DMK נתמכה על ידי מענק IRACDA מNIGMS (K12GM093857) לאוניברסיטת וירג&#39;יניה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק DK34153 NIDDKD לג&#39;ון ר Grider.

Catamount Research and Development, Inc., creator of the GIMM system, covered publication fees for this manuscript.

תנועתיות מעיים נצפתה ותיארו ממספר נקודות המבט המבוססים על הטבע של הפרמטרים שרשמו. הקלטת וידאו ומיפוי spatiotemporal הוכיח כלי רב ערך המאפשר ניתוח של תנועה ו / או הנעה כוללת על מגזרים של מעיים ארוכים כמו גם ניתוח של פעילות בנקודות מסוימות לאורך הקטע. הגישה שננקטה להקלטת וידאו ומיפוי spatiotemporal יכול להיות כפול ומשקפת את האזור שנבדק ואת אופי תוכן luminal. במגזרים שבי מעיים תוכן luminal יותר נוזלים ובמעי גס הפרוקסימלי בי התוכן יותר חצי מוצק, פעילות הנגרמת על ידי הקדמת intraluminal של נוזל על ידי בולוס או עירוי. מפות Spatiotemporal עשויות מרשומות וידאו אלה נועדו לייצג את התנועה של כל הקטע, כמתואר לעיל. לעומת זאת, באמצע למעי גס דיסטלי בי התוכן הוא מוצקים יותר, פעילות היא ביוזמת החדרת Pelle צואהt (אפוקסי מצופה גלולה טבעית או מלאכותי גלולה) ומפות spatiotemporal נועדו לשקף את התנועה של גלולה דרך המעי הגס כפי שמודגמים במאמר יופיטר של et al הופמן. 13. כך ההגדרה של הניסוי והניתוח היא קריטיות ותלויה בסוג של גירוי והאזור נחקר. לכן, השלבים הקריטיים עבור דור וניתוח של מפות spatiotemporal של תנועתיות מעיים הנגרמים על-נוזל הם: 1) ההסרה נכונה של לפדר מהרקמה גזור; כיול תמונה נכון לפני ההקלטה 2); 3) ההסרה נכונה של חפצים בדור STmap וניתוח; התקנה נכונה של מערכת הניתוח 4); ו 5) צובר מיומנות הידנית לצנתר ותפר את המגזרים מבלי לפגוע בהם. בעוד שהשימוש בSTmaps של קוטר luminal שיפר את היכולת לחזות ולנתח דפוסי תנועתיות מלאים על אזור של מעי, הטכניקה המתאימה ביותר לשימוש כאשר בשילוב עםמדידות פונקציונליות של לחץ או שריר התכווצות 2,15,20. לדוגמא, בעוד כמה התכווצויות שרירים עשויות להשתנות קוטר luminal מעט ותהיה גלוי בכמה STmaps (כלומר, אדוות myogenic) הם לא יכולים באמת לגרום לכל הנע או ערבוב של תוכן מעי 25. זה לא יכול להיות ידוע ללא צימוד של טכניקה זו למדידות פונקציונליות אחרות. כמו כן, הטבע של הכנות רקמות רבות בסוג זה של מערכת (כלומר, מערכת luminal סגורה או זלוף luminal הקבוע על ידי מערכת משאבה) מוביל לחפצים בתוך STmaps. כך, המשתמש חייב להיות מודע לאופן ההכנה שלהם ספציפי האיבר והניסוי יכולים להוביל חפצים בנתונים ובדרכים להימנע או לא לכלול ממצאים אלה בניתוח נתונים (לדוגמא, קווים אנכיים מושרה לפדר או pixelation הכהה בשל חוסר יכולתה של הרקמה ל לגרש נוזל מהמערכת בהכנת luminal סגור). ישנן שיטות רבות לזלוף luminal של בטקט קטע מעי מלבד מערכת סגורה. שיטה אחת היא להשתמש במערכת פתוחה השומרת על לחץ קבוע intraluminal / גב באמצעות צינור שהועלה ו / או שסתום חד כיווני בסוף האנאלי של ההכנה 8-10,30 במקום. זה מאפשר לנוזל לצאת מההכנה במהלך צירים הנעה. כמערכת היא התקנה בעיקר כדי לזהות שינויים בקוטר luminal, אלה התכווצויות או דפוסי תנועתיות שאינו משפיעים על קוטר luminal מאוד לעתים קרובות קשות לדמיין על ידי פרוטוקול זה. מאז שינויים בהצללת פיקסל בתוך STmap מבוססים על שינויים בקוטר luminal, דפוסי תנועתיות שלא לגרום לשינויים גדולים בקוטר לא דמיינו גם בשיטה זו אם התכווצויות חזקות נמצאות גם בתוך אותה ההקלטה. כפי שתואר להדמיה והניתוח של התכווצות אדווה-סוג (איור 3), הגדרת קווי הניתוח בהקלטת הווידאו לא קרוביםo קיר הרקמה יכול לייתר את הבעיה. שיטה זו מקטינה את הקוטר המקסימאלי מוצג בתוך STmap, כך ניתן דמיינו התכווצויות שרק מינימאלי לשנות קוטר רקמה. אפשרות נוספת כדי לפתור את הבעיה היא לשנות את משך הזמן של קטע הווידאו ניתח, שלא לכלול התכווצויות אשר מאוד משפיעים על קוטר luminal, כך שהתכווצויות קטנות יותר הם דמיינו בקלות רבה יותר. זה מוביל לבעיה הפוטנציאלית של תנועתיות שמינימאלית משנה קוטר luminal מחפש דומה לSTmap הנפרד שבו צירים השתנו קוטר luminal מאוד. סיבה לכך הוא קביעת פיקסלים לבנים על המפה מבוססת על הקוטר הקטן ביותר בוידאו נתון. אם אין הרבה השתנות בקוטר בתוך הווידאו (מעט או ללא התכווצות של השריר המעגלי) התכווצויות קטנות מאוד שלא לשנות את הקוטר של ההכנה מאוד יכול להסתכל דומה להתכווצויות peristaltic מוידאו אחר. לכן, חשוב לשקול את הדמותאגדה בפינה הימנית העליונה של המפה. אם ההבדל בין הקטרים ​​המרביים והמינימאליים הוא קטן חשוב להשוות STmap לוידאו זה נוצר מלקבוע את תוקפו של שינוי גוון פיקסל כפי שהוא מיוצג בSTmap. לפיכך, בחינה של סרגל קנה המידה בשיתוף עם ההקלטה בפועל היא קריטית לתקן פרשנות של המפה. הקלטת וידאו ומיפוי spatiotemporal של מגזרי מעי הגס ויושמו במגוון רחב של מינים, כולל דג הזברה 26, עכבר 25,27 - 30, חולדה 7,9,30 - 33, שפן ניסיונות 5,6,8,13 - 19, 24,30,32,34,35, פוסום brushtail 12,36, ארנב 2,30,37,38, עוף 39, חזיר 40,41 ו -42 בני אדם. המינים הנחקרים ביותר הוא שפן הניסיונות. הדבר אינו מפתיע, משום שפן הניסיונות enteric h מערכת עצביםכהתאפיין ורוב לחלוטין מבחינה היסטורית זה כבר בעלי החיים הנחקרים ביותר במבחנה ביחס לתנועתיות הנעה של המעי 43. מיפוי Spatiotemporal כבר מיושם בעיקר למגזרים צינורי של מעי מבעלי חיים קטנים; עם זאת, מחקרים במערכות באמצעות הארנבת וחזיר שונה להדגים את היישום של מתודולוגיה זו לבעלי חיים גדולים יותר. במקרה של הארנב, הגישה זהה לזה של בעלי חיים קטנים יותר אלא שמגזרים ואמבטיות איבר גדולים שמשו 30. הגישה בשימוש בחזיר הייתה להשתמש לולאת exteriorized של מעי מחזיר בהרדמה ולא טבילה של קטע רקמה גזור לתוך אמבטיה איברים. כמו כן, STmaps נוצרו על ידי מתאם צולב ולא השיטה שקוף המשמשת ברוב המחקרים 40. ההכנה המבודדת, perfused vascularly הלולאה להקלטת וידאו ומיפוי spatiotemporal גם הוחל מינים קטנים יותר כגון חולדה <sup&gt; 33. מחקר שנערך לאחרונה על ידי אל Kuizenga et. הוא השימוש הראשון של STmaps של וידאו מוקלט דפוסי תנועתיות במגזרי vivo לשעבר של מעי אנושי 42; למרות, גישות STmapping יושמו לניתוח הקלטות מונו מטרי (לחץ) בבני האדם בvivo 3,44. דפוסי תנועתיות נרשמו ברקמה אנושית דומים לאלה שכבר נרשמו במודלים של בעלי חיים תוך שימוש בטכניקות דומות ולאמת את הסיומת של גישה זו לרקמות אנושיות. ראוי לציין כי STmaps שילוב מחקר זה נובע מקלטות וידאו עם מדידה של התכווצות שרירים נרשמה על ידי מתמרים כוח. מדידה של לחץ intraluminal על ידי קטטר מונו מטרי סיבים אופטיים המוכנס לתוך מגזר vivo לשעבר גם להמרה STmap, המציגה את הרבגוניות של STmap לדמיין יותר משינויים בקוטר luminal. מתח שרירים correlating זה בשילוב גישה, קיר תנועת לחץ וintraluminal מאפשרתלאנליזה פונקציונלית יותר מעמיקה של STmaps שנוצר משיא הווידאו. מחקרים של STmaps שנוצר מקיר תנועות ושינויים בקוטר luminal (המכונה גם Dmaps) אפשרו תיאורים מפורטים של תבניות תנועתיות כמו גלים הנעה בתנועה קרביות והתכווצויות מגזריות מקומיות. בעוד דפוסים אלה זוהו על ידי שיטות ניסיוניות קודם לכן, הגישה הנוכחית מאפשרת הגדרה מעודנת יותר של תנועות התכווצות מקומיות כגון אדוות והתכווצויות אנטי-peristaltic רומן 9,24,25,30,31,42. הבנייה של STmaps וניתוח של שינויים בדפוס תנועתיות יושמה לשאלות מפתח בתנועתיות מערכת העיכול של מעי ומעי גס. אלה כוללים: בידול של התכווצויות עצביות וmyogenic והגדרת התפקיד של תאי ביניים של קחאל 6,9,11,12,16,24,26,27,29 - 31,33,37 - 40,42, הבנה המורכבתיחסי גומלין בין שכבות שרירים מעגליות ואורך 2,7,8,11,12,32,39,40, בוחנים את ההשפעות של חומרים מזינים intraluminal 10,18,19, זני חיידקים 34, וצמיגויות 12,36 על דפוסי תנועתיות שונים, והבנת התפקיד של סוכנים שונים אנדוגני neurohormonal וסוכנים תרופתיים אקסוגניים 2,4 - 7,9,10,13 - 17,28,35,40 בדור והשינוי של תנועתיות. העתיד של טכניקה זו כרוך צימוד זה עם מדידות אחרות, כוללים לחץ, אלקטרופיזיולוגיה ומתח / התכווצות. מחקרים שנעשה לאחרונה לעתים קרובות שילבו אחד או יותר ממדידות אלה בשיתוף עם הקלטת וידאו ומיפוי spatiotemporal לספק פרטים נוספים גומלים 2,42. יתר על כן, המערכת יכולה לשמש למדידת תנועתיות באיברים צינוריים והלא-צינורי אחרים. לדוגמא, נעשו ניסיונות במדידת תנועתיות קיבה באמצעותמערכת כזו, אבל הטכניקה והתוכנה צריכה עידון לכמת תנועתיות טובה יותר באיבר הלא-צינורי כזה 45. אין ספק שהשימוש בטכניקות מיפוי spatiotemporal לבד ובשילוב עם שיטות מסורתיות יותר של ניתוח יביא ליותר מעמיקה ובהבנה מקיפה של תנועתיות מערכת העיכול בעתיד.

