Technical supported by Melanie Pfeifer and Nikolai Schmarowski (Institute for Microscopic Anatomy and Neurobiology, University Medical Center Mainz).

הצהרת אתיקה: הטיפול בעכברים והפרוצדורות בוצעו בהתאם להנחיות אירופאיות, לאומיות ומוסדיות לטיפול בבעלי חיים. 1. ברחם Electroporation הערה: ברחם electroporation בוצע כפי שפורסם בעבר 12,14. לכן, השיטה היא רק תיארה בקצרה בבאה (איור 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מהיר ירוק צבעוני ללא רעלן פנימי מתקדם פלסמיד הכיתה transfection (המכיל 1,5 pCAGGS) כפי שתואר קודם לכן 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך ולטחון (35 זווית מעלות) נימי זכוכית בורוסיליקט (0.8-.9 קוטר) לזריקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מכשירים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כִּירוּרגִיָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל משככי כאבים (carprofen, 4 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף, SC, 24 דיפו שעות) לפחות 30 דקות לפני תחילת הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את האורך שלההרדמה למקסימום של 35-45 דקות (שלב III - שלב של הרדמה כירורגית פי 15 guedel - דקות 25-30 מקסימליים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכברי מתוזמן בהריון עם isoflurane (אינדוקציה בתא: 2.8%, ניתוח באמצעות מסכה: 2.5%). לאשר הרדמה על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל משחה העין כדי למנוע עין-יובש במהלך הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את אזור הניתוח עם 7.5% פתרון Providone-יוד ולכסות את העכבר עם גזה סטרילית (לחה עם פתרון 0.9% מלוחים נזיל אלכוהול) עם רק את אזור הניתוח החשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור לפתוח את חלל הבטן עם אזמל (חתך בעור: 1.5-2 סנטימטר, חתך שריר: 1-1.5 סנטימטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמר את חלל הבטן נפתח מהתייבשות על ידי הרטבה עם 0.9% תמיסת מלח נזיל אלכוהול חיממה או תמיסה איזוטונית סטרילית אחרת כמו בבימויו של צוות או ועדה וטרינרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ בזהירות קרנות רחם (באמצעות מלקחיים טבעת, לא לגעת ברחם עם אצבעים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרקה של ה- DNA וelectroporation. הערה: הפרטים המדויקים למיקוד אזורים ספציפיים מצוינים בסעיף 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק את פתרון ה- DNA בצבע לתוך החדר כפי שצוין באיור 1 וסעיף 2 דרך נימי ורוסיליקט מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל המתח המתאים לשלב העוברי המתאים (למשל., 36-38 V עבור E14) באמצעות אלקטרודות מיוחדות מלקחיים מסוג פלטינה (אלפיות שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). Pulse משוטי electroporation במהלך היישום של המתח כדי למזער את הנזק של קיר הרחם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> / טיפול שלאחר ניתוח electroporation ההודעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליף את קרן הרחם בזהירות בחלל הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתפור את השרירים וחתך בעור בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תן את שאר עכבר על מכשיר תמיכה תרמי להתאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על העכבר במהלך התאוששות (התנהגות, הזנה וצריכת מים), 4 שעות, 24 שעות ו -48 שעות לאחר ניתוח. במידת צורך, יחול משככי כאבים נוספים (carprofen, 4 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף, 24 דיפו שעות) עבור 2 ימים נוספים. </li></ol></li></ol> 2. Transfection של תחומי מוחין ספציפיים הערה: המיקום של הקוטב החיובי מוצג כזווית בין הציר האנכי דרך החדר מלא בפתרון ה- DNA (החדר ממני או השלישי) ואת המיקום של הקוטב החיובי. כאשר ממלאים את החדר השמאלי העמדות-הפוך מראה. באיור 4 העמדות של קדמוני האוזן מוצגות, המספקות נקודות התייחסות חשובות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של אזורים בקליפת המוח (איור 2 א, לוח 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של אזורים בקליפת המוח להשתמש בעוברי E14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1.5-2 μl DNA-פתרון המכיל DNA 4 מיקרוגרם בחדר לרוחב תקיןבאמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם בזהירות את העובר באמצעות מלקחיים טבעת כך שאין כלי נראים מעל האתר לנקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להזריק את ה- DNA-הפתרון כ 0.75 מ&quot;מ העטרה מתפר lambdoidal ו 0.5 מ&quot;מ לרוחב מתפר sagittal (איור 3). ודא שעומק ההחדרה הוא 1.2 מ&quot;מ (E14, נמדד מדופן הרחם). בדקו צביעה כחולה-ירוקה עם תיחום חד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתח הנע 36-38 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים במרכז אלקטרודות רק הקדמי של primordia האוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtransfect זוויות שימוש קליפת retrosplenial 330-0 מעלות, לtransfect הקורטקס המוטורי 0-40 °, לtransfect הקליפה החושית 40-95 °, לtransfectקליפת אגסי 95-110 מעלות (איור 2 א). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 4 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של ההיפוקמפוס (איור 2, לוח 1). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של היווצרות בהיפוקמפוס להשתמש עוברי E15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהנעת אלקטרודה 3 או 5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתח הנע 38-40. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים במרכז הקוטב השלילי רק הקדמית של primordium האוזן והמרכז oו הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtransfect gyrus המשונן להשתמש זוויות 190-210 מעלות, לtransfect ammonis קורנו (CA) 3 210-230 מעלות, לtransfect Ca 2 230-250 מעלות, לtransfect ° CA1 250-275 (איור 2). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. לבצע ניתוח לאחר היווצרות בהיפוקמפוס מלאה (לאחר הלידה, p21) כמפורט בסעיף 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של גרעין במחיצה לרוחב וסטריאטום (איור 2 ג, טבלת 1) הערה: הזוויות חופפות עם אלה לtransfecting היפוקמפוס. לtransfect גרעין רוחב המחיצה וסטריאטום ללא שלבים עובריים מוקדם transfection ההיפוקמפוס לא רצוי (E12) ביעילות צריך להיות בשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. לelectroporation ברחם של הגרעין במחיצה לרוחב וstriatאממ להשתמש עוברי E12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1 μl DNA-תמיסה המכילה 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב תקין באמצעות נימי ורוסיליקט מוכנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלקטרודה 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 33 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים במרכז את האלקטרודות ברמה של primordia האוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtransfect זוויות שימוש גרעין במחיצה לרוחב 100-170 מעלות, לtransfect ° סטריאטום 170-240 (איור 2 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כאמור בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfection של התלמוס וההיפותלמוס (איור 2 ד, טבלת 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניתוח כפי שתואר בסעיף 1.2. בuelectroporation טרו של עוברי E12-E13 שימוש התלמוס וההיפותלמוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 1-1.5 DNA-פתרון μl המכיל 4 מיקרוגרם DNA בחדר לרוחב (משמאל או מימין) דרך נימי ורוסיליקט מוכנות. חכה במשך 2-3 דקות, עד שהפתרון הוא מתפזר לחדר השלישי. לחלופין ישירות להזריק לתוך החדר השלישי. הערה: זה משפר ספציפי אבל עלול לגרום לירידה בשיעור הישרדות (סיכון גבוה לניזק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מתח באמצעות אלקטרודות פלטינה מלקחיים מהסוג המיוחדות (אלפית שני אורך 50 מחזור המרווח, msec הפסקה 950 מרווח). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באלקטרודה 0.5 או 3 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במתח הנע 33-35 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים במרכז אלקטרודות רק אחורי primordia האוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לtransfect זוויות שימוש התלמוס 25-40 מעלות, לtransfect ° ההיפותלמוס 90-180 (איור 2 ד). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע / טיפול שלאחר ניתוח electroporation הודעה כdescribed בסעיף 1.4. להקריב את העכברים ולנתח את העוברים 6 ימים לאחר electroporation (E18) כמפורט בסעיף 3. </li></ol></li></ol> 3. זלוף קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> paraformaldehyde החם 4% (PFA) עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 50 מיליליטר עם PBS (4 ° C) ומזרק שני עם PFA חימם. למנוע בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את המזרקים לברזלי שלוש-דרך. חבר את הקצה השלישי לסט עירוי מכונף (פרפר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את סט העירוי המכונף עם PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זִלוּף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמוק להרדים את העכברים (בהריון או לאחר לידה transfected) עם יישום תת עורית של קטמין הידרוכלוריד (60 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (7.5 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר את שלב הסובלנות כירורגית על ידי חוסר תגובה לבוהן קמצוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלל הבטן מתחת רק כלוב הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך את הסרעפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתוח בזהירות את כלוב הצלעות באמצעות חתך בדואראתר אח עד עצם הבריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את הקצה של הפרפר לתוך החדר השמאלי בלב (החל מהשיא של הלב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את תוספת פרוזדורי שמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט perfuse העכבר עם PBS (כ -10 מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור הסתום המשולש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse העכבר עם 5-10 מיליליטר PFA 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את העכבר באמצעות מספריים ולנתח את המוח מתחיל בנקב הגדול. לבצע הנתיחה כפי שפורסם בעבר 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Postfixate המוח במשך 2 ימים בPFA 4%. שמור את המוח על 4 מעלות צלזיוס בחושך. </li></ol></li></ol> 4. אימונוהיסטוכימיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 70 מיקרומטר חלקים (לדוגמא, עם vibratome). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: שפר את הקרינה עם מכתים נוגדן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום את החלקים עבור שעה 1 ב RT (0.1-0.2% Triton X-100, 5% בסרום עז נורמלי) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה O / N עם הנוגדן המתאים (אנטי-GFP, 1: 1,000) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף 3-5 פעמים עם חיץ 0.1 M פוספט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שעה 3-5 עם נוגדן פלואורסצנטי מצומדות- המתאים המשני (אלקסה פלואוריד 488 נגד הארנב-IgG מצומדות, 1: 1,000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונאלי: Counterstain עם 4-6-diaminodino-2-phenylindole (DAPI, 0.2 גר &#39;/ מיליליטר במאגר M 0.1 פוספט) 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הקרינה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתאים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+Visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: Visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).</li><li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex.">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cereb Cortex. 19 (July), i120-i125 (1991).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J Comp Neurol. 483 (3), 329-340 (2005).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">Long-term, selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J Neurosci. 27 (19), 5007-5011 (2007).</li><li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation.">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J Neurosci Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li><li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> FNMOL. 4 (November), 37 (2011).</li><li>Tomita, K., Kubo, K. I., Ishii, K., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupted-in-schizophrenia-1+(Disc1)+is+necessary+for+migration+of+the+pyramidal+neurons+during+mouse+hippocampal+development.">Disrupted-in-schizophrenia-1 (Disc1) is necessary for migration of the pyramidal neurons during mouse hippocampal development.</a> Hu Mol Gen. 20 (14), 2834-2845 (2011).</li><li>Niwa, M., Kamiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockdown+of+DISC1+by+In+Utero+Gene+Transfer+Disturbs+Postnatal+Dopaminergic+Maturation+in+the+Frontal+Cortex+and+Leads+to+Adult+Behavioral+Deficits.">Knockdown of DISC1 by In Utero Gene Transfer Disturbs Postnatal Dopaminergic Maturation in the Frontal Cortex and Leads to Adult Behavioral Deficits.</a> Neuron. 65 (4), 480-489 (2010).</li><li>Nakahira, E., Kagawa, T., Shimizu, T., Goulding, M. D., Ikenaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+that+ventral+forebrain+cells+migrate+to+the+cortex+and+contribute+to+the+generation+of+cortical+myelinating+oligodendrocytes.">Direct evidence that ventral forebrain cells migrate to the cortex and contribute to the generation of cortical myelinating oligodendrocytes.