Name: direct protein delivery to mammalian cells using cell-permeable cys2-his2 zinc-finger domains
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיות לבריאות (DP1CA174426 לקרלוס פ Barbas) ואוניברסיטת ShanghaiTech, שנחאי, סין (לJL). גרפיקה מולקולרית היו שנוצרה באמצעות PyMOL.

1. שיבוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג תחומים זיף שתי אצבעות-הוחלף אלאנין שכבר תת-שובטו לתוך מערכת וקטור ביטוי PET-28 והנם זמינים לפי בקשה (PET-2F-זיף). 34 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR להגביר EmGFP מפלסמיד Emerald-pBAD עם פריימרים 5 &#39;XmaI-EmGFP (5&#39;-GGAAATTG CCCGGG ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCAC-3&#39;; Xma אני אתר מודגש) ו 3 &#39;SACI-EmGFP (5&#39;-CGGATCT GAGCTC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAG-3 &quot; ; Sac אני אתר מודגש). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 5 ng של DNA תבנית, 10 μl של חיץ 10x פולימראז, 1 יח &#39;(U) של פולימראז תקי DNA, 0.2 מ&quot;מ כל אחד dNTP ו -0.2 מיקרומטר של כל צבע יסוד בפתרון 100 μl עם הנפח שנותר מורכבים ממים מזוקקים / deionized . השתמש בתנאי הרכיבה על אופניים: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 30 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו -72 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות; C ° 72 במשך 10 דקות. לטהר את מוצר ה- PCR על ידי extracti ג&#39;לובלקבוע את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר מדידת Abs 260 x 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Digest PET-2F-זיף ולהוסיף קידוד EmGFP עם הגבלת אנזימי Xma אני וSac אני במאגר מומלץ ל3 שעות על 37 מעלות צלזיוס באמצעות 10 U של אנזים לכל 1 מיקרוגרם של ה- DNA. דמיין DNA על ידי אלקטרופורזה agarose ג&#39;ל באמצעות צבע intercalating פלורסנט, כגון ברומיד ethidium. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את ה- DNA מתעכל על ידי ערכת חילוץ ג&#39;ל ולקבוע את ריכוז ה- DNA על ידי ספקטרופוטומטר מדידת Abs 260 x 50 מיקרוגרם / מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ולקשור DNA EmGFP הקידוד המטוהרים ל50-100 ng של PET-2F-זיף באמצעות 1 U של אנזים T4 DNA לשעות לפחות 1 ב RT. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע את תגובת קשירה באמצעות 6: יחס טוחנת להכניס לוקטור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפשירי 50 μl של כל XL-1 תאי coli Escherichia הכחול כימי מוסמכים על קרח ומערבבים בעדינות עם 10-20 ng של ligated PET-2F-הזיף-EmGFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על קרח 30 דקות. הלם חום את התערובת על 42 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות ולשחזר את התאים ב 2 מיליליטר של מרק הסופר אופטימלי עם דיכוי Catabolite (SOC) עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התפשטות תרבות התאוששות 100 μl על מרק lysogeny (LB) צלחת אגר עם 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin ודגירת O / N ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לחסן 6 מיליליטר של סופר מרק (SB) או תרבות LB המכילה 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin עם מושבה אחת מצלחת LB אגר ותרבות O / N על 37 מעלות צלזיוס. הערה: המושבה PCR באמצעות פריימרים 5 &#39;XmaI-EmGFP ו 3&#39; SACI-EmGFP יכול לשמש כדי לזהות שיבוטים חיוביים לפני miniprep. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר PET-2F-הזיף-EmGFP ידי miniprep ולאשר פלסמיד על ידי רצפי DNA באמצעות אמרגן T7 (5&#39;-TAATACGACTCACTATAGGG-3 &quot;). </li></ol> 2. ביטוי וטיהור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר 50 μl של כימי המוסמך BL21 E. coli תאים על קרח ומערבבים בעדינות עם של PET-2F-הזיף-EmGFP pl 100 ngasmid. להפוך כמתואר בשלבים 1.7-1.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לחסן 10 מיליליטר של מדיום LB המכיל 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin עם מושבה אחת ולגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לדלל את 10 מיליליטר של O / תרבות N לתוך 1 ליטר של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מיליליטר kanamycin, גלוקוז 0.2% ו -100 מיקרומטר ZnCl 2. לגדול התרבות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600) של 0.8 ולגרום לביטוי חלבון עם 2 מ&quot;מ איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). לאחר 6 שעות של צמיחה על 37 מעלות צלזיוס, תאי קציר על ידי צנטריפוגה בXG 5000 במשך 10 דקות ב 4 ° C. הערה: תנאי אינדוקציה הם משתנים מאוד ותלויים ביציבות של החלבונים לידי ביטוי. לפקח על OD 600 כל 30 דקות עד OD 600 של 0.8 הוא הגיע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של חיץ תמוגה (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ &#39;dithiothreitol M (DTT), 1 מ&quot;מ MgCl 2, פלואוריד 1 מ&quot;מ phenylmethylsulfonyl (PMSF) ו -10 מ&quot;מ imidazole, pH 8.0). Lyse התאים על קרח על ידי sonication עם ההגדרה הבאה: 50% תפוקת כוח, זמן תהליך 4 דקות עם 5 שניות על / 10 שניות את מרווחים. הימנע מחימום יתר הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה lysate התא ב25,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לתוך צינור איסוף טרי. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, לבצע את כל השלבים ב 4 מעלות צלזיוס הבאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את supernatant דרך עמודה מראש ארוז עם 1 מיליליטר של תרחיף Ni-נ.ת.ע equilibrated. לשטוף את השרף עם 20 מיליליטר של חיץ לשטוף (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ&quot;מ DTT, 1 מ&quot;מ MgCl imidazole 2 ו -30 מ&quot;מ, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute החלבון עם 5 מיליליטר של חיץ elution (50 מ&quot;מ טריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ&quot;מ DTT, 1 מ&quot;מ MgCl 2, ו -300 מ&quot;מ imidazole, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאגר להחליף חלבון eluted עם חיץ אחסון (50 מ&quot;מטריס-HCl, 500 mM NaCl, 100 מיקרומטר ZnCl 2, 1 מ&quot;מ DTT, 1 גליצרול מ&quot;מ MgCl 2 ו -10%, pH 8.0) ולרכז את החלבון לפחות 40 מיקרומטר באמצעות concentrator ספין על ידי צנטריפוגה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז חלבון על ידי BCA או assay ברדפורד. לערבב 2 μl של