This work has been supported by the DFG grant JE 252/7.

<ol>
	<li>Margueron, R., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+structure+and+the+inheritance+of+epigenetic+information.">Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Helin, K., Dhanak, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+and+modifications+as+drug+targets.">Chromatin proteins and modifications as drug targets.</a> Nature. 502, 480-488 (2013).</li><li>Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+methylation+at+the+surface+and+buried+deep:+thinking+outside+the+histone+box.">Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).</li><li>Rathert, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+lysine+methyltransferase+G9a+acts+on+non-histone+targets.">Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets.</a> Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).</li><li>Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PhosphoSite:+A+bioinformatics+resource+dedicated+to+physiological+protein+phosphorylation.">PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation.</a> Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).</li><li>Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+peptide+arrays+prepared+by+the+SPOT-technology.">Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).</li><li>Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SPOT+synthesis+as+a+tool+to+study+protein-protein+interactions.">SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions.</a> Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).</li><li>Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+kinase+target+phosphorylation+consensus+motifs+using+peptide+SPOT+arrays.">Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays.</a> Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).</li><li>Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SPOT-synthesis+technique.+Synthetic+peptide+arrays+on+membrane+supports--principles+and+applications.">The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications.</a> Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).</li><li>Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+arrays+on+cellulose+support:+SPOT+synthesis,+a+time+and+cost+efficient+method+for+synthesis+of+large+numbers+of+peptides+in+a+parallel+and+addressable+fashion.">Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion.</a> Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).</li><li>Li, S. S., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+peptide+array+to+identify+binding+motifs+and+interaction+networks+for+modular+domains.">Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains.</a> Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).</li><li>Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+peptide+arrays+using+SPOT-technology+and+the+CelluSpots-method.">Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method.</a> Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).</li><li>Toepert, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+SPOT+synthesis+and+native+peptide+ligation+to+create+large+arrays+of+WW+protein+domains.">Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).</li><li>Volkmer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+application+of+peptide+arrays:+quo+vadis+SPOT+technology.">Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology.</a> Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).</li><li>Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+substrate+specificity+of+the+Dim-5+histone+lysine+methyltransferase+using+peptide+arrays.">Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays.</a> Chemistr., &amp; biology. 15, 5-11 (2008).</li><li>Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SET8+H4K20+protein+lysine+methyltransferase+has+a+long+recognition+sequence+covering+seven+amino+acid+residues.">The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues.</a> Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).</li><li>Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+analysis-based+identification+of+new+methylation+targets+of+the+SET7/9+protein+lysine+methyltransferase.">Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase.</a> Chemistr., &amp; Biology. 18, 111-120 (2011).</li><li>Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+and+novel+substrates+of+the+protein+lysine+methyltransferase+NSD1.">Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1.</a> Chemistr., &amp; Biology. 21, 226-237 (2014).</li><li>Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scansite+2.0:+Proteome-wide+prediction+of+cell+signaling+interactions+using+short+sequence+motifs.">Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs.</a> Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).</li><li>Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+design+based+on+an+antibody+complementarity-determining+region+(CDR):+construction+of+porphyrin-binding+peptides+and+their+affinity+maturation+by+a+combinatorial+method.">Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method.</a> Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).</li><li>Kramer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spot+synthesis:+observations+and+optimizations.">Spot synthesis: observations and optimizations.</a> J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).</li><li>Stadler, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+synthesis+of+peptide+arrays+with+a+laser+printer.">Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).</li><li>Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+substrates+for+Cdk5+and+new+targets+for+Cdk5+inhibitors+using+high-density+protein+microarrays.">Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays.</a> Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).</li><li>Mah, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate+specificity+analysis+of+protein+kinase+complex+Dbf2-Mob1+by+peptide+library+and+proteome+array+screening.">Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening.</a> BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