</a> Dev Biol. 291 (1), 123-131 (2006).</li><li>Baumgart, J., Grebe, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C57BL/6-specific+conditions+for+efficient+in+utero+electroporation+of+the+central+nervous+system.">C57BL/6-specific conditions for efficient in utero electroporation of the central nervous system.</a> J Neurosci Methods. 240, 116-124 (2015).</li><li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system.">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li><li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+in+utero+electroporation:+controlled+spatiotemporal+gene+transfection.">Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection.</a> JoVE. (54), (2011).</li><li>Guedel, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inhalation anesthesia: a fundamental guide. , (1937).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> JoVE. (65), e3564 (2012).</li><li>Mizutani, K., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitors+resume+generating+neurons+after+temporary+inhibition+of+neurogenesis+by+Notch+activation+in+the+mammalian+cerebral+cortex.">Progenitors resume generating neurons after temporary inhibition of neurogenesis by Notch activation in the mammalian cerebral cortex.</a> Development. 132 (6), 1295-1304 (2005).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev, Growth &amp; Differ. 50 (6), 507-511 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes in detail how to transfect the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus of C75BL/6 mice. With all the provided information this is the first protocol, which supplies all necessary information to easily recreate transfections of these cerebral regions in the C57BL/6 mouse. Previous publications are mostly focused only on a few specific regions and therefore the detailed information needed for specific transfections is only scarcely standardized. 
The position and the size of the electrode as well as the applied voltage for the corresponding embryonic stage, which are the critical steps for effective and specific transfections, are precisely described. The provided angle-map helps to orientate the electrodes for specific electroporation. The locations of the electrodes are additionally shown on an embryo in the uterus, an embryo in the amniotic sac and also on a pure, dissected embryo. All of this is intended to help in identifying the correct positions of the electrodes. 
Usage of the appropriate voltage is a central aspect in the provided protocol. High voltages decrease the survival rate, whereas low voltages reduce the transfection efficiency 2,3,12. Voltage recommendations given in this protocol are specific for C57BL/6 mice and slightly differ from these for CD12,3,12. CD1 mice tolerate higher voltages than C57BL/6 mice and therefore higher voltages might be used for transfecting CD1 mice12. No data exist for other mouse strains, but the standards might need some modifications. 
A further central point is the size of the electrode. The usage of a smaller electrode, rather than a bigger one, is always recommended for experiments where specificity is important. Smaller electrodes enhance specificity4,12. If the specificity of the transfection is not the main point, especially for inexperienced experimenters, bigger electrodes enhance the chance of hitting the desired region. Thereby one has to keep in mind that electrodes covering too much of the embryo, might affect the heart rhythm and lead to reduced survival. For example a 10 mm electrode covers the whole E12 embryo and therefore is not recommended for transfecting E12 embryos, even if specificity is not the primary goal. 
The stages used in this protocol were chosen exemplary. Considering the fact that progenitors that are transfected on a certain time point give rise to a particular type of neuron the embryonic stages for transfection can be adapted to the specific aim of the study. For instance during cortical development, neurons are born at different time points, forming the six cortical layers in a sequential manner. Hence, depending of the time point of transfection the transfected progenitors give rise to neurons of a specific layer2,17.
For a successful transfection the following points also should be observed. First, the careful preparation and injection of the glass capillaries play a crucial role for the survival of the embryos and therefore for effective transfection. Second, the selection of an appropriate DNA concentration can also be very important and might have to be specifically adapted for different vectors18. Third, application of high voltages affects neighboring embryos, and therefore transfection of neighboring embryos might reduce the survival of these embryos. Further it has also been recommended to avoid the embryos closest to the vaginal duct, because the damage of these embryos might lead to abortion18.
Besides great advantages the technique of in utero electroporation has its drawbacks, which should be taken into consideration while designing experiment. First the regions, which can be efficiently transfected, are manly restricted to areas surrounding the ventricles. This is due to the fact that the plasmid-solution has to be injected into a ventricle. Further, even with all the details provided in this protocol it is not possible to transfect all cells out of a specific region. Even the number of transfected cells is hardly controllable. The analysis of the gene function is not restricted to embryonic stages. Adult mice can also be analyzed because the transfection of postmitotic neurons lasts at least up to 4 months13, but is not passed to the next generation. 
Further specifications, such as specifically electroporating thalamic and hypothalamic nuclei or temporally addressing cortical layers can additionally broaden the scope. The combination of genetically engineered mice, or inducible systems in with the in utero electroporation also additionally enhances possible applications. 
With all the given facts, this protocol facilitates specific transfections and therefore reduces the number of animal used. Standardization of the protocol additionally enhances the comparability of the obtained results.