חלבונים מטוהרים עם 2 μl 2 × צבע טעינת SDS-PAGE, רתיחה על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן לפתור על 4% -20% טריס-גליצין SDS-PAGE להעריך טוהר חלבון (איור 2). </li></ol> 3. חלבון אחסון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot החלבון המרוכז, פלאש הקפאה בחנקן נוזל חנות ב -80 ° C. לחלבוני היתוך EmGFP, לכסות את הצינור עם נייר אלומיניום על מנת להגן על החלבון מן האור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע מהקפאה והפשרה של פתרון החלבון חוזרים ונשנים. הערה: חלבונים התמזגו-זיף הם יציבים בתנאים אלה במשך לפחות 1 חודש. או אחסון לא ראוי חודש&gt; 4 עשוי להוביללמשקעי חלבון או photobleaching של EmGFP. </li></ol> התמרה 4. חלבון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תאי הלה במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) המכיל 10% (v / v) בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% לאנטיביוטיקה antimycotic על 37 מעלות צלזיוס באווירת humidified באופן מלא עם 5% CO 2. הערה: תאי passaged יותר מ -30 פעמים אינן מומלצים לתמרת חלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום מעיל צלחת 24 גם עם 500 μl 50 / מיליליטר מיקרוגרם של פולי ליזין למשך 30 עד 60 דקות במהירות של 25 ° C. תאי זרע על צלחת 24 גם בצפיפות של 2 × 10 5 תאים לכל טוב. בגיל 24 שעות לאחר זריעה, או פעם תאים הם בין 80% -90% ומחוברות, להסיר תקשורת מכל טוב ולשטוף עם 500 μl של סרום ללא DMEM המחומם מראש (SFM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה טוב, להוסיף 250 μl של SFM המכיל 2 מיקרומטר חלבון הזיף-EmGFP של 100 מיקרומטר ZnCl 2. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: תחומים זיף להיכנס לתאי יחסי ציבורimarily דרך macropinocytosis, 34 שהוא מנגנון אנרגיה תלויה. לכן, תאים חייבים להיות טופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך הפנמת חלבון יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה מהתאים ולשטוף שלוש פעמים עם 500 μl של סידן ומגנזיום ללא פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco (DPBS) בתוספת 0.5 מ&quot;ג / מיליליטר של הפרין. הערה: הפרין יש צורך להסיר חלבון מאוגד משטח שעשוי לסבך את הניתוח במורד הזרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפולים (אופציונליים) חזור על עד שלוש פעמים למסירה משופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד תאים שטופלו מייד לאחר הפרין לשטוף על ידי עיכול עם 0.05% טריפסין-EDTA על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. להשעות מחדש תאים מנותקים ב 0.5 מיליליטר של DPBS בתוספת 1% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את עוצמת הקרינה של כל דגימה על ידי זרימת cytometry 35 באמצעות ערוץ isothiocyanate והעמסת (FITC) (איור 3). התאם את הפיזור קדימה (FSC) וצד פיזור (SSC) למקום האוכלוסייהריבית על קנה מידה, על מנת להבטיח שאוכלוסיות עם מאפיינים שונים נפתרות אחד מהשני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10,000 אירועים חיים עבור כל דגימה ולנתח את הנתונים באמצעות זרימת cytometry ניתוח נתונים תוכנה. 36 הקרינה לנרמל מתאי הלה שטופלו בזיף-EmGFP לאלה תאים שטופלו רק עם SFM. </li></ol>