סינתזת SPOT כפי שמתואר כאן היא שיטה חזקה כדי למפות אתרי אינטראקציה בין חלבונים ולחקור את הכרת המצע של אנזימי פפטיד שינוי. עם זאת, סינתזת SPOT עדיין יש חסרונות מסוימים, משום שלמרות שפפטידים המתאחדים בשיטת SPOT מדווחים יש יותר מ- 90% טוהר 21 זה קשה כדי לאשר בכל מקרה. לכן, תוצאות צריכה להיות מיוצרות בשיטות אחרות לתחומים חלבון למשל באמצעות או עם פפטידים מטוהרים מסונתזים על ידי שיטות סטנדרטית. בנוסף, החסרון העיקרי האחר של מערכי SPOT הוא שרוב הזמן הם לא ניתן לעשות שימוש חוזר לבצע כמה מבחני עם מערך אחד. כדי להגביר את היעילות של סינתזה עם חומצות אמינו של יציבות נמוכה, כמו ארגינין המוגן, חשוב להפוך אותם טריים לכל 5 מחזורים. בתגובות אנזימטיות או לימודי חלבון מחייב אותו הוא נצפה לעתים קרובות שהפריפריה של מקום פפטיד יש מומחדש עוצמת אות יותר מאשר במרכז (&quot;אפקט נקודת טבעת&quot;). אפקט זה יכול להיות בגלל הצפיפות הגבוהה של פפטידים בחלק מהמקום המרכזי ואז זה יכול להיפתר על ידי downscaling סינתזת פפטיד 22. לירי צרות נוסף של פפטיד סינתזה מדריך המכונה ושירות חברה יש להתייעץ. אם מתילציה לא נצפתה, פפטידים בקרה חיובית (כלומר פפטידים ידועים להיות מפוגל על ידי האנזים תחת חקירה) יש להוסיף לממברנה. חלופי למערכי SPOT, מערכי מיקרו פפטיד צפיפות הגבוה 23 זמינים, אך הם יקרים יותר ודורשים ציוד מיוחד לשימוש. יתר על כן הסכום של הפפטיד למקום קטן יותר, אשר דורש נהלי קריאה רגישים יותר. מערכי חלבון זמינים גם ללמוד פונקציות אלה 24,25, אבל הם קשים יותר להכנה, כי כל חלבון אדם צריך לבוא לידי ביטוי ומטוהר וקיפול חלבונים במערך צריך להישמר. יתרון נוסף של מערכי פפטיד הוא ההקדמה האפשרית של שינויי translational פוסט במהלך הסינתזה ואת הקלות של בדיקות מוטאציות של התפקידים של שאריות חומצת אמינו בודדות. זה נקודת התחלה חיונית לפרוטוקול זה, יש פפטיד לפחות אחד מזוהה, אשר מפוגל על ​​ידי האנזים תחת חקירה. תנאי מתילציה ומאגרים צריכים להיות מותאמים, כמו גם את הריכוז של methyltransferase. קורסי זמן מופת של מתילציה צריכים להיות נחושים בדעתו למנוע מתילציה של המצע הטוב ביותר, דבר שיגרום לאובדן של טווח דינמי מלאה.

בשני העשורים האחרונים, כמה דיווחים הוכיחו את החשיבות של שינויים לאחר translational (PTM) בפיתוח סלולארי וכמה מחלות כמו סרטן, אך לאחרונה מתילציה ליזין חלבון התפתחה אחר PTM חיוני. בעוד מתילציה ליזין תחילה היסטון נמצאה סימן הכרומטין חיוני, עבודה מאוחר יותר הראתה גם מתילציה ליזין של כמה חלבונים לא-היסטון 1-4. ההעברה רציפה של קבוצות מתיל מS-adenosyl-L-מתיונין לקבוצת ε-אמינו של שאריות ליזין היא זרז על ידי משפחה של אנזימים בשם החלבון Methyltransferases ליזין (PKMTs) המכילה יותר מ -60 חלבונים בגנום האנושי. PKMTs תחילה התגלה כאנזימי היסטון שינוי שmethylate שאריות ליזין ספציפיים אך דיווחים מאוחרים יותר הראו שהם יכולים גם methylate חלבונים לא-היסטון 5. עד עכשיו, כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים 6 </sעד&gt;, אך האנזימים אחראים לשינויים אלה לעתים קרובות לא מזוהים. אחת סיבות לכך היא שהספציפיות של רוב PKMTs לא נחקרו בהרחבה. לכן, שוב ושוב מתרחש שמצעי רומן של PKMTs מתגלים. חוסר ידע מפורט של סגוליות המצע של PKMTs מעכב הבנה של התפקוד הביולוגי שלהם והתפקיד. כדי לחקור את הספציפיות של PKMT בפירוט, שיעורי מתילציה של מצעי פפטיד רבים שונות בחומצות אמינו אחת או כמה יש למדוד ולהשוות, אשר באופן אידיאלי מתבצע באמצעות מערכי פפטיד. בהתבסס על הפרופילים ספציפיים וכתוצאה מכך, מצעי פוטנציאל של PKMTs ניתן לזהות שניתן ללמוד עוד. מערכי פפטיד נמצאים בשימוש נרחב בכלים לניתוח ביוכימי של נוגדנים, אנזימי שינוי פפטיד ומיפוי של אתרי אינטראקציה בין חלבונים (הנוגדנים אנטיגן, קולט ליגנד) 7-9. כמה מאות פפטידים הנדרשים לsucיישומי h. שיטות שונות זמינות עבור סינתזת פפטיד, ביניהם פפטיד סינתזה על שרף מאוד נפוץ, אבל יש לו מגבלות בתפוקה וזה יקר יחסית. בעיות אלה נפתרו עם כניסתה של שיטת סינתזת SPOT על ידי פרנק ועמיתים 10. שיטת סינתזת SPOT מאפשרת סינתזה של כמה מאה פפטידים במקביל ובממוצע זה הוא זול בהשוואה לסינתזת שרף. פפטידים המתאחד על קרום תאית יכולים לשמש באופן ישיר עבור יישומים או פפטידים שונים ניתן ביקעו מהקרום ומשמש כפפטידים חופשיים למבחני פתרון או להכין microarrays פפטיד 10-13. סינתזת SPOT הינה נגזרת של סינתזת פפטיד השלב המוצקה, אשר עושה שימוש בקרום תאית כתמיכה מוצקה ומעסיקה Fmoc-הכימיה סטנדרטית 10-13. לפיכך, הסינתזה של רשתות פפטיד מתחילה בסוף C-מסוף וממשיך לכיווןסוף N-terminal בניגוד לסינתזה הביולוגית בריבוזומים. קרומים תאית הם פונקציונליות לצירופה של חומצות אמינו הופעלו הראשונות (איור. 1). שיטת SPOT מבוססת על האספקה ​​רציפה של חומצות אמינו הופעלו בטיפה של ממס לכתמים מוגדרים על הקרום באמצעות מערכת pipetting אוטומטית. הטיפה של נוזל היא לוותר על הקרום הנקבובי שבו הוא יוצר כתם רטוב מעגלי, אשר מאוחר יותר פועל ככור פתוח לתגובות כימיות בסינתזת פפטיד. גודל הנקודה נקבע על ידי הנפח לוותר ויכולת הקליטה של ​​הקרום, בכפולות של כתמים כגון מסודרות כמו מערכים. הסולם של סינתזה בקורלציה עם גודל הנקודה ואת יכולת הטעינה של הקרום. המרחק בין הכתמים והצפיפות של מערכים מנוהל על ידי שינוי גדלי המקום. יש קרום תאית כמה יתרונות כמו שלב מוצק בסינתזת פפטיד, זה לא יקר, סובלני לchemicals משמש בסינתזת פפטיד, יציב בתמיסות מימיות וקל לטפל. בנוסף, האופי הידרופילי שלה הופך אותו מתאים למספר מערכות assay ביולוגיות. סינתזת SPOT יכולה להתבצע באופן ידני או אוטומטי (ל1000s של פפטידים) בהתאם למספר הנדרש של פפטידים. סינתיסייזר SPOT אוטומטי לחלוטין מIntavis (קלן, גרמניה) משמש ליישומים שלנו. היא מאפשרת סינתזה של פפטידים בכמויות שונות ואורך שונה. פפטידים ליניארי מסונתזים באופן קבוע עם אורך חומצת אמינו 15 עד 20, בפפטידים תוספת של עד 42 חומצות אמינו יכול גם להיות מוכן בסינתזה צעד חכם 14,15. עם זאת, הגדלת מספר חומצות אמינו מובילה לירידה בתשואות הצימוד הכוללות, אשר משפיעה על האיכות של פפטידים. בגלל הכמות הנמוכה של פפטידים למקום, המוצרים לעתים קרובות קשים כדי לטהר ולא ניתן להעריך בקלות את האיכות של פפטידים בודדים. לכן, התוצאות שהתקבלו מpept SPOTמערכי IDE חייבים להיות מאושרים גם עם פפטידים המתאחדים בשיטות סטנדרטי בקנה מידה גדולה יותר, אשר יכול להיות מטוהרת ונותחו על פי סטנדרטים בסינתזת פפטיד או על ידי סינתזת החלבונים המכילים את רצפי הפפטיד הרצויים. ובכל זאת, מצאנו את סינתזת SPOT להיות אמין מאוד ותוצאות בדרך כלל להיות לשחזור. סינתזת SPOT אינה מוגבלת לproteinogenic חומצות אמינו, חומצות אמינו כמה שונה זמינות מסחרי יכול לשמש גם לסינתזה, המאפשרת פפטידים להיות שונה לפני ואחרי המחשוף הסופי של קבוצת הגנת צד שרשרת ו, יתר על כן, הוא גם מאפשר שילוב של חומצות אמינו phosphorylated, מפוגלים או acetylated 11. ספריות פפטיד משותקות המסונתזת על ידי שיטת SPOT ניתן להשתמש ישירות עבור רבים מבחני ביולוגיים וביוכימיים. אנחנו עובדים מערכי פפטיד הכוללים 300-400 פפטידים לחקור את הספציפיות המצע של PKMTs. לmodifi האנזימטיתקטיון, מערכי פפטיד מודגרת עם PKMT המתאים ושכותרתו [methyl- 3 H] -AdoMet במאגר מתאים. מתילציה של המצע המתאים מנותחת על ידי בעקבות ההעברה האנזימטית של קבוצות מתיל שכותרת רדיואקטיבית מAdoMet למצע פפטיד באמצעות autoradiography (איור. 3). על ידי הליך זה, מערכי פפטיד לאפשר המחקר של מתילציה של מצעי פפטיד שונים באותו הזמן. יתרון חשוב של שיטה זו הוא שכל פפטידים מפוגלים בתחרות, כך שבשלב ליניארי של קינטיקה מתילציה, מתילציה היחסית של כל פפטיד היא פרופורציונלית לשיעור הקבוע קטליטי מחולק במתמיד דיסוציאציה (k חתול / K D) של האנזים למצע פפטיד בהתאמה. לפיכך, הסכום של רדיואקטיביות שולב כל נקודה מתואם ישירות עם הפעילות האנזימטית לקראת פפטיד המסוים. שימוש בתוצאותיו של ניסוי מתילציה מערך פפטיד, הפרופיל הספציפי של PKMT יכול להיות מוגדרת ומבוסס על מצעי הרומן הזה יכול להיות מבוסס. מערכי פפטיד לאפשר אימות היעילה המהירה ועלות של מתילציה של מצעי רומן ברמת פפטיד. לשם כך, מערכים מוכנים המכילים את מצעי הרומן חזו יחד עם פפטידים שונה המכילים עלא במקום ליס באתרי היעד, כמו גם פפטידים ביקורת חיוביים ושליליים. לבסוף, ניתן להכין מצעי רומן חלבונים יחד עם מוטציות, שבו היעד ליס משתנה לעלא ומתילציה ניתן לאשר ברמת החלבון. בהתאם לתוצאות, זה לאחר מכן על ידי מחקרים ביולוגיים טיפול תפקידים פוטנציאליים של מתילציה של מצעי החלבון תיארו זה עתה.

<table><tbody><tr><td>Ethanol abs Gradient Grade HPLC</td><td>Honeywell</td><td>10299901</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-Dimethylformamide Peptide Synthesis</td><td>Biosolve</td><td>4193302</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Piperidine &amp;ge;99% for Peptide Synthesis</td><td>Roth</td><td>A122.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate )</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&amp;rsquo;&lt;/em&gt;-Diisopropylcarbodiimide purum &amp;ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>Flammable, Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>Flammable, Toxic</td></tr><tr><td>Dichlormethane &amp;ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>Carcinogenic</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-Methyl-2-Pyrrolidone</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Derivatized cellulose Membrane</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>Toxic, corrosive</td></tr><tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Hydrogen Carbonate</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate Pellets</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>Toxic, Flammable</td></tr><tr><td>MultiPep Synthesizer</td><td>Intavis AG K&amp;ouml;ln</td><td>n.a.</td><td></td></tr><tr><td>HyperfilmTM high performance film</td><td>GE Healthcare</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretix software</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

specificity analysis of protein lysine methyltransferases using spot peptide arrays

מתילציה ליזין היא שינוי לאחר תרגום מתעורר וזה זוהה על חלבונים כמה היסטון ולא-היסטון, שבו היא משחקת תפקידים מכריעים בפיתוח תאים ומחלות רבות. כ -5,000 אתרי מתילציה ליזין זוהו על חלבונים שונים, הנקבעים על ידי כמה עשרות methyltransferases יזין החלבון. הדבר מצביע על כך כל PKMT methylates חלבונים מרובים, אך עד עכשיו רק אחד או שתיים מצעים זוהו במשך כמה אנזימים אלה. הספציפיות מצע מבוססות מערך פפטיד להתקרב בעיה זו, יש לנו הצגתי ניתוחים של PKMTs. מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs כי מתילציה של כמה מצעים עם רצפים שונים, ניתן לבדוק על מערך אחד. אנו מסונתזים מערכי פפטיד על קרום תאית באמצעות סינתיסייזר Intavis SPOT וניתחנו את הספציפיות של PKMTs השונים. בהתבסס על התוצאות, לכמה מאנזימים אלה של רומן,ubstrates יכול להיות מזוהה. לדוגמא, לNSD1 על ידי העסקת מערכי פפטיד, שהראינו כי זה methylates K44 של H4 במקום H4K20 דיווח ובנוסף H1.5K168 הוא המצע המועדף ביותר על H3K36 הידוע קודם לכן. לפיכך, מערכי פפטיד הם כלים רבי עוצמה כדי לאפיין ביוכימית PKMTs.