מאז התיאור הראשון בשנת 2001 על ידי שלוש קבוצות עצמאיות 1-3 אני n electroporation ברחם הפך לכלי סטנדרטי בשימוש נרחב לניתוח ביטוי גנים במערכת העצבים המרכזית של המכרסמים. בהשוואה לדור של עכברי נוקאאוט, שהוא, למרות טכניקות שיפור ברציפות, עדיין זמן וכסף רב, ברחם הערעורים electroporation בשל הפשטות שלה. אז, ברחם electroporation מאפשר gain- מהיר ויעיל ומחקרי הפסד של פונקציה 4. לtransfect האזורים במוח, התמיסה המכילה את הפלסמיד הטעון השלילי מוזרקת לתוך חדר. במהלך הדופק החשמלי, ה- DNA הטעון השלילי נודד לכיוון הקוטב החיובי ולכן אזור transfected ניתן לבחור פשוט על ידי שינוי המיקום של הקוטב החיובי. זה לעתים קרובות הוכח כי אזורים רבים של מערכת העצבים המרכזית יכולים להיות ת&quot;אrgeted 3,5-8. לדוגמא, המחקרים האחרונים מראים transfections הספציפי של ההיפוקמפוס, קליפת אגסי או סטריאטום 9-11. עם זאת, המידע על העמדות המתאימות הם לעתים קרובות טופל רק בקושי והם לא תמיד קלים להעביר לזנים שונים עכבר. Transfection של שלבים עובריים מסוימים הוא רחוק מכך. גורמים המשפיעים על רבים חייבים להילקח בחשבון בעת בחירת ההגדרה לספציפי electroporation ברחם. ראשית, כדי transfect אופטימלי השלבים עובריים המתאימים, יש צורך בידע על המתח המתאים. מתח גבוה להקטין את שיעור ההישרדות, ואילו מתח נמוך להפחית את יעילות transfection 2,3,12. גם הגודל של ההנעה אלקטרודה ממלא תפקיד מכריע, משום שהשימוש במשוטי אלקטרודה שתוצאות גדולות מדי בסגוליות מופחתות או יכול לגרום למוות בשל חיבה של קצב הלב 4,12,13. מיושםמתח ואת הגודל והמיקום של ההנעה אלקטרודה הם התכונות החשובות ביותר שיש לשקול, אבל יש גם גורמים נוספים המשפיעים על התוצאה של electroporation, כמו הכמות השימושית של ה- DNA-פתרון. פיתחנו פרוטוקול מפורט המאפשר transfection המהיר והיעיל של אזורי מוח השונים של עכבר C57BL / 6 12. בפרוטוקול זה מידע מפורט על המתח כדי לשמש ואת הגודל של ההנעה אלקטרודה לסגולית משופרים מסופק. יתר על כן, מידע על החדר להיות מלא יחד עם המלצות לסכום של פתרון פלסמיד ואת המיקום של האלקטרודה מסופקת. אינדיקציה למידע מיקום מפורט במפה והדמיה נוספת של עמדות אלה מאפשרת ספציפיים פשוטים ויעילים ברחם electroporation של קליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי לא,הוא קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב, התלמוס וההיפותלמוס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:328px;">EndoFree Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:215px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:188px;">12362</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Green</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0301.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pCAGGS</td>
			<td>Addgene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">borosilicate glass capillaries (0.8-0.9 mm diameter)</td>
			<td>Wold Precision Instrument Inc.</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoflurane (Forene)</td>
			<td>Abbott</td>
			<td>PZN 4831850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Carprofen (Rimadyl)</td>
			<td>Pfizer GmbH</td>
			<td>approval number: 400684.00.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eye ointment (Bepanthen Augen und Nasensalbe)</td>
			<td>Bayer&#160;</td>
			<td>PZN 01578681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">0.9% benzyl alcohol 0.9% saline solution</td>
			<td style="width:215px;">Pharmacy 
			of the University Medical Center Mainz</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">gauze (ES-Kompressen)</td>
			<td>Hartmann</td>
			<td>407835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sterile 5-0 Perma-Hand Silk Suture</td>
			<td>Ethicon Johnson &#38; Johnson</td>
			<td>K890H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ring forceps 1/ 1.5 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11101-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ring forceps 4.8/ 6 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11106-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ring forceps 2.2/ 3 mm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adson Forceps-Serrated Straight 12 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>1106-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">IrisScissors-Delicate Straight-Sharp/Blunt 10 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14028-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mayo-Stille Scissors-Straight 15 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14012-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Castroviejo NeedleHolder-with Lock-Tungsten Carbide 14 cm</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>12565-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Elektroporator CUY21 SC&#160;</td>
			<td>Nepa Gene Co.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FST 250 Hot Bead Sterilizer</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microgrinder EG-44</td>
			<td>Narishige</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">P-97 Micropette Puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum electrodes 650P 0.5 mm</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CUY650P0.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum electrodes 650P 3 mm</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CUY650P3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum electrodes 650P 5 mm</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CUY650P5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Platinum electrodes 650P 10 mm</td>
			<td>Nepagene</td>
			<td>CUY650P10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anesthesia system</td>
			<td>Rothacher-Medical GmbH</td>
			<td>CV-30511-3 Vapor 19.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heating plate</td>
			<td>Rothacher-Medical GmbH</td>
			<td>HP-1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Temperature Controller 220V AC</td>
			<td>Rothacher-Medical GmbH</td>
			<td>TCAT-2LV</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortex-, hippocampus-, thalamus-, hypothalamus-, lateral septal nucleus- and striatum-specific in utero electroporation in the c57bl/6 mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