שיטות שונות של הקלטה וניתוח תנועתיות מעיים פותחו במשך 150 השנים האחרונות 1. אלה נע בין הראשוניים in vivo תצפיות ותיאורים של ויליאם בומונט ושל וולטר קנון ליותר השיטות האחרונות של מדידה ופרשנות של הקלטה מרובה אתרים של מתח שרירים, לחץ intraluminal, ו / או קרום פוטנציאלי (כלומר, פוטנציאל junctional) 2 - 6. גישות אלה האחרונים לספק תמונת מצב של דפוסי תנועתיות הכלליים, אך מוגבלות במספר האתרים של הקלטה ואת תוקפו של ביון של נתונים לאזורים שבבין אתרי ההקלטה. הפיתוח האחרון של הקלטת וידאו וטכניקות מיפוי spatiotemporal (STmap) הפך אותו ניתן להתבונן ולנתח דפוסי תנועתיות מורכבים במגזרים שלמים vivo לשעבר של מעי גס ובמעי. גישות ראשוניות, שתוארו לראשונה לintesמגזרי tinal בסוף 1990 7,8, היו תלויים בתוכנה שתוכנן חוקר לנתח הקלטת וידאו; כמה קבוצות יש כעת נוצרו או שונו תוכנה למטרה זו 2,8 - 12. בעוד קבוצות רבות שנוצרו חבילות שלהם תוכנה או תוספים, כולם לנתח קטרים ​​של קטע רקמה ולהמיר אותם בקטרים ​​שונים לייצוג בגווני אפור. מערכת הקלטה והניתוח זמינה מסחרי בשם מערכת עיכול תנועתיות ניטור (GIMM) מספק גישת סוהר המאפשרת ניתוח של שתי תנועתיות הנעה באמצעות קביעת מהירות גלולה צואה במעי גס שפן הניסיונות דיסטלי 13, כמו גם ניתוח של דפוסי תנועתיות הנעה וערבוב עם גירוי נוזל במגזרים שלמים במעי 4,5,14 - 19. גישה השנייה, זה תלויה בדור והניתוח של STmaps ומתואר במאמר זה. מטרתה של שיטה זו היא להגדיל tהוא היכולת איכותית וכמותית לנתח דפוסי תנועתיות שונים נוכחים במעי. בעוד קבוצות אחרות השתמשו STmap לניתוח תנועתיות דרך התוכנה שלהם, זה הוא התיאור הראשון של כיצד להשתמש GIMM לנתח דפוסי תנועתיות על ידי דור של STmaps. בעבודה הנוכחית, אנו מספקים הוראות מפורטות צעד-אחר-צעד ב: הכנת רקמות מעי להקלטת וידאו, הגדרה נכונה של פרמטרים הקלטת וידאו למקסם את היכולת לזהות שינויים בקוטר רקמה, יצירת STmaps, כמו גם פרשנות וניתוח של STmaps באמצעות מערכת GIMM ותוכנת ImageJ. השיטה המתוארת כאן היא ספציפית לניתוח של זלוף luminal של נוזלים או חצי מוצק המכילים תרכובות המשפיעות על דפוסי תנועתיות מעי. שיטה לניתוח של הנעת כדור צואה מתוארת בנייר על ידי Mawe ועמיתים 13. השיטה הכללית המתוארת כאן יכולה להיותיחול על איברי שריר אחרים צינור חלק כגון: מעי דק, כלי דם, שופכה, השופכנים, וכו &#39;בעוד ששיטה זו בכוחות עצמו אינו מספקת נתונים על שינויים בלחץ או מתח שרירים, זה יכול להיות בשילוב עם השימוש בלחץ מתמרים, מתמרים כוח או מדידות אלקטרו לספק תמונה של דפוסי תנועתיות כחלק מקבוצות אחרות מלאה יותר הראו 2,15,20,21.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP358</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP366</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P285</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP328</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>For Krebs buffer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxygen (95%O2/5%CO2)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting pins</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting trays/dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dunkin Hartley Guinea Pigs</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>Strain 051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td>Freely available online.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GastroIntestinal Motility Monitor (GIMM)</td>
			<td>Catamount Inc., St. Albans, Vermont</td>
			<td></td>
			<td>Includes parts listed below.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pumps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Cameras</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath TransIllumination Backlights</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organ Baths</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Backlight Intensity Controls</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIMM Processor ImageJ Plugin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Connectors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex tubing for Peristaltic Pumps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Bath/Water Circulator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Included with GIMM.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spatiotemporal mapping of motility in ex vivo preparations of the intestines

גישות מרובות שימשו להקליט ולהעריך תנועתיות מערכת העיכול כולל: רישום שינויים במתח שרירים, לחץ intraluminal, ופוטנציאל הממברנה. כל הגישות הללו תלויים במדידה של פעילות במיקום אחד או מרובה לאורך הבטן בו זמנית אשר לאחר מכן מתפרשים על מנת לספק תחושה של דפוסי תנועתיות הכלליים. לאחרונה, הפיתוח של הקלטת וידאו וטכניקות מיפוי spatiotemporal (STmap) הפך אותו ניתן להתבונן ולנתח דפוסים מורכבים במגזרים שלמים vivo לשעבר של מעי גס ובמעי. נרשמו ודיגיטלי ברגע, ניתן להמיר וידאו לתיעוד STmaps בי קוטר luminal מומר לגוונים אפורים או [מפות קוטר נקרא (Dmaps)] צבע. STmaps יכול לספק נתונים על כיוון תנועתיות (כלומר, נייחת, peristaltic, עווית), מהירות, משך, תדירות ועוצמה של דפוסי תנועתיות התכווצות. יתרונות של גישה זו כוללים: analysiים של אינטראקציה או פיתוח בו זמנית של תבניות תנועתיות שונות באזורים השונות של אותו הקטע, ויזואליזציה של דפוס תנועתיות משתנה על פני זמן, וניתוח של כמה פעילות בפעילות השפעות אזור אחד באזור אחר. ניתן שחזרו הקלטות וידאו עם לוחות זמנים שונים ופרמטרי ניתוח, כך שיכולים להיות מנותחים STmaps הנפרד ודפוסי תנועתיות בפירוט רב יותר. פרוטוקול זה במיוחד מפרט את ההשפעות של גירויי התנפחות וintraluminal נוזל intraluminal המשפיעים על דור תנועתיות. השימוש באגוניסטים קולט luminal ויריבים מספק מידע על איך מכניסטית ספציפי דפוסי יזם ואיך דפוס אחד יכול להיות מומר לתבנית אחרת. הטכניקה היא מוגבלת על ידי היכולת למדוד תנועתיות שגורמת לשינויים בקוטר luminal, מבלי לספק נתונים על שינויים בלחץ intraluminal או מתח שרירים, ועל ידי הדור של חפצים המבוססים על הגדרת ניסוי בלבד; למרות, analysiשיטות של יכולות להסביר לבעיות אלה. בהשוואה לטכניקות קודמות הקלטת וידאו וגישת STmap מספקת הבנה מקיפה יותר של תנועתיות מערכת העיכול.

Spatiotemporal מפות הבנה (STmaps) כקוטר מפות (Dmaps) בעוד המפות שנוצרו על ידי טכניקה זו הן spatiotemporal, שינוי בקוטר luminal של הרקמה הוא הפרמטר ספציפי דמיין בשני מרחק וזמן. STmap מתאר מרחק אופקי לאורך קטע הרקמה על ציר x (במ&quot;מ) וזמן על ציר y (בשניות) עם הזמן מתחיל בזמן העליון וכלה בתחתית. בפינה הימנית העליונה הוא אגדה, אשר מציגה בקטרים ​​luminal מינימום ומקסימום, כמו גם שינוי קנה המידה לשני x ו- y-צירים (איורים 1-4). לפיכך, גווני פיקסל שונים בתמונה בגווני אפור מתאים לקטרי luminal שונים. פיקסלים כהים מתאים לקטרים ​​רחבים יותר ופיקסלים בהירים מתאים לקטרים ​​קטנים יותר. לפיכך, גלי התכווצות של השריר המעגלי יופיעו כאזורים של pixelation הקל כתוצאה מהירידה בקוטר luminal ( <stronז&gt; איור 1 חיצים שחורים). לעומת זאת, התנפחות luminal בשל הרפיית שרירים עגולה או בולוס גדול של נוזל תגרום לעלייה בקוטר luminal ופיקסלים כהים ב( החיצים הלבנים תרשים 1C) STmap / Dmap. ניתן למצוא דיון נוסף של ההיווצרות והמשמעות של STmaps בנייר על ידי קבוצת לאמרס 11. התכווצויות הפצת מושרה התנפחות Luminal באיור 1, מעי גס הפרוקסימלי פן ניסיונות היה נפוח עם 0.5, 1.0, 1.5, 2.0 ומ&quot;ל של חיץ קרבס במשך 5 דקות בכל כרך. התכווצויות הפצת היו שהושרו על ידי כל הכרכים ≥1.0 מ&quot;ל ויופיעו להקות הלבנות רזה כמו בSTmap (איור 1). התנפחות של חלל המעי גורמת לייזום התכווצויות הפצת. כפי שניתן לראות באיור 1, בקוטר של עליות לומן עם כמויות גדולות יותר וintraluminal פיקסלים בSTmapמתאים לקוטר שהפכו כהה יותר יצירת רקע כהה כולל. ברמה מסוימת של התנפחות רפלקס peristaltic מופעל (1.0 מיליליטר; איור 1), אשר יוזם גלים הנעה מהתכווצות בסוף האוראלי שלהקטין את הקוטר של לומן ולהעביר לקראת הסוף האנאלי של המגזר (מוצג כלהקות הלבנות באיורים 1 ו -4). התכווצות להקה מייצגת הלבנה קדמה לעתים קרובות על ידי להקה כהה, המייצגת את הרגיעה aboral לקראת גל peristaltic (חיצים לבנים תרשים 1C). פיקסלים לבנים וכהים אלה מתאימות להתכווצות עולה ויורדים רכיבי הרפיה של רפלקס peristaltic, בהתאמה 22,23. בSTmap בפנל איור 1, ישנם 0 גלים הנעה ב0.0 מיליליטר, 0 גלים הנעה ברמה של 0.5 מיליליטר התנפחות, 3 גלים הנעה ב1.0 מיליליטר התנפחות, 6 גלים הנעה ב1.5 מיליליטר התנפחות, וגלים הנעה 5לא 2.0 מיליליטר התנפחות. התכווצויות נייחות המושרה תזונתיים / ערבוב גלים של הפצת התכווצות אינם דפוס תנועתיות היחיד שניתן דמיין ידי STmaps. דפוסי ערבוב של תנועתיות כגון פילוח גם ניתן לראות בSTmaps והתמונה (איור 2 א) המתאים. דפוס זה הוא שונה מהפצת התכווצויות. במהלך ערבוב דפוסים רבים התכווצויות קטנות, נייחות להתרחש באזורים שונים באותו הזמן (דמיין כריבועים קטנים מרובים לבנים באותו הקו אופקי, אבל לא נוגע זה בזה). בעוד כל התכווצות מגזרית היא נייחת ולא זזה בפה לאופן אנאלי כפי שתואר להתכווצויות הפצת, היכולת של STmaps כדי להמחיש דפוסי התכווצות מורכבים על פני תקופות זמן ארוכות מאפשרת הדמיה של ההתקדמות האיטית של התכווצויות אנאליות לאורך זמן (איור 2 א חץ שחור). משךכל התכווצות בודדת יכולה להיות גם נקבעה על ידי ציור קו אנכי דרך כיכר ההתכווצות הלבנה באמצעות ImageJ והתוסף הקשורים (איור 2 א). בSTmap המסוים הזה שנוצר מזלוף תוך מעי הגס של חומצות שומן קצרות שרשרת, משך ההתכווצות הנייח הממוצע היא ~ 2 שניות (טווח: 1.9-2.1 שניות). בעוד לפדר שנותר בקטע רקמה יכולה לגרום לחפצים בניתוח, חפצי הקו האנכיים שנוצרו על ידי לפדר (1B דמויות, 2B) יכולים לשמש כדי לקבוע תנועות שרירים אורך. ב1B דמויות ו2B התנועה האופקי של הקו האנכי השחור בשל התכווצות והרפיה של שרירים אורך. תנועה לרוחב זה של שריר אורך ניתן דמיין על STmaps כתנועות אופקיים של הלהקות אנכיות שנוצרו על ידי חפצים לפדר (1B דמויות, 2B). ImageJ ותקע אחריn ניתוח של STmaps שתי המהירות של גל propagating (איור 3), כמו גם משך ההתכווצות (איור 2) ניתן לקבוע באמצעות ImageJ ותוסף GIMMProcessor. באיור 3, מהירות ההתפשטות של גלי שניהם orthograde והמדרדר הייתה ~ 0.25 מ&quot;מ / שנייה (טווח: 0.21-0.35 מ&quot;מ / sec). כפי שניתן לראות בסרטון התמונה למעלה מפת ST, קווי הניתוח (קווים אדומים ויוצרים תיבה בתמונת וידאו) נקבעו דווקא סביב קצה אחד של קטע הרקמה במקום מסביב לכל המגזר. זהו שימוש חשוב של ההנחיות בתוכנה. הגדרה מדויקת של הנחיות אלה היא חיונית לניתוח נכון של הווידאו ניתח כנוסף בסעיף הדיון. זה מאפשר את הדור של STmap מדמיין התכווצויות אדווה myogenic 24. התכווצויות אלה הן myogenic במקור ולא לשנות את קוטר luminal מאוד. כמו כן, דיר שונהections של התפשטות (orthograde או מדרדר), שהם משותפים לאדוות, ניתן לנתח באמצעות טכניקה זו (איור 3). כפי שניתן לראות באיור 2 משך ההתכווצות יכול להשתנות באזורים שונים של מגזר הרקמה. ניתוח נכון של STmaps בעיה פוטנציאלית אחת עם הקמתה של STmaps היא דור חפץ אפשרי בשל המתודולוגיה הניסויית. לדוגמא, לפדר השאיר בצד החיצוני של הרקמה יגדיל את קוטר קריאה לקטע זה של רקמת יצירת קו שחור אנכי על STmap (איורים 1, 2 ב). הנוכחות של לפדר גם באופן מלאכותי מרחיבה את המפה בגווני אפור על ידי הגדלת מדידת luminal הרחבה ביותר, שתוצאתה הקהיה של מדידות הניגוד של הסולם. מסיבה זו היא הטובה ביותר להסיר לפדר שלם ככל האפשר מהמגזר ללא ניקוב הרקמות.<html> חפץ STmap אפשרי אחר הוא קו אנכי לבן בשל בועות בתוך הנוזל luminal שלא ניתן בניגוד לשחור (איור 4). בועות אלה עשויות להפוך את קוטר luminal מופיע קטן יותר לתוכנת ניתוח או כיסוי לבנים אזורים / אור על דפוסי תנועתיות בSTmap. לכן, הגדרה של מגזר הרקמה ומנוגד תקינים של הקלטת וידאו לפני הניתוח היא קריטית לחלוטין להצלחה בבניית STmaps (איור 4). הגדרות מנוגדות ראויות ובלתי ראויות מוצגות באיור 4. חשוב לציין כי התאמת וידאו בשני כיול המצלמה מראש הניסוי וחלון ניתוח שלאחר הניסוי הם קריטיים לדור STmap הנכון וניתוח. כיול תמונה לא נכון יכול להוביל לSTmaps עם נתונים לא שמיש (איור 4 א). 700 &quot;/&gt; איור 1. גלים מתפשט במעי הגס הפרוקסימלי. עקומת התנפחות-תגובה (שבוצעה במעי גס הפרוקסימלי פן ניסיונות) (א) היה בשימוש כדי לקבוע את נפח נוזל intraluminal המתאים ליזום הפצת גלים במגזר זה (להקות אופקי הלבנות). חיצים שחורים להמחיש דוגמאות של גלי propagating באורך מלא. חצים לבנים להמחיש את החפץ שנגרם על ידי קו ההסרה לפדר שלמה. (ב) מבט קרוב יותר על הפצת התכווצויות מושגת על ידי דור STmap מניסוי דומה ללוח, אבל וידאו של משך קצר יותר. קל יותר לשים לב כי ההתכווצויות להתקדם בפה לכיוון אנאלי ולזהות ההרפיה aboral קדמה המיוצגת אזור חשוך לפני הלהקה הלבנה בהשוואה לא פנל מפה זה גם מספק מבט אחר של חפצים לפדר. התיבה האדומה מזהה את האזור של STmap זה הרחיב בלוח ג (ג) בלוח זה ממחיש o תצוגה עוד יותרו באותו וידאו ולמפות כמו בחצי B. הלבנים פנל שכותרתו נקודה &quot;התנפחות נוזלים&quot; לפיקסלים כהים המגיעים לי Luminal התנפחות ידי aboral נוזל לגל propagating. אלה הם אזורים שבם הרפיית שרירים מעגלית מתרחשת aboral להתכווצות שרירים מעגלי. שים לב שצירי הפצת נראים כמו קווים אופקיים לחלוטין בפנל בשל לוח הזמנים של המפה הארוכה. בלוחות B ו- C בפעם קשקשים הם בהדרגה קצרים יותר, כך שיש לו את גל התכווצות מדרון שניתן למדוד ודווח כמהירות של תנועת הגל. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53263/53263fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" width="700" /> איור 2. קביעת משך התכווצות בSTmap. () SH מעי גס גינאה החזיר הפרוקסימליOWS דפוס תנועתיות ערבוב / מגזרי בתגובה לזלוף intraluminal של חומצת שומן קצרה שרשרת (וטיראט). צוירו קווים אדומים אנכיים דרך תקופות של התכווצות לקבוע משך התכווצות באמצעות התמונה J ותוסף GIMMProcessor. החץ השחור מראה את כיוון aboral של התפשטות של ההתכווצויות נייחות. (ב) התכווצויות Propagating במעי עכבר לעתים קרובות להראות אזורים של התכווצות מתמשכת. חיצים אנכיים נמשכים בתכנית המפה זו שאזורים אוראליים יותר נשארו מכווצות למשך יותר זמן. בהכנה זו, הסוף האנאלי של ההכנה נסגר כדי למנוע נוזל לצאת מהמערכת הסגורה במהלך צירים רקמה. התמונה בחלק העליון של הלוח מציגה זמן שבו כל סוף הפה של הרקמה הוא נדבק (לבן על STmap), ואילו הקצה האנאלי כולו התנפח על ידי נוזל (שחור על STmap). התנועה אופקית / לרוחב של שחור האנכי באמצע הלוח ב &#39;STmap תערוכות תנועה שלשכבת שריר אורך. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53263/53263fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" width="400" /> גלי איור 3. דפוסים דו כיוונית תנועתיות. Propagating יכולים לנוע בשני orthograde (האוראלי לאנאלי) והמדרדר (אנאלי לאוראליים) כיוונים. חיצים שחורים מוצקים להראות התפשטות orthograde נורמלית וחצים שחורים מקווקוים להראות התפשטות מדרדר. המהירות של התפשטות של שני orthograde והתכווצויות מדרדר בSTmap זה נקבעה על ידי ניתוח ImageJ והיו ~ 0.25 מ&quot;מ / sec. קווי ניתוח תמונה (קווים אדומים ויוצרים תיבה בוידאו התמונה למעלה STmap) נקבעו קרוב לקצה אחד של הרקמה לדמיין התכווצויות myogenic אדווה שמשרעת נמוכה, התכווצויות רדודות לעתים קרובות מכוונות בorthograde, retrograde, או שני הכיוונים. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53263/53263fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" width="700" /> איור 4. חשיבותה של ניגודיות תמונה נכונה לSTmap דור. (א) מראה תמונה בניגוד כהלכה וSTmap, בעוד לוח ב &#39;מראה תמונה בניגוד כראוי וSTmap. ב (א) הלהקות הלבנות אופקיים נוצרו מהתמונה בניגוד כראוי (B) הם לא מובן מאליו וכיש חפצים רבים (הצללה לבנה) בשל התמונה הראשונית להיות בגוונים אפורים. בSTmap שנוצר מהתמונה (ב &#39;) בניגוד כראוי חפצי ההצללה הלבנים של גווני האפור נעלמים וגלי propagating יותר מודגשים. כמו כן, ההצללה השחורה מייצגת אה הרפיהEAD של גל התכווצות הפצת שניתן לראות בסוף האנאלי של STmap עם כל גל של התכווצות. בלוח ב &#39;החצים הלבנים להמחיש חפץ STmap שנוצר על ידי אזור של התמונה שלא ניתן היה בניגוד כראוי. סוג זה של חפץ הוא בעיקר בשל בועות intraluminal שלעתים מתרחשים בהכנה במהלך פרוטוקול הניסוי. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53263/53263fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines at JoVE.com

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

מיפוי Spatiotemporal של תנועתיות ב<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תכשירים מהמעיים

Multiple approaches have been used to record and evaluate gastrointestinal motility including: recording changes in muscle tension, intraluminal pressure, ...

spatiotemporal-mapping-motility-ex-vivo-preparations

Research

JoVE Journal

Biology

Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

10.3K Views.  Virginia Commonwealth University. Recently available video recording and spatiotemporal mapping (STmap) techniques make it possible to visualize and quantify both propagating and mixing patterns of intestinal motility. The goal of this protocol is to explain the generation and analysis of STmaps using the GastroIntestinal Motility Monitoring (GIMM) system.

Video: Spatiotemporal Mapping of Motility in Ex Vivo Preparations of the Intestines

Ex vivo Mechanical Loading of Tendon

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace. Most are associated with repetitive, high force hand activities. The mechanisms of cellular and structural damage due to cyclical loading are not well known. The purpose of this video is to present a new system that can simultaneously load four tendons in tissue culture. The video describes the methods of sterile tissue harvest and how the tendons are loaded onto a clamping system that is subsequently immersed into media and maintained at 37&deg;C. One clamp is fixed while the other one is moved with a linear actuator. Tendon tensile force is monitored with a load cell in series with the mobile clamp. The actuators are controlled with a LabView program. The four tendons can be repetitively loaded with different patterns of loading, repetition rate, rate of loading, and duration. Loading can continue for a few minutes to 48 hours. At the end of loading, the tendons are removed and the mid-substance extracted for biochemical analyses. This system allows for the investigation of the effects of loading patterns on gene expression and structural changes in tendon. Ultimately, mechanisms of injury due to overuse can be studies with the findings applied to treatment and prevention.

A new in vitro system for simultaneously loading four tendons in culture is described.

Ex vivo טוען מכני של גיד

Injuries to the tendon (e.g., wrist tendonitis, epicondyltis) due to overuse are common in sports activities and the workplace.  Most are associated with ...

Targeted Expression of GFP in the Hair Follicle Using Ex Vivo Viral Transduction

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft during early anagen, the growth phase of the hair cycle, as well as pluripotent stem cells that play a role in hair follicle growth but have the potential to differentiate to non-follicle cells such as neurons. These properties of the hair follicle are discussed. The various cell types of the hair follicle are potential targets for gene therapy. Gene delivery system for the hair follicle using viral vectors or liposomes for gene targeting to the various cell types in the hair follicle and the results obtained are also discussed.

The hair follicle is a highly complex appendage of the skin containing a multiplicity of cell types. The follicle undergoes constant cycling through the life of the organism including growth and resorption with growth dependent on specific stem cells. The targeting of the follicle by genes and stem cells to change its properties, in particular, the nature of the hair shaft is, discussed. Hair follicle delivery systems are described, such as liposomes and viral vectors for gene therapy. The nature of the hair follicle stem cells is discussed, in particular, its pluripotency.

ביטוי ממוקד של ה-GFP ב זקיק השיער באמצעות אקס התמרה Vivo ויראלי

There are many cell types in the hair follicle, including hair matrix cells which form the hair shaft and stem cells which can initiate the hair shaft ...

Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility in isolated segments of guinea pig distal colon. The complete system consists of a computer, video camera, illuminated organ bath, peristaltic and heated water bath circulating pumps, and custom GIMM software to record and analyze data. Compared with traditional methods of monitoring colonic peristalsis, the GIMM system allows for continuous, quantitative evaluation of motility. The guinea pig distal colon is bathed in warmed, oxygenated Krebs solution, and fecal pellets inserted in the oral end are propelled along the segment of colon at a rate of about 2 mm/sec. Movies of the fecal pellet proceeding along the segment are captured, and the GIMM software can be used track the progress of the fecal pellet. Rates of propulsive motility can be obtained for the entire segment or for any particular region of interest. In addition to analysis of bolus-induced motility patterns, spatiotemporal maps can be constructed from captured video segments to assess spontaneous motor activity patterns. Applications of this system include pharmacological evaluation of the effects of receptor agonists and antagonists on propulsive motility, as well as assessment of changes that result from pathophysiological conditions, such as inflammation or stress. The guinea pig distal colon propulsive motility assay, using the GIMM system, is straightforward and simple to learn, and it provides a reliable and reproducible method of assessing propulsive motility.

Gastrointestinal Motility Monitor GIMM

Evaluation of colonic motility in the guinea pig distal colon with the Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM) is a straightforward and simple to learn approach to quantitatively evaluate propulsive motility in the gastrointestinal tract.

צג תנועתיות מערכת העיכול (GIMM)

The Gastrointestinal Motility Monitor (GIMM; Catamount Research and Development; St. Albans, VT) is an in vitro system that monitors propulsive motility ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells (HSCs) differentiate into oligopotent progenitors, committed precursors and mature red blood cells 1. This process is regulated for a large part at the level of gene expression, whereby specific transcription factors activate lineage-specific genes while concomitantly repressing genes that are specific to other cell types 2. Studies on transcription factors regulating erythropoiesis are often performed using human and murine cell lines that represent, to some extent, erythroid cells at given stages of differentiation 3-5. However transformed cell lines can only partially mimic erythroid cells and most importantly they do not allow one to comprehensibly study the dynamic changes that occur as cells progress through many stages towards their final erythroid fate. Therefore, a current challenge remains the development of a protocol to obtain relatively homogenous populations of primary HSCs and erythroid cells at various stages of differentiation in quantities that are sufficient to perform genomics and proteomics experiments.
Here we describe an ex vivo cell culture protocol to induce erythroid differentiation from human hematopoietic stem/progenitor cells that have been isolated from either cord blood, bone marrow, or adult peripheral blood mobilized with G-CSF (leukapheresis). This culture system, initially developed by the Douay laboratory 6, uses cytokines and co-culture on mesenchymal cells to mimic the bone marrow microenvironment. Using this ex vivo differentiation protocol, we observe a strong amplification of erythroid progenitors, an induction of differentiation exclusively towards the erythroid lineage and a complete maturation to the stage of enucleated red blood cells. Thus, this system provides an opportunity to study the molecular mechanism of transcriptional regulation as hematopoietic stem cells progress along the erythroid lineage. 
Studying erythropoiesis at the transcriptional level also requires the ability to over-express or knockdown specific factors in primary erythroid cells. For this purpose, we use a lentivirus-mediated gene delivery system that allows for the efficient infection of both dividing and non-dividing cells 7. Here we show that we are able to efficiently knockdown the transcription factor TAL1 in primary human erythroid cells. In addition, GFP expression demonstrates an efficiency of lentiviral infection close to 90%. Thus, our protocol provides a highly useful system for characterization of the regulatory network of transcription factors that control erythropoiesis.

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

An ex vivo protocol to generate mature human red blood cells from hematopoietic stem/progenitors is described. Additionally we describe an efficient lentiviral-delivery method to knockdown the transcription factor TAL1 in primary erythroid cells. The efficiency of lentivirus mediated gene delivery is demonstrated using GFP expressing viruses.

Lentiviral בתיווך מציאה במהלך Ex Vivo Erythropoiesis של אדם בתאי גזע hematopoietic

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

לשעבר vivo הכנה מבודדת Microvessel השלד לחקירות תגובתיות כלי דם

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary clearance function has been established. Freshly harvested mouse trachea is cut longitudinally through the trachealis muscle and mounted in a shallow walled chamber on a glass-bottomed dish. The trachea sample is positioned along its long axis to take advantage of the trachealis muscle to curl longitudinally. This allows imaging of ciliary motion in the profile view along the entire tracheal length. Videos at 200 frames/sec are obtained using differential interference contrast microscopy and a high speed digital camera to allow quantitative analysis of cilia beat frequency and ciliary waveform. With the addition of fluorescent beads during imaging, cilia generated fluid flow also can be determined. The protocol time spans approximately 30 min, with 5 min for chamber preparation, 5-10 min for sample mounting, and 10-15 min for videomicroscopy.

Ex vivo Method for High Resolution Imaging of Cilia Motility in Rodent Airway Epithelia

An easy and reliable technique for visualizing and quantifying airway cilia motility and cilia generated flow using mouse trachea is described. This technique can be modified to determine how a wide range of factors influence cilia motility, including pharmacological agents, genetic factors, environmental exposures, and/or mechanical factors such as mucus load.

שיטת vivo לשעבר להדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צילה במכרסמי Airway epithelia

An ex vivo technique for imaging mouse airway epithelia for quantitative  analysis of motile cilia function important for insight into mucociliary  ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

מיפוי הגנום של תרופות-DNA בתאי אינטראקציות עם COSMIC (Crosslinking של מולקולות קטנות לבודד הכרומטין)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, is expressed in neurons in response to various stimuli. The protein product can be readily detected with immunohistochemical techniques leading to the use of c-FOS detection to map groups of neurons that display changes in their activity. In this article, we focused on the identification of brainstem neuronal populations involved in the ventilatory adaptation to hypoxia or hypercapnia. Two approaches were described to identify involved neuronal populations in vivo in animals and ex vivo in deafferented brainstem preparations. In vivo, animals were exposed to hypercapnic or hypoxic gas mixtures. Ex vivo, deafferented preparations were superfused with hypoxic or hypercapnic artificial cerebrospinal fluid. In both cases, either control in vivo animals or ex vivo preparations were maintained under normoxic and normocapnic conditions. The comparison of these two approaches allows the determination of the origin of the neuronal activation i.e., peripheral and/or central. In vivo and ex vivo, brainstems were collected, fixed, and sliced into sections. Once sections were prepared, immunohistochemical detection of the c-FOS protein was made in order to identify the brainstem groups of cells activated by hypoxic or hypercapnic stimulations. Labeled cells were counted in brainstem respiratory structures. In comparison to the control condition, hypoxia or hypercapnia increased the number of c-FOS labeled cells in several specific brainstem sites that are thus constitutive of the neuronal pathways involved in the adaptation of the central respiratory drive.

The c-FOS Protein Immunohistological Detection: A Useful Tool As a Marker of Central Pathways Involved in Specific Physiological Responses In Vivo and Ex Vivo

Here, we present a protocol based on c-FOS protein immunohistological detection, a classical technique used for the identification of neuronal populations involved in specific physiological responses in vivo and ex vivo.

חלבון C-FOS איתור immunohistological: כלי שימושי כסמן של מסלולים מרכזיים המעורבים בתגובות פיסיולוגיות ספציפיות<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; Ex Vivo</em

Many studies seek to identify and map the brain regions involved in specific physiological regulations. The proto-oncogene c-fos, an immediate early gene, ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Ex Vivo Method for Assessing the Mouse Reproductive Tract Spontaneous Motility and a MATLAB-based Uterus Motion Tracking Algorithm for Data Analysis

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. Here, we present an easy and inexpensive method that would be instrumental for testing new drugs decreasing uterine contractility. This method utilizes the unique ability of the entire mouse reproductive tract to exhibit spontaneous motility when maintained ex vivo in a Petri dish containing oxygenated Krebs buffer. This spontaneous motility resembles the wave-like myometrial activity of the human uterus, referred to as endometrial waves. To demonstrate the effectiveness of the method, we employed a well-known uterine relaxant drug, epinephrine. We demonstrate that the spontaneous motility of the entire mouse reproductive tract can be quickly and reversibly inhibited by 1 &#181;M epinephrine in this Petri dish model. Documenting the changes of uterine motility can be easily done using an ordinary smart phone or a sophisticated digital camera. We developed a MATLAB-based algorithm allowing motion tracking to quantify spontaneous uterine motility changes by measuring the rate of uterine horn movements. A major advantage of this ex vivo approach is that the reproductive tract remains intact throughout the entire experiment, preserving all intrinsic intrauterine cellular interactions. The major limitation of this approach is that up to 10-20% of uteri may exhibit no spontaneous motility. Thus far, this is the first quantitative ex vivo method for assessing spontaneous uterine motility in a Petri dish model.

Uterine contractions are important for the well-being of females. However, pathologically increased contractility may result in dysmenorrhea, especially in younger females. Here, we describe a simple ex vivo preparation allowing quick assessment of the efficacy of smooth muscle relaxants that may be used for treating dysmenorrhea.

שיטה Vivo Ex להערכת בדרכי הרבייה של העכבר לתנועתיות ספונטנית מעקב הרחם MATLAB מבוסס על התנועה אלגוריתם לניתוח נתונים

Dysmenorrhea, or painful cramping, is the most common symptom associated with menses in females and its severity can hinder women&#39;s everyday lives. ...