<ol>
	<li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules.">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li><li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-mediated+cell+delivery:+application+in+protein+target+validation.">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+delivery+systems.">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li><li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery.">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li><li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus.">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li><li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein.">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li><li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes.">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li><li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display.">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li><li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif.">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li><li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library.">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li><li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r, S., Banta, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform.">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li><li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability.">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li><li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein.">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li><li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue.">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li><li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system.">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors.">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li><li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery.">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li><li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering.">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li><li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag.">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li><li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate.">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li><li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors.">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li><li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery.">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases.">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li><li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases.">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li><li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins.">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li><li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+zinc+finger+proteins:+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies.">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+targeted+genome+editing.">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li><li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo.">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li><li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains.">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li><li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li><li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors.">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li><li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F., Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Aart,+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide,+bound+to+DNA.">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li></ol>

יש לי המחברים אין לחשוף.

כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד למסירת החלבון השתמשה בתחומי תא חדיר אבץ-אצבע (ZIF) מוצג. תחום הזיף אינו מפחית את הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו 34; מאפשר לייצור והטיהור של חלבונים בתשואות כמעט זהות לאלו שנצפו עם חלבון ללא שינוי; ויכול להעביר חלבונים ואנזימים למגוון רחב של סוגי תאים עם יעילות העולה על מערכות חודרות תאים מסורתיים פפטיד או חלבון תחום התמרה. יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על הפוטנציאל הרחב של תחומים זיף לתיווך משלוח חלבון ישיר לתאים למגוון רחב של יישומים. משלוח חלבון מרבי הושג בעבר רק באמצעות תחום זיף שתי אצבעות, על אף העובדה שהרחיבה את המערכים של שלושה ותחומים זיף ארבע-אצבע לשאת מטען חיובי גדול יותר. ממצאים אלה מצביעים על כך שערך בתא בתיווך זיף עשוי להיות מושפע מגורמים אחרים מאשר תשלום, including יציבות חלבון או נוקשות קונפורמציה. משלוח חלבון בתיווך תחום הזיף נמצא גם להיות אנרגיה תלויה ובכך דורש שכל התאים שטופלו בחלבון להיות טופחו על 37 מעלות צלזיוס. באמצעות השימוש במעכבי מולקולה קטנים של מסלולי endocytic שונים, macropinocytosis, ולאנדוציטוזה caveolin תלויה במידה פחותה, היו נחושים בדעתו להיות המסלולים העיקריים לכניסת תא בתיווך זיף. 34 יש לציין, בניגוד למערכות התמרה חלבון אחרות, תחומים זיף הם מסוגל ביעילות בריחת endosomes לתווך רמות גבוהות של משלוח cytosolic של מטען macromolecular התמזגה, מדגיש את הפוטנציאל של תחומים אלה להשגת אספקת חלבון חזקה. מניסיוננו, צפיפות הזריעה של תאים היא שלב קריטי להשגת רמות גבוהות של חלבון התמרה. אנו ממליצים טיפול בתאים ברגע שהם יגיעו ל -80% -90% confluency ובעבר ציינו כי תאים שנזרעו ב&gt; 95% משנה תכנית confluencyיכולת התמרה אופטימלית, תוך תאים שנזרעו בצפיפות נמוכה (&lt;50%) רגישים לרעילות עקב חלבון. חשוב לציין, לסוגי תאים עם נטיות ניתוק גבוהות, צלחות תרבית תאים מראש מצופות עם פולי-ליזין מומלץ. פולי-ליזין מאפשר תא קובץ מצורף באמצעות אינטראקציות אלקטרוסטטיות עם רכיבים על פני קרום התא טעון שלילי. למרות שאריות ה- DNA מחייבת α-סליל של כל תחום זיף הוסרו כדי למנוע כל פוטנציאל להכרה DNA, שאריות ציסטאין והיסטידין שיתאמו עם יון 2 + Zn לייצב את קיפול תחום ΒΒα הזיף יישארו ללא שינוי. לפיכך, אנו ממליצים כי כל מאגר אחסון להשלים עם לפחות 100 מיקרומטר של ZnCl 2 כדי לשמור על שלמות חלבון. למרות תחום הזיף הוצג בעבר כדי לספק חלבונים ואנזימים למגוון של סוגי תאים, היעילות של משלוח הזיף עשויה גם להיות תלויה בשני macromoמטען lecular וריכוז חלבון. לדוגמא, תאים שטופלו עם חלבון היתוך זיף-לוציפראז שתי אצבעות נצפו להציג הארה המרבית כאשר טופל עם 0.5 מיקרומטר חלבון, עם פעילות ירדה בריכוזים גבוהים יותר, ואילו תאים שטופלו בשתי אצבעות EmGFP הציג עלייה תלוית מינון הקרינה עוצמה של עד 8.0 חלבון מיקרומטר, ועל טיפולי חלבון ברציפות. לכן אנו ממליצים הערכת יכולת התא החודרת של כל היתוך תחום זיף ייחודי על פני מגוון של ריכוזים. לבסוף, למרות שעדיין לא הוכיח, אנו צופים כי משלוח תחום הזיף הוא פלטפורמה גמישה מאוד, מסוגלת לספק מערך מגוון של מקרו-מולקולות לתוך תאים. לדוגמא, ייתכן שניתן לשני DNA ו- RNA להיות פונקציונליות כימי על פני השטח של תחום הזיף באמצעות מקשר hydrolyzable, או זמני transfected לתאים על ידי אנקפסולציה של תחומים זיף. בנוסף, efficiency מסירת חלבון זיף יכול להיות עוד יותר משופר על ידי מאמצי תכנון רציונלים התמקדו בתשלום משטח אופטימיזציה.