איור 2, מציג דוגמאות לספציפיות electroporation ברחם של אזורי פיתוח לקליפת retrosplenial, הקורטקס המוטורי, הקליפה החושית, קליפת אגסי, קורנו ammonis 1-3, gyrus המשונן, סטריאטום, הגרעין במחיצה לרוחב , התלמוס וההיפותלמוס. תוצאות transfections מוצגות ליד הזווית המומלצת (איור 2). להדמיה טובה יותר של הזוויות in vivo העמדה של האלקטרודה (0.5 מ&quot;מ) מוצגת גם על עובר (איור 5, עובר ברחם, עובר בצק מי שפיר, עובר גזור). על מנת לספק טבלת סקירת 1 סיכמה את העובדות הרלוונטיות לtransfection הספציפי. יתר על כן, זה היה הראה כי הגודל של האלקטרודה ממלא תפקיד מכריע עבור הסגוליות (איור 6). גודל גדול יותר של משוטי אלקטרודה מוביל ללהrger transfected אזורים, כמופת שמוצגת באיור 6. בהמשך, אלקטרודות שכיסוי גדול מדי יותר מדי של העובר, ובכך משפר את הסיכון הלמשפיע על קצב הלב של עובר (איור 7). לדוגמא ההנעה אלקטרודה 10 מ&quot;מ מכסה את כל עובר E12 (איור 7). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig1.jpg" /> איור 1. ברחם electroporation. צעדים בסיסיים של הביצועים של electroporation ברחם מוצגים. () מציג את כל ההתקנה של הניתוח, עם העכבר מונח על פלטה חשמלית כבר הרדים עם isoflurane. (ב) החיטוי של אזור הניתוח הוא צעד חיוני לפני פתיחת חלל הבטן (C) של העכבר. הפתרון המכיל DNA (ד) הוא בצבע עם G המהירבירוק, המאפשר ההדמיה של זריקה מוצלחת (E, F). זריקה מוצלחת לחדר לרוחב תוצאות למקום בצורת חצי סהר. (ז) לאחר הזרקת המתח המתאים מיושם באמצעות אלקטרודות פלטינה סוג מלקחיים. (H) לאחר החלפת זהירות הרחם לתוך חלל בטן פצע הניתוח הוא איחוי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53303/53303fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig2.jpg" /> איור 2. זווית-המפה לelectroporation של אזורים ספציפיים בקליפת המוח בעכברים, ההיפוקמפוס, גרעין במחיצה לרוחב, סטריאטום, התלמוס וההיפותלמוס. העמדות המתאימות לקוטב החיובי ושלילי, מסומנות בשרטוט. ל( AC </stro<html> ng&gt;) העמדות מצוינות להזרקת DNA-הפתרון לחדר ממני. לזריקות לתוך החדר השמאלי, הזוויות-הפוך מראה. Transfections הספציפי אומתו בהיסטולוגיה. (א) מציג את העמדות של הקוטב החיובי ושלילי לtransfecting אזורים בקליפת המוח (הקורטקס retrosplenial (RSC), הקורטקס המוטורי (MC), הקליפה החושית (SSC) וקליפת אגסי (PC). (ב) מציג את עמדות של הקוטב החיובי ושלילי לtransfecting התצורות בהיפוקמפוס (קורנו ammonis 1-3 (CA1, Ca 2, CA3) והרכס המשונן (DG). (ג) מציג את העמדות של הקוטב החיובי ושלילי לtransfecting סטריאטום (STR) והגרעין במחיצה לרוחב (LS). (ד) מציג את העמדות המתאימות של אלקטרודות לtransfecting התלמוס (TH) וההיפותלמוס (HY). מעובד מתוך אומגרט ג &#39;ונ&#39; גריב, 2015 12.<html> נ.ב.: //www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53303/53303fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig3.jpg" /> אתר נקר איור 3.. המיקום האופטימלי להזרקה של פתרון ה- DNA הוא כ 0.75 מ&quot;מ העטרה מתפר lambdoidal ו 0.5 מ&quot;מ לרוחב מתפר sagittal. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53303/53303fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig4.jpg" /> מיקום איור 4. של primordium האוזן. העמדה של primordium האוזן מוגדר בבירור (חץ).nk &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 5 א &#39;" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig5A.jpg" /><img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig5B.jpg" /><img alt="איור 5 ג" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig5C.jpg" /><img alt="5D איור" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig5D.jpg" /> ויזואליזציה איור 5. של הזוויות בעובר. להדמיה טובה יותר את העמדות המתאימות לקוטב החיובי (מסומן בסימן חיובי כחול) והשלילי עבור transfections הספציפי של האזורים בקליפת המוח (הקורטקס retrosplenial, הקורטקס מוטורי, החושית קליפה, אגסי קליפה), האזורים בהיפוקמפוס (קורנו ammonis (CA) 1-3, gyrus המשונן (DG)),גרעין רוחב המחיצה, סטריאטום, התלמוס וההיפותלמוס מוצג על עובר ברחם, עובר בשק השפיר ועל עובר גזור (כל E15,5). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53303/53303fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig6.jpg" /> ספציפי איור 6. של transfection תלוי בגודל האלקטרודה. גודל מוגבר של ההנעה האלקטרודה מפחית את הספציפיות של transfection. הדבר בולט במיוחד בשלבים צעירים עובריים (E12, למעלה), אלא גם נראה בשלבים מאוחר עובריים (E17, למטה). מעובד מתוך אומגרט ג &#39;וגריב נ&#39; 2015 12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53303/53303fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a><img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53303/53303fig7.jpg" /> גודל איור 7. של ההנעה אלקטרודה בהשוואה לגודל של עובר E12. אלקטרודות שכיסוי גדול מדי יותר מדי של העובר ולכן מעלים את הסיכון לחיבה של קצב הלב. לדוגמא, אלקטרודה 10 מ&quot;מ (מימין) מכסה את כל עובר E12 ולכן אינו מומלצת, גם אם סגוליות היא לא המטרה העיקרית. מעובד מתוך אומגרט ג &#39;וגריב נ&#39; 2015 12. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53303/53303fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אזור מיקוד </td><td> זָוִית </td><td colspan="2"> מיקום של האלקטרודה </td><td> גיל של עובר </td><td> amou DNAריכוז NT / </td><td> מתח </td><td> גודל של האלקטרודה </td></tr><tr><td> Cortex Retrosplenial </td><td> 330 ° - 0 מעלות </td><td colspan="2"> מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן </td><td> E14 (E11-E17) </td><td> 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 36- 38 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> מנוע Cortex </td><td> 0 ° - 40 ° </td><td colspan="2"> מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן </td><td> E14 (E11-E17) </td><td> 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 36- 38 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> קליפה החושית </td><td> 40 ° - 95 ° </td><td colspan="2"> מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן </td><td> E14 (E11-E17) </td><td> 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 36- 38 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> PiriforCortex מ &#39; </td><td> 95 ° - 110 מעלות </td><td colspan="2"> מרכז אלקטרודות רק קדמי של primordia האוזן </td><td> E14 (E11-E17) </td><td> 1.5- 2 μl / 2.7- 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 36-3 8 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> קורנו Ammonis (CA) 1 </td><td> 250 מעלות - 275 מעלות </td><td colspan="2"> מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן </td><td> (E14-) E15 </td><td> 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 38- 40 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> Ca 2 </td><td> 230 ° - 250 ° </td><td colspan="2"> מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן </td><td> (E14-) E15 </td><td> 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 38- 40 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> CA3 </td><td> 210 ° - 230 ° </td><td colspan="2"> מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן </td><td> (E14-) E15 </td><td> 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 38- 40 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> המשונן gyrus </td><td> 190 ° - 210 ° </td><td colspan="2"> מרכז של הקוטב החיובי באמצע primordium האוזן </td><td> (E14-) E15 </td><td> 2 μl / 2 מיקרוגרם / μl </td><td> 38- 40 </td><td> 3 5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> סטריאטום </td><td> 170 ° - 240 ° </td><td colspan="2"> מרכז של האלקטרודות ברמה של primordia האוזן </td><td> E12 </td><td> μl 1 / 4 מיקרוגרם / μl </td><td> 33 </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> רוחב מחיצת גרעין </td><td> 100 ° - 170 ° </td><td colspan="2"> מרכז של האלקטרודות ברמה של primordia האוזן </td><td> E12 </td><td> μl 1 / 4 מיקרוגרם / μl </td><td> 33 </td><td> 0.5 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> התלמוס </td><td> 25 ° - 40 ° </td><td colspan="2"> מרכז electodes רק אחורי פרי האוזןmordia </td><td> E12- E13 </td><td> 1-1.5 μl / 4-2.7 מיקרוגרם / μl </td><td> 33- 35 </td><td> 0.5- 3 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> ההיפותלמוס </td><td> 90 ° - 180 ° </td><td colspan="2"> מרכז electodes רק אחורי primordia האוזן </td><td> E12- E13 </td><td> 1-1.5 μl / 4-2.7 מיקרוגרם / μl </td><td> 33- 35 </td><td> 0.5- 3 מ&quot;מ </td></tr></tbody></table> הטבלה 1:. סיכום של תוצאות כלולות בטבלה זו היא כל המידע הרלוונטי לtransfection הספציפי של האזורים בקליפת המוח שתוארו. הוא מכיל פרטים על האזור הממוקד, הזווית, העמדה של האלקטרודה, השלב העוברי, כמות והריכוז מיושמת של פתרון ה- DNA, המתח ואת הגודל של האלקטרודה.

