחושת אוליגו ננומטר (RMLN עבור המגזר אמ&quot;ן AAO-BP עבור המגזר M-II), 90 ננומטרפריימר ntisense (AAO-92C עבור מגזר אמ&quot;ן RMLC עבור מגזר M-II), 0.3 מ&quot;מ dNTPs (0.075 מ&quot;מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO), 1.5 מ&quot;מ 2 MgCl, 0.05 מ&quot;מ MnCl 2 ו 0.05 U / μl פולימראז תקי DNA. רצפי Primers מפורטים באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות (1 מחזור); 95 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 50 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות, 74 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -74 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבר את האזורים שאינם מוטגנים עם פולימראז נאמנות הגבוהה במיוחד וכולל אזורים המקבילים חופפי המגזרים מוטגנים / או סככות וקטור הוא לינארית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת התגובה בנפח סופי של 50 μl המכיל: תבנית ה- DNA (0.2 ng / μl), 250 ננומטר תחושה אוליגו HFF, 250 HFR antisense אוליגו ננומטר, 0.8 מ&quot;מ dNTPs (0.2 מ&quot;מ כל אחד), 3% (v / v) dimethylsulfoxide (DMSO) ו 0.02 U / μl iproof DNA פולימרז. רצפי Primers מפורטים &lt;strong&gt; איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תוכנית ה- PCR הבאה: 98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות (1 מחזור); 98 מעלות צלזיוס למשך 10 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 25 שניות, 72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות (28 מחזורים); ו -72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות (1 מחזור). הערה: עם התנאים המתוארים 1.2 ו -1.3 חפיפות של 43 נ&quot;ב (אזור פלסמיד-M1); 46 נ&quot;ב (אזור לאזור HF M1); 47 נ&quot;ב (אזור-M2 HF באזור) ו -61 נ&quot;ב (פלסמיד אזור- M2) נועדו (איור 1) להעדיף ב שחבור vivo בשמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את כל שברי PCR (מוטגנים הלא מוטגנים) עם ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Linearize וקטור כך איגוף אזורים של כ -50 נ&quot;ב נוצרים כי הם הומולוגיים אל 5&#39;- ו 3&#39;-הקצוות של גן המטרה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת התגובה לינאריזציה המכיל 2 מיקרוגרם DNA, 7.5 U בם HI, 7.5 U Xho לי, 20 מיקרוגרם BSA ו -2 μl של הצפת Baמ HI 10x בנפח סופי של 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תערובת התגובה על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות ו -40 דקות. לאחר מכן, להמשיך עם איון על 80 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הווקטור לינארית על ידי מיצוי ג&#39;ל agarose כדי למנוע זיהום עם הפלסמיד העגול שיורית (איור 2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תערובת התגובה העיכול אל-היטב מגה של ג&#39;ל agarose נקודת התכה נמוכה חצי preparative (0.75%, w: נ) וכן aliquot (5 μl) של תערובת התגובה ב הסמוך גם ככתב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה אלקטרופורזה DNA (5 V / ס&quot;מ בין האלקטרודות, 4 ᵒC) ולהפריד את הג&#39;ל agarose המתאים היטב מגה ולאחסן אותו ב 4 ᵒC ב 1x טה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם השביל עם סולם המשקל המולקולרי ואת הכתב. דמיינו את הלהקות תחת אור UV. ניק במצב שבו מקומות הווקטור לינארית. הערה: ככל איכות הווקטור לינארית המטוהר היא critiגורם cal עבור רקומבינציה והרכבה מוצלחת בשמרים, להימנע מכתים ג&#39;ל אלקטרופורזה DNA חצי preparative. השימוש של צבעים וחשיפת UV להפקת ג&#39;ל עשוי להשפיע על היציבות של וקטור DNA, להתפשר על יעילות רקומבינציה vivo. כפי אלטרנטיבת צבעי EtBr רעילים, ג&#39;ל אדום וצבעי SYBR משמשים עבור מכתים ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהיעדר אור UV, לזהות את הווקטור לינארית ב שהבר מגה-גם באמצעות הדרכתו של ניקס בנתיב הכתב המוכתם כך שהוא יכול להיות מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את הווקטור לינארית מ agarose ולטהר אותו עם ערכת חילוץ ג&#39;ל מסחרית על פי הפרוטוקול של היצרן. הערה: וקטורים הסעות episomal גבוהה עותק השתמש בטושים אנטיביוטיקה auxotrophy: בדוגמה זו שיישמנו אורציל עצמאית אמפיצילין התנגדות וקטור pJRoC30, תחת שליטה של האמרגן שמרים GAL1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיל equimolarxture של שברי PCR ומערבב אותו עם הווקטור לינארית ב יחס של 2: 1, עם לא פחות מ -100 ננוגרם של פלסמיד לינארית (יחסים שונים במבחן וקטור equimolar ספרייה / פתוח להשיג תשואות טרנספורמציה טובות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הספיגה של שברי PCR ו הווקטור לינארית ב 260 ננומטר ו -280 ננומטר כדי לקבוע הריכוז והטוהר שלהם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transform בתאי שמרים מוסמך בתערובת DNA באמצעות ערכת טרנספורמציה שמרים מסחרית (ראה טבלה עבור אספקה) על פי הוראות היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, להשתמש פרוטאז לקוי URA3 - תלוי ס זן cerevisiae, BJ5465. להפוך את התאים עם וקטור circularized הורית כסטנדרט פנימי במהלך ההקרנה (ראה להלן). בנוסף, לבדוק את הרקע על ידי הפיכת הווקטור לינארית בהעדר שבר PCR. הערה: במקרה של התגלה רמות הפרשה נמוכות ראשוניות, השתמש סcerevisiae פרוטאז זנים לקוי כמו BJ5465 לטפח הצטברות של חלבון פעיל supernatants תרבות. אם אנזים היעד עובר hyperglycosylation, שימוש זני glycosylation מחסר (למשל, Δ kre2 כי הוא מסוגל רק הצמדת oligomers מנוז הקטן) יכול להיות אופציה מתאימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט תאי טרנספורמציה על צלחות נשירת SC הדגירה אותם ב 30 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. פלייט (על צלחות הנשירה SC בתוספת אורציל) URA3 - ס תאי cerevisiae חסרי פלסמיד כביקורת שלילית להקרנה (ראה להלן). </li></ol> 2. תפוקה גבוהה הקרנת Assay (איור 3) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו מספר מתאים של 96-גם צלחות סטרילי (23 צלחות לנתח ספרייה של 2,000 שיבוטים) עם 50 μl בינוניים מינימאלי לכל טוב בעזרת רובוט pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות בודדות מתוך SC-נושרים צלחות ולהעבירם צלחות 96-היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכל צלחת, לחסן מספר העמודה 6 עם סוג הורית כסטנדרט פנימי היטב H1 עם URA3 - ס תאים cerevisiae (במדיום SC בתוספת אורציל) ללא פלסמיד כביקורת שלילית. הערה: ובכן H1 מלא במיוחד עם התקשורת הנשירה בתוספת אורציל. מדיה ריק היטב המכיל ללא תאים ניתן להכין גם כפקד עקרות נוספים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם ועוטפים אותם Parafilm. דגירת צלחות עבור 48 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 225 סל&quot;ד ולחות יחסית 80% שייקרו ולח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את Parafilm, להוסיף 160 μl של מדיום ביטוי היטב כל בעזרת רובוט pipetting, לאטום את צלחות דגירה אותם במשך שעות 24 נוספות. הערה: בינוני מינימל ובינוני ביטוי ערוך כפי שדווחו במקומות אחרים 19. רמות ההפרשה עשויות להשתנות תלויים הגן נחקר ובהתאם, tהוא הדגירה פעמים חייבות להיות מותאמות בכל מקרה לסנכרן את צמיחת תאים בכל הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות (צלחות אב) ב 2,800 x ז במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 20 μl של supernatant מבארות בצלחת המאסטר לצלחת העתק באמצעות נוזל טיפול multistation רובוטית. הערה: כדי להעדיף הפרשת אנזים רצוי להחליף את הפפטיד אות יליד חלבון המטרה על ידי פפטידים אות נפוצים ביטוי Heterologous בשמרים (למשל, גורם α prepro-המנהיג, המנהיג של הרעלן Killer 1 K מ ס cerevisiae, או גרסאות כימרי אפילו של שני פפטידים 13). לחלופין, הפפטיד אות היליד ניתן התפתח באופן בלעדי עבור הפרשה בשמרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 2 מ&quot;מ p -methoxybenzylalcohol ב- pH חיץ פוספט נתרן 100 מ&quot;מ 6.0 בעזרת הרובוט pipetting. מערבבים את צלחות בקצרה עם 96-אנחנוll מערבל צלחת דגירה אותם במשך 30 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם רובוט pipetting, להוסיף 160 μl של מגיב FOX על כל צלחת העתק ומערבבים בקצרה עם מערבל (הריכוז הסופי של תערובת FOX בבאר: 100 מיקרומטר xylenol כתום, 250 מיקרומטר Fe (NH 4) 2 (SO 4) 2 ו 25 מ&quot;מ H 2 SO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספר ותוספות מגיבים כדי לשפר את הרגישות, כגון ממסי שיתוף אורגניים (DMSO, אתנול, מתנול) או סורביטול 17. הנה, להגביר את התגובה על ידי הוספת סורביטול לריכוז סופי של 100 מ&quot;מ (איור 4). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הצלחות (מצב נקודת סיום, t0) ב 560 ננומטר על קורא צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצלחות ב RT עד שצבע מפתחת מדידת הבליעה שוב (t 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשבתי את הפעילות היחסית מהפער בין שווי Abs לאחר דגירה וכי המדידה הראשונית מנורמל פאךקסוג פתיחות opening סגירות closures עבור כל צלחת (Δt 1 - t0). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא להיטי המוטציה הטובים ביותר לשני מחדש הקרנות רצופות כדי לשלול תוצאות חיוביות שגויות. הערה: בדרך כלל, מחדש הקרנות כוללות בידוד פלסמיד מן השמרים, הגברה וטיהור Escherichia coli, ואחריו טרנספורמציה של תאי שמרים טריים עם הפלסמיד 19. כל כפיל שנבחר מחדש הוקרן pentaplicate. </li></ol>

<ol>
	<li>J&#228;ckel, C., Hilvert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysts+by+evolution.">Biocatalysts by evolution.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21 (6), 753-759 (2010).</li><li>Bornscheuer, U. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+third+wave+of+biocatalysis.">Engineering the third wave of biocatalysis.</a> Nature. 485 (7397), 185-194 (2012).</li><li>Renata, H., Wang, Z. W., Arnold, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+enzyme+universe:+accessing+non-natural+reactions+by+mechanism-guided+directed+evolution.">Expanding the enzyme universe: accessing non-natural reactions by mechanism-guided directed evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 54 (11), 3351-3367 (2015).</li><li>Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+past,+present+and+future.">Directed evolution: past, present and future.</a> AIChE J. 59 (5), 1432-1440 (2013).</li><li>Abatemarco, J., Hill, A., Alper, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+metabolic+engineering+toolbox+with+directed+evolution.">Expanding the metabolic engineering toolbox with directed evolution.</a> Biotechnol. J. 8 (12), 1397-1410 (2013).</li><li>Pourmir, A., Johannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution:+selection+of+the+host+organism.">Directed evolution: selection of the host organism.</a> Comput Struct Biotechnol J. 2 (3), e201209012 (2012).</li><li>Krivoruchko, A., Siewers, V., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+yeast+metabolic+engineering:+lessons+from+synthetic+biology.">Opportunities for yeast metabolic engineering: lessons from synthetic biology.</a> Biotechnol J. 6 (3), 262-276 (2011).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Saccharomyces+cerevisiae+in+directed+evolution:+an+efficient+tool+to+improve+enzymes.">Saccharomyces cerevisiae in directed evolution: an efficient tool to improve enzymes.</a> Bioeng Bugs. 3, 172-177 (2012).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+protocols+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+In+Vivo+Overlap+Extension.">Mutagenesis protocols in Saccharomyces cerevisiae by In Vivo Overlap Extension.</a> Methods Mol. Biol. 634, 3-14 (2010).</li><li>Bulter, T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+libraries+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Preparing libraries in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods. Mol. Biol. 231, 17-22 (2003).</li><li>Ostrov, N., Wingler, L. M., Cornish, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+assembly+and+combinatorial+libraries+in+S.+cerevisiae+via+reiterative+recombination.">Gene assembly and combinatorial libraries in S. cerevisiae via reiterative recombination.</a> Methods. Mol. Biol. 978, 187-203 (2013).</li><li>Shao, Z., Zhao, H., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+assembler,+an+in+vivo+genetic+method+for+rapid+construction+of+biochemical+pathways.">DNA assembler, an in vivo genetic method for rapid construction of biochemical pathways.</a> Nucleic Acids Res. 37 (2), e16 (2009).</li><li>Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+ligninolytic+enzyme+consortium.">Engineering the ligninolytic enzyme consortium.</a> Trends Biotechnol. 33 (3), 155-162 (2015).</li><li>Garcia-Ruiz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+ligninolytic+oxidoreductases:+from+functional+expression+to+stabilization+and+beyond.">Directed evolution of ligninolytic oxidoreductases: from functional expression to stabilization and beyond.</a> Cascade Biocatalysis: integrating stereoselective and environmentally friendly reactions. , 1-22 (2014).</li><li>Hernandez-Ortega, A., Ferreira, P., Martinez, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+aryl-alcohol+oxidase:+a+peroxide-producing+flavoenzyme+involved+in+lignin+degradation.">Fungal aryl-alcohol oxidase: a peroxide-producing flavoenzyme involved in lignin degradation.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 93 (4), 1395-1410 (2012).</li><li>Gonzalez-Perez, D., Molina-Espeja, P., Garcia-Ruiz, E., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenic+organized+recombination+process+by+homologous+in+vivo+grouping+(MORPHING)+for+directed+enzyme+evolution.">Mutagenic organized recombination process by homologous in vivo grouping (MORPHING) for directed enzyme evolution.</a> PLoS One. 9, e90919 (2014).</li><li>Rhee, S. G., Chang, T., Jeong, W., Kang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+Detection+and+Measurement+of+Hydrogen+Peroxide+Inside+and+Outside+of+Cells.">Methods for Detection and Measurement of Hydrogen Peroxide Inside and Outside of Cells.</a> Mol. Cells. 29 (6), 539-549 (2010).</li><li>Sebestova, E., Bendl, J., Brezovsky, J., Damborsky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+tools+for+designing+smart+libraries.">Computational tools for designing smart libraries.</a> Methods. Mol. Biol. 1179, 291-314 (2014).</li><li>Vi&#241;a-Gonzalez, J., Gonzalez-Perez, D., Ferreira, P., Martinez, A. T., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+directed+evolution+of+aryl-alcohol+oxidase+in+yeast+using+chimeric+signal+peptides.">Focused directed evolution of aryl-alcohol oxidase in yeast using chimeric signal peptides.</a> Appl. Environ. Microbiol. , (2015).</li><li>Gay, C., Collins, J., Gebicki, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroperoxide+Assay+with+the+Ferric-Xylenol+orange+Complex.">Hydroperoxide Assay with the Ferric-Xylenol orange Complex.</a> Anal. Biochem. 273 (2), 149-155 (1999).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+organic+chemistry+and+biotechnology:+Past,+present,+and+future.">Biocatalysis in organic chemistry and biotechnology: Past, present, and future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Mate, D. M., Gonzalez-Perez, D., Mateljak, I., Gomez de Santos, P., Vicente, A. I., Alcalde, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pocket+manual+of+directed+evolution:+Tips+and+tricks.">The pocket manual of directed evolution: Tips and tricks.</a> Biotechnology of Microbial Enzymes: Production, Biocatalysis and Industrial Applications. , .</li><li>Chao, R., Yuan, Y., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+DNA+assembly+technologies.">Recent advances in DNA assembly technologies.</a> FEMS Yeast Res. 15, 1-9 (2015).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

במאמר זה, יש לנו סכמתי רוב הטיפים והטריקים המועסקים במעבדה שלנו להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת ס cerevisiae (באמצעות AAO כדוגמא), כך שהם יכולים להיות מותאמים לשימוש עם מערכות אנזימים האיקריוטים רבות אחרות על ידי ביצוע הגישה הנפוצה פשוט המתואר כאן. במונחים של יצירת ספרייה, Morphing היא שיטה בסיר אחד מהר כדי להציג ולשלב מחדש מוטציות אקראיות בתוך רצועות חלבון קטנות תוך השארת האזורים הנותרים של החלבון 16 ללא שינוי. ספריות עם כמה המון מוטציוני ניתן להכין בקלות recombined in vivo, יחד עם הפלסמיד לינארית, כדי ליצור וקטור מלא משכפלים באופן אוטונומי. זה קריטי, כי רצפים חופפים אגף כל מתיחה לאפשר שברי הגן המלא להיות מחדש באמצעות רקומבינציה in vivo, הימנעות PCR תגובות נוספות בצעדי קשירה במבחנה. ב p זהrotocol, תדירות אירועים מוצלבים בין שברי PCR יכול להיות מוגברת על ידי הקטנת הגודל של האזורים החופפים, אם כי זה עשוי לסכן את יעילות השינוי. לא משנה של polymerases DNA המשמש PCR מוטגנים, נטען מוטציוני יכול להיות מותאם על ידי בנייה בעבר וניתוח נופי ספריית מוטציה קטנה (איור 5 א). אם ערכת GeneMorph השנייה משמשת, זה עדיין מומלץ לעקוב גישה זו מאז רקומבינציה DNA vivo ב יכולה לשנות את עומסי מוטציוני בעיקר מוערכים על ידי היצרן. באופן כללי, נופים מוטנטית, 35 - 50% של שיבוטים הכולל הוקרנו יש פחות מ -10% מפעילות ההורים מתאימים קמפייני אבולוציה מכוונים, אם כי מספר זה משתנה כפונקציה של חלבון המטרה ופעילותה. בדרך כלל, הניתוח של נופי ספריות מוטציה מאומת נוסף על ידי רצפי DNA של מדגם אקראי של מוטציות. בדוגמה הנוכחית, תקי<html> DNA פולימרז שמש בשל השיעור הגבוה של הטעות שלה, אשר קשור לחוסר 3&#39;→ 5&#39;proof-קריאת פעילות exonuclease. נטען מוטציוני בספריות תקי שונו על ידי תוספת של ריכוזים שונים של MnCl 2, אך השימוש dNTPs מאוזן ו / או הפחתה בריכוזי תבנית הגן הם גם אפשרויות מתאימות. ולמגבלות של Morphing נובעת ממספר מגזרים להיות recombined. על פי הניסיון שלנו, עד ארבעה בלוקי חלבון (חמישה אירועים מוצלבים ספירה באזורים רקומבינציה עם הווקטור לינארית) ניתן שחבור עם תשואות טרנספורמציה טובות (~ 10 5 שיבוטים לכל תגובת טרנספורמציה). שיטה זו יכולה בקלות להיות שונה כדי mutagenesis באתר-רוויה מרובה בצע (למשל, באמצעות NDT פריימרים מנוונים או יצירת ניוון עבור 22 קודונים ייחודיים) לחקור מספר תפקידים בו זמנית תוך צמצום מאמצי ההקרנה באופן משמעותי 21,22. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; פרוטוקול ההקרנה &quot;העיוור&quot; הישיר AAO הוא מאוד רגיש ואמין (מבוסס על זיהוי הישיר של H 2 O 2 תלות המצע בשימוש על ידי האנזים), מייצג assay משלים אחר ותיק עקיף פרוטוקולים לזהות חמצניים (peroxidases צימוד בעיקר עם מצעים colorimetric). ואכן, assay FOX הועסק באופן שגרתי כדי למדוד H 2 O 2 ב נוזלים ביולוגיים, וזה יכול עכשיו להיות מתורגם בקלות לתוך פרוטוקולים להתפתח AAO וכל אחרים H 2 O 2 בייצור אנזימים (למשל, oxidases גלוקוז, דהידרוגנאז cellobiose, Glyoxal oxidases, oxidases מתנול), במיוחד עבור פעילות על מצעים שאינם טבעיים שבו תגובות קשות אחרת כדי לזהות. ס cerevisiae הוא המארח הנאות ביותר אבולוציה מכוונת של גנים אוקריוטים שכן הוא מציע יעילויות הטרנספורמציה גבוהות (עד 1 x 106 transformants / מיקרוגרם DNA), הוא מבצע עיבוד שלאחר translational מורכב ושינויים (כולל N- ועיבוד C- מסוף, ו glycosylation) וזה מייצא חלבונים זרים לתוך מרק התרבות באמצעות מסלול הפרשה. בנוסף, כלי ביולוגיה מולקולרית ומבוססים זמינים לעבודה עם שמרים זה, כולל וקטורי הסעות חַד או דו-כיוונית episomal (בלתי משתלב) בשליטת היזמים של עוצמות שונות. ואחרון חביב, תדירות הגבוהה של רקומבינציה DNA ההומולוגית אפשרה מגוון של שיטות כדי להתפתח להשיג גיוון DNA כי נמצאים בשימוש כיום להתפתח חלבונים יחידים, כמו גם מסלולי אנזימים מורכבים יותר 8, 12, 13, 23. תיקון פער ​​vivo ב ואת מכשיר קורא ההוכחה שמרים זה יכול גם להיות מועסק כדי ליצור מפלצות כאשר recombining גנים שונים (הכולל כ. 60% של זהות רצף ה- DNA), כמו גם דשדוש טובת צאצאים / מוטציות מתוך ישירה&quot;ד קמפיין האבולוציה, או להפגיש במבחנה בשיטות רקומבינציה vivo בסיבוב אחד של האבולוציה, ובכך להעשיר ספריות מוטציה מבחינת foldability ותפקוד.

אבולוציה מולקולרית בימוי היא שיטה חזקה, מהירה ואמינה לעצב אנזימים 1, 2. דרך סיבובים איטרטיבי של מוטציות אקראיות, רקומבינציה הקרנה, הגירסות משופרות של אנזימים יכולות להיוצר שפועלים על מצעים חדשים, בתגובות רומן, ב שאינו טבעי סביבות, או אפילו כדי לסייע התא כדי להשיג את המטרות מטבוליות חדשות 3-5. בין המארחים המשמשים אבולוציה מכוונת, את cerevisiae Saccharomyces שמרי בירה מציע רפרטואר של פתרונות עבור הביטוי הפונקציונלי של חלבונים איקריוטיים מורכבים שאינם זמינים אחרת עמיתיהם פרוקריוטים 6,7. משומשים ממצה מחקרים בביולוגיה של התא, מודל אוקריוטים הקטן הזה יש יתרונות רבים מבחינת שלאחר translational שינויים, קלות ויעילות מניפולציה וטרנספורמציה, שכולן הן התכונות החשובות להנדס אנזימים על ידי אבולוציה מכוונת 8. יתר על כן, תדירות גבוההשל רקומבינציה DNA ההומולוגית ס cerevisiae מצמיד את מנגנון הוכחת הקריאה היעיל בה פותח מגוון רחב של אפשרויות ליצירת ספרייה והרכבת גני in vivo, טיפוח האבולוציה של מערכות שונות אנזימים יחידים מסלולים מלאכותיים מורכבים 9-12. המעבדה שלנו בילתה את העשור האחרון בעיצוב כלים ואסטראטגי עבור האבולוציה המולקולרית של ligninases השונה בשמרים (oxidoreductases מעורב השפלה של ליגנין במהלך דעיכת עץ טבעית) 13-14. בתקשורת זו, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להכין וספריות מוטצית מסך ס cerevisiae עבור מודל flavooxidase, מונואמין -aryl-אלכוהול (AAO 15) -, כי יכול להיות מתורגם בקלות אנזימים רבים אחרים. הפרוטוקול כרוך שיטת אבולוציה ממוקדת מכוון (Morphing: תהליך רקומבינציה מוטגנים מאורגן על ידי הומולוגי in vivo קיבוץ) נעזרה במנגנון שמרים תא 16, גידולassay ההקרנה מאוד רגיש דה המבוססת על התגובה פנטון על מנת לזהות פעילות AAO מופרש לתוך המרק תרבות 17.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1. Culture media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0166</td>
			<td>CAS N&#186; 69-52-3 M.W. 371.39</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Difco</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cloramphenicol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C-0378</td>
			<td>CAS N&#186; 56-75-7 M.W. 323.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Galactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td>CAS N&#186; 59-23-4 M.W. 180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>CAS N&#186; 50-99-7 M.W. 180.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Raffinose pentahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83400</td>
			<td>CAS N&#186; 17629-30-0 M.W. 594.51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone</td>
			<td>Difco</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>CAS N&#186; 7778-77-0 M.W. 136.09</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracil</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>U1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Difco</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Nitrogen Base without Amino Acids</td>
			<td>Difco</td>
			<td>291940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements without uracil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2. PCR Reactions</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix</td>
			<td>Agilent genomics</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>25 mM each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iProof High-Fidelity DNA polymerase</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>172-5301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese(II) chloride tetrahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8054</td>
			<td>CAS N&#186; 13446-34-9 M.W. 197.91</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taq DNA Polymerase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4545</td>
			<td>For error prone PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3. Plasmid linearization</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BamHI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI restriction enzyme</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>For staining DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4. FOX assays</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3754</td>
			<td>CAS N&#186; 7783-85-9 M.W. 392.14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anysil Alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W209902</td>
			<td>CAS N&#186; 105-13-5 M.W. 138.16</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1876</td>
			<td>CAS N&#186; 50-70-4 M.W. 182.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide 30%</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1072090250</td>
			<td>FOX standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenol Orange disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>52097</td>
			<td>CAS N&#186; 1611-35-4 M.W. 716.62</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose gel stuff</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Norgen</td>
			<td>28035</td>
			<td>CAS N&#186; 9012-36-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Red</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>41003</td>
			<td>DNA analysis dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 1Kb Ladder</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>SM0311</td>
			<td>DNA M.W. standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading Dye 6x</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting temperature agarose</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>161-3112</td>
			<td>CAS N&#186; 39346-81-1</td>
		</tr>
	
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5. Kits and cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S. cerevisiae strain BJ5465</td>
			<td>LGC Promochem, Spain</td>
			<td>ATTC 208289</td>
			<td>Protease deficient strain with genotype: MAT&#945; ura3-52 trp1 leu2-delta1 his3-delta200 pep4::HIS3 prb1-delta1.6R can1 GAL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli XL2-Blue competent cells</td>
			<td>Agilent genomics</td>
			<td>200150</td>
			<td>For plasmid purification and amplification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740,609,250</td>
			<td>DNA gel extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin Plasmid Kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740,588,250</td>
			<td>Column miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Transformation Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>YEAST1-1KT</td>
			<td>Included DNA carrier (Salmon testes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zymoprep yeast plasmid miniprep I</td>
			<td>Zymo research</td>
			<td>D2001</td>
			<td>Plasmid extraction from yeast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6. Plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>655101</td>
			<td>Clear, non-sterile, Polystyrene (for activity measurements)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>655161</td>
			<td>Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate lid</td>
			<td>Greioner Bio-One</td>
			<td>656171</td>
			<td>Clear, sterile, Polystyrene (for microfermentations)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed evolution method in saccharomyces cerevisiae: mutant library creation and screening

אבולוציה מכוונת ב שמר אפייה מציעה יתרונות רבים אטרקטיביים בעת תכנון אנזימים עבור יישומים ביוטכנולוגיים, תהליך כרוך בבנייה, שיבוט וביטוי של ספריות מוטציה, מצמיד את רקומבינציה DNA בתדר גבוה ההומולוגית in vivo. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור ספריות מוטציה מסך בשמרים המבוססת על הדוגמא של מונואמין aryl-אלכוהול פטרייתי (AAO) כדי לשפר את הפעילות הכוללת שלה. שני מקטעי חלבון היו נתונים האבולוציה ממוקד בבימויו של mutagenesis אקראי וב רקומבינציה DNA vivo. מסוכך של ~ 50 נ&quot;ב איגוף בכל מגזר אפשר וההרכבה הנכונה של גן AAO-פיוז&#39;ן וקטור לינארית והוליד פלסמיד משכפלים מלא באופן אוטונומי. ספריות Mutant מועשרות גרסות פונקציונליות AAO הוקרנו ס supernatants cerevisiae עם assay תפוקה גבוהה רגיש המבוססת על התגובה פנטון. התהליך הכללי שלבניית ספרייה ב ס cerevisiae המתואר כאן יכול בקלות להיות מיושם להתפתח גני האיקריוטים רבים אחרים, הימנעות PCR תגובות נוספות, ב- DNA במבחנת צעדי רקומבינציה קשירה.