מאוד אסטרטגיות אספקת החלבון יעילה ותכליתיות הן קריטיות למחקר בסיסי ויישומים רבים טיפוליים. המשלוח הישיר של חלבונים מטוהרים לתאים מייצג את אחד מהשיטות הבטוחות ביותר והקלה ביותר להשגת מטרה זו. בניגוד ל1,2 אסטרטגיות המסתמכות על ביטוי גנים מחומצות גרעין, 3-5 משלוח החלבון אינו מהווה סיכון של mutagenesis insertional, אינו תלוי ב שעתוק / מכונות תרגום וסלולרי מאפשר לתוקף באופן מיידי. עם זאת, חוסר שיטות פשוטות ולהכליל למעניקים פעילות חודרת תאים על חלבונים מבלבל באופן שגרתי הכניסה הישירה שלהם לתאים. שיטות קיימים להקלת משלוח חלבון תאית המבוססות על השימוש באופן טבעי 6-8 או תוכנן פפטידים חודרים-תא, 9-12 תחומים התמרה לעייף, ו13,14 חלקיקים 15 ויפוזומים, 16 חלקיקים כמו וירוס-17,18 </sup&gt; וחומרים פולימריים microsphere. 19 למרבה הצער, רבים מן הגישות הללו הם הקשו על ידי שיעורים נמוכים סלולריים ספיגה, 20,21 יציבות עניה, 22 סגוליות שלא במתכוון תא מסוג, 23 נכסי בריחת endosomal הנמוך 24 ורעילות. 25 בנוסף, רב חלבון טכנולוגיות התמרה להפחית את הפעילות הביולוגית של החלבונים נמסרו. 14 המעבדה שלנו הראתה כי nuclease אבץ-אצבע בעבר חלבונים (ZFN) - הגבלת chimeric endonucleases בהיקף של 2 כלי- 2 חלבון לתכנות Cys אבץ-אצבע ה- DNA מחייבת ותחום המחשוף של endonuclease הגבלת FokI 26-28 - מטבעם תאי ד&#39; חדיר. 29 פעילות חודרת תאים מפתיע זה הוצגה להיות רכוש מהותי של תחום אבץ-אצבע אישית מעוצב, פלטפורמת ה- DNA מחייב שהתפתחה ככלי רב עוצמה למטרת הגנום enההנדסה באמריקה, 30-32 ונחשבת לתוצאה של קבוצת הכוכבים של שש שאריות מטען חשמליות חיוביות על פני החלבון. ואכן, כמה חלבוני קושרי DNA, כוללים ג-ג&#39;ון וN-DEK הוכחו יש יכולת מולדת לחצות קרום תא. 33 לאחרונה, המעבדה שלנו התרחבה על תוצאות אלו, והראו שהפעילות חודרת תאים של zinc- תחומים אצבע (ZIF) יכולים להיות ממונפים למסירת חלבון תאית. היתוך גנטי של שני תחומים זיף אחת או שתי אצבעות למטען חלבון מסוים הוביל לספיגה יעילה שעלו על מערכות רבות קונבנציונליות חודר תאי פפטיד משלוח. 34 בעיקר, משלוח בתיווך זיף לא התפשר הפעילות האנזימטית של מטענים התמזגו והקל רמות גבוהות של משלוח cytosolic. באופן קולקטיבי, ממצאים אלה להדגים את הפוטנציאל של תחום הזיף להקלה על ההעברה היעילה וקלילה של חלבונים, וסוגים שעלולים להיות יותר מגוונים של מאקרומולקולות, לתאים. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט על כיצד ליישם טכנולוגית זיף למסירת חלבון בתאי יונקים מוצג. בנינו חבילה של עבר אחד, שתיים, שלוש, ארבעה, חמש ושש-אצבע תחומים זיף שחסר את היכולת לקשור DNA, עקב החלפה של כל אחד משאריות ה- DNA מחייבת α-סליל, אבל הם מסוגלים לספק חלבונים לתאים 34 (איור 1). הייצור והתמרה של Emerald GFP (EmGFP) לתאי הלה באמצעות תחום זיף שתי אצבעות מתוארת. פרוטוקול זה הוא הרחבה לכמעט כל חלבון מסוגל ביטוי מסיס בEscherichia coli וכמעט כל סוג של תאי יונקים. תוצאות צפויות מסופקות ואסטרטגיות למקסם את הביצועים של מערכת זו הם דנו גם.

<table><tbody><tr><td>XmaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0180L</td><td></td></tr><tr><td>SacI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0156L</td><td></td></tr><tr><td>Expand High Fidelity PCR system</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>4%-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells</td><td>Life Technologies</td><td>EC6028BOX</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>BioRad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Life Technologies</td><td>15224-017</td><td></td></tr><tr><td>BL21 (DE3) Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England Biolabs</td><td>C2527I</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0391</td><td></td></tr><tr><td>Zinc Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin Sulfate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-25</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-25G</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR-V3151&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose Resin</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513-25G</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td><td>EMO Millipore</td><td>UFC900324</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>24-Well Flat Bottom Plate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3527-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, No Calcium, No Magnesium</td><td>Life Technologies</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>Heparan Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4777</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>HeLa cells</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop ND-1000 spectrophotometer&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr></tbody></table>

direct protein delivery to mammalian cells using cell-permeable cys2-his2 zinc-finger domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

יכולים לבוא לידי ביטוי חלבוני היתוך שתי אצבעות הזיף-EmGFP בE. coli עם&gt; ההומוגניות 95% ותשואות גבוהות (&gt; 25 מ&quot;ג / מיליליטר) (איור 2). באופן כללי, אחד ושתי אצבעות ניתן לייצר חלבוני היתוך זיף בכמויות כמעט זהות לאלו של חלבון ללא שינוי wild-type. עם זאת, בחלק ממקרים, חלבוני היתוך זיף חמישה ושש-אצבע אינם מסוגלים לייצר תשואות גבוהות מספיק עבור יישומים במורד הזרם. יישום ישיר של שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP על תאי הלה למשך 90 דקות ב 37 ° C מוביל לעלייה תלוית מינון הקרינה EmGFP (איור 3 א). באופן ביקורתי, אין הקרינה הוא ציין בהעדר תחום הזיף. אנו נצפו בעבר כי כמעט 100% מתאים הם פלורסנט לאחר טיפול עם רק 2 מיקרומטר של שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP, וכי תאים הלה טופלו בחלבון היתוך זיף הם חיוביים לקרינת EmGFP בריכוזים חלבון<html> נמוך כמו 0.25 מיקרומטר (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52814/52814fig1.jpg" /> איור 1. מבנה ורצף חלבון אבץ-אצבע של. מבנה (למעלה) Crystal של תחום אבץ-אצבע אחת (זיף). הרשתות בצד של Cys נשמרים ושאריות שלו בתיאום עם Zn 2 + יון מוצגים כמקלות (PDB ID: 2I13). 37 רצף (תחתון) של תחום הזיף. חיצים וצילינדרים מצביעים מבנים משניים Β גיליון וα-סליל, בהתאמה. שאריות ה- DNA מחייבת α-סליל שהוחלפו באלאנין מודגשות הוורודות. שאריות מטען חשמליות חיוביים ניבאו לתווך הפנמת תא מודגשות בצבע תכלת. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52814/52814fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Fo: לשמור-together.within-page =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52814/52814fig2.jpg" /> 2. איור SDS-PAGE של מטוהר אחד, שתיים, שלושה וארבעה חלבוני היתוך-אצבע הזיף-EmGFP. חלבוני היתוך הזיף-EmGFP באו לידי ביטוי בE. coli ומטוהר על ידי שרף agarose Ni-נת&quot;ע. חלבון eluted נותח לטוהר על ידי SDS-PAGE באמצעות 4% -20% ג&#39;ל טריס-גליצין. אין השפלה או truncations של חלבוני היתוך הזיף-EmGFP משמעותיים נצפתה. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52814/52814fig3.jpg" /> איור 3. זיף בתיווך משלוח חלבון לתוך תאי הלה. (א) הקרינה בעוצמה של תאי הלה שטופלו בכמויות גדלות והולכות של שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP. תאים הלה טופלו בחלבון EmGFP לבד חופפים לחלוטין עם תאים שלא טופלו. עוצמת הקרינה מנורמלת של תאי הלה שטופלה ברצף עם o 2 מיקרומטר (B)שתי אצבעות חלבון הזיף-EmGFP f. עוצמת הקרינה נקבעה על ידי cytometry זרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains at JoVE.com

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג.

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר<sub&gt; 2</sub&gt; כלי-<sub&gt; 2</sub&gt; Domains אבץ האצבע

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

direct-protein-delivery-to-mammalian-cells-using-cell-permeable-cys2

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

9.9K Views.  The Scripps Research Institute.  תחומים אבץ אצבע הם מיסוד תא חדיר ומסוגל תיווך משלוח חלבון למגוון רחב של סוגי יונקים תא. כאן, פרוטוקול צעד-אחר-צעד מפורט ליישום טכנולוגית אבץ-אצבע למסירת חלבון תאית מוצג. 

Video: Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Peptide-derived Method to Transport Genes and Proteins Across Cellular and Organellar Barriers in Plants

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as well as new applications in the field of plant biotechnology. Viable methods that currently exist for protein or gene transfer into plant cells, namely Agrobacterium and microprojectile bombardment, have disadvantages of low transformation frequency, limited host range, or a high cost of equipment and microcarriers. The following protocol outlines a simple and versatile method, which employs rationally-designed peptides as delivery agents for a variety of nucleic acid- and protein-based cargoes into plants. Peptides are selected as tools for development of the system due to their biodegradability, reduced size, diverse and tunable properties as well as the ability to gain intracellular/organellar access. The preparation, characterization and application of optimized formulations for each type of the wide range of delivered cargoes (plasmid DNA, double-stranded DNA or RNA, and protein) are described. Critical steps within the protocol, possible modifications and existing limitations of the method are also discussed.

Existing methods for the modification of plants have limited applicability. The novel peptide-derived technology proposed here promises both simplicity and efficiency in the introduction of exogenous protein or genes into the desired intracellular compartments of intact plants.

פפטיד הנגזרות שיטה לתחבורה גנים וחלבונים מעבר נייד מחסומי Organellar בצמחים

The capacity to introduce exogenous proteins and express (or down-regulate) specific genes in plants provides a powerful tool for fundamental research as ...

Genetics

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Biochemistry

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Bioengineering

Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells to sense and respond to these biomarkers may help the understanding of molecular mechanisms underlying pathologies, as well as to develop new cell-based therapies. While several systems that detect extracellular proteins have been developed, a modular framework that can be easily re-engineered to sense different intracellular proteins was missing.
Here, we describe a protocol to implement a modular genetic platform that senses intracellular proteins and activates a specific cellular response. The device operates on intracellular antibodies or small peptides to sense with high specificity the protein of interest, triggering the transcriptional activation of output genes, through a TEV protease (TEVp)-based actuation module. TEVp is a viral protease that selectively cleaves short cognate peptides and is widely used in biotechnology and synthetic biology for its high orthogonality to the cleavage site. Specifically, we engineered devices that recognize and respond to protein-biomarkers of viral infections and genetic diseases, including mutated huntingtin, NS3 serine-protease, Tat and Nef proteins to detect Huntington&#8217;s disease, hepatitis C virus (HCV) and human immunodeficiency virus (HIV) infections, respectively. Importantly, the system can be hand tailored for the desired input-output functional outcome, such as fluorescent readouts for biosensors, stimulation of antigen presentation for immune response, or initiation of apoptosis to eliminate unhealthy cells.

Here, we present a protocol for engineering genetically-encoded intracellular protein sensor-actuator(s). The device specifically detects target proteins through intracellular antibodies (intrabodies) and responds by switching on gene transcriptional output. A general framework is built to rapidly replace intrabodies, enabling rapid detection of any desired protein, without altering the general architecture.

Proteins can function as biomarkers of pathological conditions, such as neurodegenerative diseases, infections or metabolic syndromes. Engineering cells ...

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the efficiency with which macromolecules penetrate the cytosolic space of cells. Recently, we have circumvented this problem by identifying the reagent dfTAT, a disulfide bond dimer of the peptide TAT labeled with the fluorophore tetramethylrhodamine. We have generated a fluorescently labeled dimer of the prototypical cell-penetrating peptide (CPP) TAT, dfTAT, which penetrates live cells and reaches the cytosolic space of cells with a particularly high efficiency. Cytosolic delivery of dfTAT is achieved in multiple cell lines, including primary cells. Moreover, delivery does not noticeably impact cell viability, proliferation or gene expression. dfTAT can deliver small molecules, peptides, antibodies, biologically active enzymes and a transcription factor. In this report, we describe the protocols involved in dfTAT synthesis and cellular delivery. The manuscript describes how to control the amount of protein delivered to the cytosolic space of cells by varying the amount of protein administered extracellularly. Finally, the current limitations of this new technology and steps involved in validating delivery are discussed. The described protocols should be extremely useful for cell-based assays as well as for the ex vivo manipulation and reprogramming of cells.

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

משלוח של חלבונים, פפטידים או מולקולות קטנות Cell-חדיר לתאים חיים על ידי דגירה עם Endosomolytic מגיב dfTAT

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

Engineering Cell-permeable Protein

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can make use of the translocating ability of so-called cell penetrating peptides (CPPs), also designated as protein transduction domains (PTDs). The TAT-CPP derived from the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Tat (trans-activator of transcription) protein has been widely used. The positively charged TAT promotes cell permeability thereby overcoming the barriers of the cellular membrane by endocytosis or/and direct membrane penetration2. In combination with a nuclear localization signal (NLS) fusion proteins are able to enter the nucleus exhibiting functionality. Our video presentation demonstrates, as an exemplification for the engineering of cell-permeable proteins, the construction, production and application of a cell-permeable version of the DNA-modifying enzyme Cre.
Cre is a site-specific recombinase that is able to recognize and recombine 34 base pair loxP sites in mammalian cells in vitro and in vivo. Therefore the Cre/loxP system is widely used to conditionally induce mutations in the genome of living cells3,4. The delivery of active Cre recombinase to cells, however, represents a limitation.
We describe the pSESAME vector system, which allows a direct insertion of the gene-of-interest and provides a platform to rapidly clone different domains and tags used within the vector in a convenient and standardized manner. Rearranging of the different tags has been shown to modify the biochemical properties of the fusion proteins providing a possibility to achieve higher yield and better solubility. We demonstrate how to express and purify recombinant cell-permeant proteins in and from E. coli. The functionality of the recombinant Cre protein is finally validated in cell culture by assessing its intracellular recombinase activity.

Protein transduction enables the direct delivery of biologically active proteins into cells. In contrast to conventional methods such as DNA transfection or viral transduction this non-invasive paradigm allows highly efficient cellular manipulation in a titratable manner circumventing cellular toxicity and the risk of oncogenic transformation by permanent genetic modification.

הנדסה Cell-חדיר חלבון

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

פלטפורמת ביטוי נוח כללי לייצור חלבונים המופרשים מ תאים אנושיים

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

Recombinant Protein Expression for Structural Biology in HEK 293F Suspension Cells: A Novel and Accessible Approach

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two decades, prokaryotic expression systems such as E. coli have dominated the scientific literature over costly and less efficient eukaryotic cell lines. Despite the clear advantage in terms of yields and costs of expressing recombinant proteins in bacteria, the absence of specific co-factors, chaperones and post-translational modifications may cause loss of function, mis-folding and can disrupt protein-protein interactions of certain eukaryotic multi-subunit complexes, surface receptors and secreted proteins. The use of mammalian cell expression systems can address these drawbacks since they provide a eukaryotic expression environment. However, low protein yields and high costs of such methods have until recently limited their use for structural biology. Here we describe a simple and accessible method for expressing and purifying milligram quantities of protein by performing transient transfections of suspension grown HEK (Human Embryonic Kidney) 293F cells.

The expression of recombinant proteins by mammalian systems is becoming an attractive method for producing protein complexes for structural biology. Here we present a simple yet highly efficient expression system using suspension grown mammalian cells to purify protein complexes for structural studies.

ביטוי חלבון רקומביננטי לביולוגיה מבנית בתאי ההשעיה HEK 293F: רומן וגישה נגישה

The expression and purification of large amounts of recombinant protein complexes is an essential requirement for structural biology studies. For over two ...

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their cytotoxic granule content to eliminate the target cells and the intracellular pathogen. Death of the host cells and intracellular pathogens is triggered by the granule serine proteases, granzymes (Gzms), delivered into the host cell cytosol by the pore forming protein perforin (PFN) and into bacterial pathogens by the prokaryotic membrane disrupting protein granulysin (GNLY). To investigate the molecular mechanisms of target cell death mediated by the Gzms in experimental in-vitro settings, protein expression and purification systems that produce high amounts of active enzymes are necessary. Mammalian secreted protein expression systems imply the potential to produce correctly folded, fully functional protein that bears posttranslational modification, such as glycosylation. Therefore, we used a cost-efficient calcium precipitation method for transient transfection of HEK293T cells with human Gzms cloned into the expression plasmid pHLsec. Gzm purification from the culture supernatant was achieved by immobilized nickel affinity chromatography using the C-terminal polyhistidine tag provided by the vector. The insertion of an enterokinase site at the N-terminus of the protein allowed the generation of active protease that was finally purified by cation exchange chromatography. The system was tested by producing high levels of cytotoxic human Gzm A, B and M and should be capable to produce virtually every enzyme in the human body in high yields.

We describe here a cost-efficient granzyme expression system using HEK293T cells that produces high yields of pure, fully glycosylated and enzymatically active protease.

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

משלוח חלבון ישיר לשימוש בתאי יונקי Cys Cell-חדיר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video