Watch this Scientific Journal Video about Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse at JoVE.com

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation בC57BL / 6 העכבר

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

cortex-hippocampus-thalamus-hypothalamus-lateral-septal-nucleus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

27.8K Views.  University Medical Center, JGU Mainz. This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Video: Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental pathways. Several powerful and well established transgenic technologies are available to manipulate gene expression levels in mouse, allowing for the generation of both loss- and gain-of-function models. However, the generation of mouse transgenics is both costly and time consuming. Alternative methods of gene manipulation have therefore been widely sought. In utero electroporation is a method of gene delivery into live mouse embryos1,2 that we have successfully adapted3,4. It is largely based on the success of in ovo electroporation technologies that are commonly used in chick5. Briefly, DNA is injected into the open ventricles of the developing brain and the application of an electrical current causes the formation of transient pores in cell membranes, allowing for the uptake of DNA into the cell. In our hands, embryos can be efficiently electroporated as early as embryonic day (E) 11.5, while the targeting of younger embryos would require an ultrasound-guided microinjection protocol, as previously described6. Conversely, E15.5 is the latest stage we can easily electroporate, due to the onset of parietal and frontal bone differentiation, which hampers microinjection into the brain. In contrast, the retina is accessible through the end of embryogenesis. Embryos can be collected at any time point throughout the embryonic or early postnatal period. Injection of a reporter construct facilitates the identification of transfected cells.
To date, in utero electroporation has been most widely used for the analysis of neocortical development1,2,3,4. More recent studies have targeted the embryonic retina7,8,9 and thalamus10,11,12. Here, we present a modified in utero electroporation protocol that can be easily adapted to target different domains of the embryonic CNS. We provide evidence that by using this technique, we can target the embryonic telencephalon, diencephalon and retina. Representative results are presented, first showing the use of this technique to introduce DNA expression constructs into the lateral ventricles, allowing us to monitor progenitor maturation, differentiation and migration in the embryonic telencephalon. We also show that this technique can be used to target DNA to the diencephalic territories surrounding the 3rd ventricle, allowing the migratory routes of differentiating neurons into diencephalic nuclei to be monitored. Finally, we show that the use of micromanipulators allows us to accurately introduce DNA constructs into small target areas, including the subretinal space, allowing us to analyse the effects of manipulating gene expression on retinal development.

Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation

In utero electroporation allows for rapid gene delivery in a spatially- and temporally-controlled manner in the developing central nervous system (CNS). Here we describe a highly adaptable in utero electroporation protocol that can be used to deliver expression constructs into multiple embryonic CNS domains, including the telencephalon, diencephalon and retina.

ג&#39;ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

The ability to manipulate gene expression is the cornerstone of modern day experimental embryology, leading to the elucidation of multiple developmental ...