AAO מ פ eryngii הוא flavooxidase תאי המספק peroxidases פטרייתי עם H 2 O 2 כדי להתחיל לתקוף ליגנין. שני קטעים של AAO היו נתוני אבולוציה ממוקדת בבימויו של Morphing כדי לשפר את פעילותה וביטויו ס cerevisiae 19. בלא קשר עם אנזימים חוץ שטיפחו ס cerevisiae, הנושא הקריטי ביותר בעת בניית ספריות מוטציה בשמרים נוגעת ההנדסה של אזורים חופפים ספציפיים להעדיף את השחבור בין שברי השיבוט שלהם לתוך הווקטור לינארית. בדוגמה הנוכחית, עבור כל תגובה PCR, כל שברי היה המסוכך של כ -50 נ&quot;ב לקדם שחבור vivo בשמרים. מספר אירועי רקומבינציה תלוי במספר המגזרים צריך להרכיב את הציוד משובט עם הווקטור לינארית (כלומר, שני אירועים מוצלבים התקיימו ביןבשלושה מגזרים PCR -The בשני מגזרי מוטגנים איגוף segment- הלא mutagenized בתוספת שני צמתים נוספים עם וקטור לינארית; איור 1). על פי הניסיון שלנו, רצפים חופפים יותר מ -50 נ&quot;ב להקטין את הסבירות של רקומבינציה פנימית בזמן שהם לא לשפר את היעילות הטרנספורמציה. המון מוטציוני הותאמו באמצעות דגימת ספריות מוטציה עם נופים שונים, בחישוב מספר שיבוטים עם &lt;10% של פעילות האנזים הורית, ובהמשך לבדוק אותם על ידי רצף מדגם אקראי של וריאנטים הפעיל והלא פעיל (איור 5 א). לקביעת המקדם השונה ס תאי cerevisiae שהוסבו עם AAO ההורים מצופים על ושחרר SC צלחות. מושבות בודדות היו נקטפים מחוסנים בתוך צלחת גם 96 ואת הפעילות של השיבוטים הוערכה מן ההכנות טריות. מדגם מוטגנים2 (תקי / MnCl 2 0.05 מ&quot;מ) נבחר כנקודת היציאה לבניית הקרנת ספרייה. היות והפעילות הביולוגית של AAO מגביר את הריכוז H 2 O 2 במדיום התגובה, חיפשנו assay רגיש ומדויק לכמת שינויים קלים H 2 O 2. FOX היא שיטה כימית המבוססת על התגובה פנטון 20, לפיה חמצון על ידי H 2 O 2 כוננים התגובה של Fe 3+ עם כתום xylenol לגבש כחול-סגול מורכבים (o -cresolsulfone-phthalein 3 &#39;, 3&#39; &#39;- bis (methylimino) diacetate ε 560 = 1.5 x 10 4 M -1 cm -1). צעד חמצון הברזל היה מוגבר על ידי הוספת סורביטול כדי לשפר את הרגישות של assay, הגדלת ההתפשטות של רדיקלים עם ε לכאורה 560 = 2.25 x 10 5 M -1 cm -1 (אלחוטיאיור 4). את גבול הגילוי של assay זה (בטווח מיקרומטר) חושב לפי שיטת קביעת בלנק בצלחת 96-היטב עם סטנדרטים בשלושה עותקים (0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3 ו -4 מיקרומטר H 2 O 2 ) ושימוש כמה supernatants מ ס cerevisiae חסר URA3 - פלסמיד (איור 5). את הבחינה כמו ליניארי בנוכחות סורביטול (עד 8 מיקרומטר של H 2 O 2), ולמרות ליניאריות היה יותר מתמיד בהיעדר סוכר זה (לפחות עד 30 מיקרומטר של H 2 O 2), התגובה הייתה חלשה (למשל, ב -6 מיקרומטר של H 2 O 2, שיפור של פי 4 הושג בנוכחות סורביטול -deep בסגול מתוך ספיגה של 0.24 בהעדרה -dark הכתום (איור 5 ב)). הקשר בין שרירי בטן ואת ריכוז AAO הוערך עם כמויות גדלות והולכות של דוארnzyme (מן supernatants שמרים) ו תגובה ליניארי נצפה; R 2 = 0.997 (איור 5 ג). ראוי לציין כי אות FOX הייתה יציבה במשך כמה שעות ללא כל הפרעה נראית לעין על ידי הגורמים השונים במרק התרבות. הרגישות המוערכת של FOX הייתה ~ 0.4 מיקרומטר של H 2 O 2 המיוצר על ידי AAO ב supernatant בנוכחות סורביטול, ו ~ 2 מיקרומטר בהעדרה. ספריית מוטציה של 2,000 שיבוטים נבנתה והוקרנה עם assay זה. מוטנטים כמה AAO זוהו עם הפרשה השתפרה בעיקר ופעילות נגד אלכוהול p -methoxybenzyl (5D איור) 19. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig1.jpg" /> איור 1.. Morphing פרוטוקול אבולוציה AAO שני אזורים שונים של AAO היו מטרה mutagenesis ו רקומבינציה אקראית: M1 (כחול, 590 נ&quot;ב) הכוללת את הפפטיד האות (SP); M2 (צהוב, 528 נ&quot;ב). אזור HF (האפור, 844 נ&quot;ב) היה מוגבר עם polymerases איכות גבוהה. אזורים מוטגנים מופו במבנה הגבישי של AAO (PDB מזהה: 3FIM). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53761/53761fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig2.jpg" /> הכנה איור 2. של מוצרים PCR ואת לינארית וקטור (א) ג&#39;ל agarose אנליטית (1% w: נ). המכיל סמן משקל מולקולרי (1 סולם kb) במסלולים 1 ו -7; בם HI ו Xho וקטור לינארית לי, מסלול 2; PCR קטע M1, מסלול 3; PCR קטע M2, מסלול 4; HF קטע PCR, מסלול 5; נאיבו מחדש וקטור לינארית עם Nhe אני (המכיל את גן AAO המלא עם אזורי MI, HF ו- M-II), ליין 6. (ב) לינאריזציה וקטור, מסלולי 1 ו -6 סטנדרטים מולקולריים, סולם Kb 1; פלסמיד miniprep, מסלול 2; פלסמיד לינארית עם Nhe אני, מסלול 3; פלסמיד לינארית עם Bam HI ו Xho לי, מסלול 4; הפלסמיד לינארית מתקבל על ידי מיצוי ג&#39;ל לניקוי לאחר עיכול, ליין 5. (ג) פרוטוקול טיהור פלסמיד. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53761/53761fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig3.jpg" /> איור 3. פרוטוקול הקרנת תפוקה גבוהה. סקירה כללית של התהליך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53761/53761fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג vers גדול</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig4.jpg" /> איור 4. שיטת FOX. פטריות לבנות-ריקבון לתקוף את דופן התא של עץ באמצעות תגובה פנטון שמייצרת הידרוקסיל רדיקלי OH •. זוגות שיטת FOX שתגובה זו xylenol הכתום (XO), ואת הספיגה של מתחם 3+ XO-Fe נמדדה ב 560 ננומטר. חמצון שחור מוגבר על ידי התוספת של סורביטול לתערובת המגיבה. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53761/53761fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53761/53761fig5.jpg" /> איור 5. מוטגנים נופי הדרכה לספריות Morphing שימוש שגיאה שונה נוטה PCR תנאים ותיקוף של Assay ההקרנה. (א </stro<html> ng&gt;) נופים Morphing. קו אופקי מוצק מציגה את פעילות מן הסוג ההורים ב assay ואילו קווים מקווקווים מציינים את מקדם ההשתנות של assay. האחוזים מציינים את מספר שיבוטים עם פחות מ -10% של פעילות האנזים ההורית. פעילויות נרשמות בסדר יורד. (ב) גבול גילוי FOX הוערך עם ריכוז גדל והולך של H 2 O 2 (העיגולים השחורים) הנוכחות והיעדרות (ריבועים לבנים) של סורביטול. (C) קשר לינארי בין ריכוז AAO (supernatants transformant) ו- ABS 560nm. כל נקודה תואמת את הממוצע של 8 ניסויים וכולל את סטיית התקן. (ד) נוף הספרייה Mutant. וריאנטים הנבחרים (המרובע מוצל) היו rescreened כפי שדווחו במקומות אחרים 19. קו מוצק מציג את הפעילות מסוג הורי AAO.&gt; אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening at JoVE.com

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

בימוי שיטת אבולוציה<em&gt; שמר האפייה</em&gt;: יצירת ספריית Mutant והקרנה

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

directed-evolution-method-saccharomyces-cerevisiae-mutant-library

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

10.8K Views.  Institute of Catalysis, CSIC. We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae. 

Video: Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Dissection של Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Phosphoproteomics כמותיים חומצת שומן מגורה Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור Mitophagy ניטור השמרים Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

ביטוי וטיהור של חלבון פיברוזיס פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור מוליכות ב Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.