מערכי פפטיד שמשו בהצלחה כדי לאפיין את הספציפיות של PKMTs ביוכימית, וכמה מצעי היסטון רומן ולא-היסטון של PKMT זוהו על ידי גישה זו 5,16-19. הגדרת ספקטרום המצע הנכון של PKMT (או כל אנזים) היא צעד חיוני לקראת הבנה של המנגנון המולקולרי שלו ותפקודים תאיים. כדוגמא ליישום שיטת מתילציה מערך SPOT פפטיד, אנו מתארים את תוצאות הניתוח הספציפי של NSD1 PKMT 19. קודם לעבודה שלנו, אנזים זה תואר לכמה מצעי methylate כוללים H3 היסטון בK36 וH4 היסטון בK20 אלא גם p65 גורם שעתוק משפחת NF-kB בK218 וK221. איור. 4A מראה דוגמא של תגובת מתילציה של מערך פפטיד עם NSD1. לשם כך ניסויים, מערך פפטיד גדול המבוסס על H3 (31-49) רצף היה מסונתז המכיל את כל אפשרישינויי חומצת אמינו בודדים של הרצף המקורי כדי לבדוק את המשמעות של כל חומצת אמינו לאינטראקציה NSD1 ומתילציה. בסך הכל 380 פפטידים היו מסונתזים (20 חומצות אמינו אפשריות x 18 שאריות בתוספת רצף H3 מקורי אחד בכל שורה). הציר האופקי מייצג את הרצף של הפפטיד ובכיוון האנכי חומצת אמינו אשר שינתה בפפטיד המקביל מצויינים. לדוגמא, הנקודה בקו 17 בעמודה 4 מכילה תראונין במקום שלישי במקום גליצין שנמצא ברצף הפראי הסוג (איור. 4 א). באופן כזה, מוטציות נקודה נוצרות על מנת לבחון את ההעדפה של NSD1 עבור כל חומצת אמינו ילידים בכל עמדה במצע פפטיד. מתילציה עם NSD1 הראתה שזה דווקא פועל על H3K36 ויש לה העדפות משני צדי ליזין היעד 34-38. איור 4 מייצג את האיחוד של מתילציה מערך שלושה פפטידניסויים עם NSD1. המידע כמותי נרכש ממערכי פפטיד הבודדים והתוצאות היו מנורמלות וממוצע כפי שתוארו לעיל. סטיות התקן של ממוצעי פרט מראות כי הנתונים הם מאוד לשחזור. בסך הכל כ -85% מפפטידים תערוכות סטיות תקן קטנים יותר מ -20% ויותר מ- 97% ממצעי פפטיד הפגינו סטיות תקן קטנים יותר מ -30% (איור. 4C). בנוסף, אנחנו גם מחושבים גורם האפליה כדי לקבוע את תרומתו של כל חומצת אמינו בעמדות שנבדקו בדיוק. כפי שתואר זה מספק תיאור כמותי של פפטיד הקריא והעדפה של חומצות אמינו במיקום הספציפי (איור. 5A). הנתונים שלנו מראים כי NSD1 מעדיף שאריות ריחניות בעמדת -2 (בהתחשב K36 כעמדה 0) (F&gt; Y&gt; G); שאריות הידרופובי ב-1 (אני&gt; L&gt; V); שאריות בסיסיות ב+1 (R&gt; QKNM), שבו הוא לא יכול לסבול את השאריות הידרופובי או ריחניות; וhydשאריות rophobic ב+2 (V&gt; P IA&gt;). באתרים אחרים (כמו -3, +3, או +6), NSD1 מעדיף כמה חומצות אמינו, אבל אין קריאה ספציפית שאריות חזקות זוהתה. בהתבסס על פרופיל זה, ניתן למצוא מצעי פפטיד רומן פוטנציאליים על ידי חיפושי מסד נתונים כמו שימוש Scansite 20 (איור. 5 ב). פפטידים אלה נערכו על מערך SPOT כוללים בקרות חיוביות ושליליות וטופחו עם NSD1 ושכותרתו רדיואקטיבית AdoMet לזהות תת-הקבוצה שלהם, כי הם מפוגלים ברמת פפטיד (איור. 5 ג). כמו בצעו קופצים, ניתן להכין מערכי פפטיד הכוללים גרסאות פפטיד, שבו ליזין היעד הוא הוחלף על ידי אלאנין, כדי לאשר מתילציה המתרחשת באתר ניבא. לאחר מכן, ניתן לייצר חלבוני היעד או תחומי משנה שלהם מכילים ליזין היעד recombinantly ומתילציה בדקה גם ברמת חלבון. לבסוף, בהתאם לתוצאות, מעקב ניסויים אני יכול<html> nvestigate אם מתילציה מתרחשת גם בתאים ושיש לו תפקיד ביולוגי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52203/52203fig1highres.jpg" /> איור 1:. תכנית של סינתזת פפטיד בשיטת SPOT על קרום תאית <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52203/52203fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52203/52203fig2highres.jpg" /> איור 2:. דוגמא למערך פפטיד המוכתם בכחול bromophenol כדי לאשר את הסינתזה של פפטידים <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52203/52203fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> p_upload / 52,203 / 52203fig3highres.jpg &quot;/&gt; איור 3: תכנית של ניסוי מתילציה מערך פפטיד; מערכי פפטיד היו מפוגלים על ידי דגירה עם PKMT וכותרתו [methyl- 3 H] -AdoMet במאגר מתאים. לאחר מכן הועברה לרדיואקטיביות כל מקום הוא זוהה על ידי autoradiography. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52203/52203fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52203/52203fig4highres.jpg" /> תוצאות שהושגו עם דוגמא PKMT NSD1 דוגמא למערך פפטיד ספציפי מצע לNSD1 באמצעות H3 () רצף 31-49 כתבנית): איור 4.. הציר האופקי מייצג את רצף H3 והציר האנכי מייצג את חומצות אמינו על ידי שהשורה המתאימה עוברת מוטציה. השורה הראשונה מכילה פפטידים עםרצף מקורי. B) איחוד תוצאות מניסויי 3 מתילציה מערך פפטיד עצמאיים עם NSD1, נתונים היו בממוצע תוצאות מכל שלושת הניסויים לאחר הפצת נורמליזציה. C) של סטיות תקן עבור נתונים מתילציה הממוצע מוצגים בB. הפנל לשכפל מet Kudithipudi אל. (2014) עם שינויים מסוימים 19. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52203/52203fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52203/52203fig5highres.jpg" /> איור 5:. גילוי של מצעי PKMT רומן) גורמי אפליה של NSD1 להכרה של שאריות חומצת אמינו בעמדות ליד ליזין היעד (K36 שמוצגים כאן בניסוי). הנתונים מראים כי NSD1 מעדיף שאריות ריחניות בעמ -2<html> osition (בהתחשב K36 כעמדה 0). שאריות הידרופובי מוכרות ב-1 ו+2 עמדות, אם כי בהבדלים בולטים בפרטים. באתר +1 שאריות ואורגניות חיבור בסיסיים עדיפות. באתרים אחרים כמה העדפות חלשות, אבל אין קריאה ספציפית שאריות חזקות זוהו. B) צילום מסך של חיפוש דוגמא בScansite, באמצעות הפרופיל הספציפי שנקבע לNSD1. מערך פפטיד SPOT C) המכיל כמה רומן חזה NSD1 מצעים יחד עם חיובי (H3K36 ) ובקרות שליליות (H3K36A). חלק ממטרות הרומן התבססו היו מפוגל מאוד (חלקם מבואר), ובמקרים אחרים לא ניתן היו לאמת את התחזיות. לוח A ו- C הוא לשחזר מKudithipudi et al. (2014) עם שינויים מסוימים 19. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/52203/52203fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadd</html style=";text-align:right;direction:rtl">= Cellspacing &quot;0&quot; ing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> בסיס </td><td> 1 M Oxyma טהור בתמ&quot;א -&gt; 2,13 g Oxyma טהור ב 15 מיליליטר NMP </td></tr><tr><td> Activator </td><td> 2.4 מיליליטר N, -Diisopropylcarbodiimide &#39;N ב 15 מיליליטר NMP </td></tr><tr><td> תערובת מכסת </td><td> 20% אנהידריד אצטית בDMF -&gt; 6 מיליליטר אנהידריד אצטית ב -30 מיליליטר DMF </td></tr><tr><td> Fmoc Deprotection </td><td> Piperidine 20% בDMF -&gt; 200 מיליליטר ב1,000 מיליליטר DMF </td></tr><tr><td> Sidechain Deprotection </td><td> DDH Triisopropylsilane + 600 μl 900 μl 2 O ב -30 מיליליטר TFA </td></tr><tr><td> מכתים </td><td> 0.02% bromophenol כחול בDMF </td></tr></tbody></table> טבלת 1: תערובות כימיות וההרכב שלהם בשימוש בפרוטוקול.

Watch this Scientific Journal Video about Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays at JoVE.com

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

ניתוח הספציפי של החלבון ליזין Methyltransferases שימוש SPOT פפטיד מערכים

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

specificity-analysis-protein-lysine-methyltransferases-using-spot

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

13.9K Views.  Stuttgart University. Peptide arrays synthesized by the SPOT method can be used to analyze the substrate specificity of Protein lysine methyltransferases (PKMTs) and to define the substrate spectrum of PKMTs to understand their biological role. This protocol describes how to synthesize peptide arrays, methylate them with PKMTs, and analyze the results.

Video: Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

ניתוח של היסטון נוגדנים היסטון עם Microprays פפטיד

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Biochemistry

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Immunology and Infection

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, including RNA processing, signal transduction, DNA damage response, miRNA biogenesis, and translation.
In recent years, thanks to biochemical and analytical developments, mass spectrometry (MS)-based proteomics has emerged as the most effective strategy to characterize the cellular methyl-proteome with single-site resolution. However, identifying and profiling in vivo protein R-methylation by MS remains challenging and error-prone, mainly due to the substoichiometric nature of this modification and the presence of various amino acid substitutions and chemical methyl-esterification of acidic residues that are isobaric to methylation. Thus, enrichment methods to enhance the identification of R-methyl-peptides and orthogonal validation strategies to reduce False Discovery Rates (FDR) in methyl-proteomics studies are required.
Here, a protocol specifically designed for high-confidence R-methyl-peptides identification and quantitation from cellular samples is described, which couples metabolic labeling of cells with heavy isotope-encoded Methionine (hmSILAC) and dual protease in-solution digestion of whole cell extract, followed by off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) chromatography fractionation and affinity enrichment of R-methyl-peptides using anti-pan-R-methyl antibodies. Upon high-resolution MS analysis, raw data are first processed with the MaxQuant software package and the results are then analyzed by hmSEEKER, a software designed for the in-depth search of MS peak pairs corresponding to light and heavy methyl-peptide within the MaxQuant output files.

Protein Arginine (R)-methylation is a wide-spread post-translational modification regulating multiple biological pathways. Mass spectrometry is the best technology to globally profile the R-methyl-proteome, when coupled to biochemical approaches for modified peptide enrichment. The workflow designed for the high confidence identification of global R-methylation in human cells is described here.

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

הכנה לדוגמה וכמות יחסית באמצעות מתילציה מופחתת של אמינים למחקרי פפטידומית

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Characterization of Neuronal Lysosome Interactome with Proximity Labeling Proteomics

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to human brain function, as neurons are postmitotic and rely heavily on the autophagy-lysosome pathway to maintain cellular homeostasis. Despite advancements in the understanding of various lysosomal functions, capturing the highly dynamic communications between lysosomes and other cellular components is technically challenging, particularly in a high-throughput fashion. Here, a detailed protocol is provided for the recently published endogenous (knock-in) lysosome proximity labeling proteomic method in human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived neurons. 
Both lysosomal membrane proteins and proteins surrounding lysosomes within a 10-20 nm radius can be confidently identified and accurately quantified in live human neurons. Each step of the protocol is described in detail, i.e., hiPSC-neuron culture, proximity labeling, neuron harvest, fluorescence microscopy, biotinylated protein enrichment, protein digestion, LC-MS analysis, and data analysis. In summary, this unique endogenous lysosomal proximity labeling proteomics method provides a high-throughput and robust analytical tool to study the highly dynamic lysosomal activities in live human neurons.

A neuronal lysosome proximity labeling proteomics protocol is described here to characterize the dynamic lysosomal microenvironment in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Lysosomal membrane proteins and proteins that interact with lysosomes (stably or transiently) can be accurately quantified in this method with excellent intracellular spatial resolution in live human neurons.

אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה

Lysosomes frequently communicate with a variety of biomolecules to achieve the degradation and other diverse cellular functions. Lysosomes are critical to ...

Neuroscience

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein functions, for example, by changing enzymatic activity or by mediating interactions. Precise quantification of site-specific protein acylation occupancy, or stoichiometry, is essential for understanding the functional consequences of both global low-level stoichiometry and individual high-level acylation stoichiometry of specific lysine residues. Other groups have reported measurement of lysine acetylation stoichiometry by comparing the ratio of peptide precursor isotopes from endogenous, natural abundance acylation and exogenous, heavy isotope-labeled acylation introduced after quantitative chemical acetylation of proteins using stable isotope-labeled acetic anhydride. This protocol describes an optimized approach featuring several improvements, including: (1) increased chemical acylation efficiency, (2) the ability to measure protein succinylation in addition to acetylation, and (3) improved quantitative accuracy due to reduced interferences using fragment ion quantification from data-independent acquisitions (DIA) instead of precursor ion signal from data-dependent acquisition (DDA). The use of extracted peak areas from fragment ions for quantification also uniquely enables differentiation of site-level acylation stoichiometry from proteolytic peptides containing more than one lysine residue, which is not possible using precursor ion signals for quantification. Data visualization in Skyline, an open source quantitative proteomics environment, allows for convenient data inspection and review. Together, this workflow offers unbiased, precise, and accurate quantification of site-specific lysine acetylation and succinylation occupancy of an entire proteome, which may reveal and prioritize biologically relevant acylation sites.

Here, we present unbiased quantification of site-specific protein acetylation and/or succinylation occupancy (stoichiometry) of an entire proteome through a ratiometric analysis of endogenous modifications to modifications introduced after quantitative chemical acylation using stable isotope-labeled anhydrides. In combination with sensitive data-independent acquisition mass spectrometry, accurate site occupancy measurements are obtained.

כימות של חלבון ספציפי לאתר ליזין Acetylation ו- Succinylation סטויכיומטריה באמצעות ספקטרומטר מסה רכישה עצמאית נתונים

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Simultaneous Affinity Enrichment of Two Post-Translational Modifications for Quantification and Site Localization

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into protein function. Despite the importance of multi-PTM enrichment studies, few studies investigate more than one PTM at a time, due partially to the expenses, time, and large protein quantities required to perform multiple global proteomic analysis of PTMs. The &#34;one-pot&#34; affinity enrichment detailed in this protocol overcomes these barriers by permitting the simultaneous identification and quantification of peptides with lysine residues containing acetylation and succinylation PTMs with low amounts of sample input. The protocol involves preparation of protein lysate from mouse livers of SIRT5 knockout mice, performance of trypsin digestion, enrichment for PTMs, and performance of mass spectrometric analysis using a data-independent acquisition (DIA) workflow. Because this workflow allows for the enrichment of two PTMs from the same sample simultaneously, it provides a practical tool to study PTM crosstalk without requiring large amounts of samples, and it greatly reduces the time required for sample preparation, data acquisition, and analysis. The DIA component of the workflow provides comprehensive PTM-specific information. This is particularly important when studying PTM site localization, as DIA provides comprehensive sets of fragment ions that can be computationally deciphered to differentiate between different PTM localization isoforms.

This workflow describes the performance of time- and cost-efficient enrichment of multiple protein post-translational modifications (PTMs) simultaneously for quantitative global proteomic analysis. The protocol utilizes peptide-level PTM enrichment with multiple conjugated antibodies, followed by data-independent acquisition mass spectrometry analysis to gain biological insights into PTM crosstalk.

העשרת אהדה בו של שני שינויים שלאחר ההעברה לקוונפיקציה ולוקליזציה לאתר

Studying multiple post-translational modifications (PTMs) of proteins is a crucial step to understand PTM crosstalk and gain more holistic insights into ...