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג&#39;ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the use of IUE for investigating behavior or neuropathology in the adult brain has been limited by insufficient methods for monitoring of IUE transfection success by non-invasive techniques in postnatal animals. 
 For the present study, E16 rats were used for IUE. After intraventricular injection of the nucleic acids into the embryos, positioning of the tweezer electrodes was critical for targeting either the developing cortex or the hippocampus. 
 Ventricular co-injection and electroporation of a luciferase gene allowed monitoring of the transfected cells postnatally after intraperitoneal luciferin injection in the anesthetized live P7 pup by in vivo bioluminescence, using an IVIS Spectrum device with 3D quantification software. 
 Area definition by bioluminescence could clearly differentiate between cortical and hippocampal electroporations and detect a signal longitudinally over time up to 5 weeks after birth. This imaging technique allowed us to select pups with a sufficient number of transfected cells assumed necessary for triggering biological effects and, subsequently, to perform behavioral investigations at 3 month of age. As an example, this study demonstrates that IUE with the human full length DISC1 gene into the rat cortex led to amphetamine hypersensitivity. Co-transfected GFP could be detected in neurons by post mortem fluorescence microscopy in cryosections indicating gene expression present at &ge;6 months after birth.
 We conclude that postnatal bioluminescence imaging allows evaluating the success of transient transfections with IUE in rats. Investigations on the influence of topical gene manipulations during neurodevelopment on the adult brain and its connectivity are greatly facilitated. For many scientific questions, this technique can supplement or even replace the use of transgenic rats and provide a novel technology for behavioral neuroscience.

Generation of Topically Transgenic Rats by In utero Electroporation and In vivo Bioluminescence Screening

Genes can be manipulated during development of the cortex or the hippocampus of the rat via in utero electroporation (IUE) at E16, to enable fast and targeted modifications in neuronal connectivity for later studies of behavior or neuropathology in adult animals. Postnatal in vivo imaging for control of IUE success is performed by bioluminescence of activating co-transfected luciferase.

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation ו<em&gt; בvivo</em&gt; הקרנת פליטת אור

 In utero electroporation (IUE) is a technique which allows genetic modification of cells in the brain for investigating neuronal development. So far, the ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס<em&gt; ברחם</em&gt; Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by immunizing mice with neurogenic peptides to direct an inflammatory attack toward components of the peripheral nervous system (PNS). Recent advances have enabled the induction of EAN in the relatively resistant C57BL/6 mouse line using myelin protein zero (P0)106-125 or P0180-199 peptides delivered in adjuvant combined with the injection of pertussis toxin. The ability to induce EAN in the C57BL/6 strain allows for the use of the numerous genetic tools that exist on this mouse background, and thus allows the sophisticated study of disease pathogenesis and interrogation of the mechanistic action of novel therapeutics in combination with transgenic approaches. In this study, we demonstrate a simple approach to successfully induce EAN using the P0180-199 peptide in C57BL/6 mice. We also outline a protocol for the assessment of functional deficits that occur in this model, accompanied by an array of neuropathological features. Thus, this model is a powerful experimental model to study the pathogenesis of human peripheral demyelinating neuropathies, and to determine the efficacy of potential therapies that aim to promote myelin repair and protect against nerve damage in autoimmune neuritis.

This report outlines a simple approach to successfully induce experimental autoimmune neuritis (EAN) using the myelin protein zero (P0)180-199 peptide in combination with Freund&#39;s complete adjuvant and pertussis toxin. We present a sophisticated paradigm capable of accurately assessing the extent of functional deficits and neuropathology that occur in this EAN.

גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

Experimental autoimmune neuritis (EAN) is a well-appreciated experimental model of autoimmune peripheral demyelinating diseases. EAN disease is induced by ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

ג'ין אספקה יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, רוחב מחיצת גרעין, וסטריאטום ספציפי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Transfection של תאים עכבר רשתית גנגליון על ידי In vivo Electroporation

ג'ין אספקה ​​יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation

עכבר בתוך הרחם Electroporation: ג'ין מבוקרת transfection Spatiotemporal

להדמיה מניפולציה גנטית של דנדריטים עם קוצים בקליפת עכבר היפוקמפוס מוחין באמצעות

דור של חולדות למריחה מהונדסים על ידי

מניפולציה גנטית של העכבר באמצעות פיתוח היפותלמוס

ברחם Electroporation גישות לחקר רגישות של העצבית subpopulations וקישוריות תא יחיד

גישה פשוטה כדי לגרום לדלקת בעצה חיסון ניסיוני בעכברים C57BL/6 עבור הערכות Neuropathological פונקציונלי

גרימת Cre-לקס רקומבינציה ב העכבר קליפת המוח דרך בתוך הרחם אלקטרופורציה

ניתוח שתל שבלולי והקלטות תגובה חשמלית עורר גזע המוח בעכברים C57BL/6

ג'ין אספקה יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation