This research was supported by the Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 and the CTSA award UL1TR000445 from the National Center for Advancing Translational Sciences. Its contents are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent official views of the National Center for Advancing Translational Sciences or the National Institutes of Health. Scanning electron microscopy experiments were performed in part through the use of the VUMC Cell Imaging Shared Resource, supported by NIH grants CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 and EY08126.

1. ח פילורי צמיחה בתנאים שונים של זמינות ברזל ושיתוף תרבות עם תאים אנושי הקיבה אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ה &#39; PMSS1 פילורי מתח למחקרים אלה כי יש לו אי פתוגניות CAG שלם ומבטא את מערכת הפרשה מסוג IV תפקוד. גם לנצל מוטציה כלוב isogenic (PMSSI Δ קייג &#39;) כביקורת שלילית. לגדול חיידקים על צלחות TSA בתוספת 5% דם כבשים (צלחות אגר דם) למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2. הערה: הכן חומרים כימיים ולהרכיב חומרים כפי שמתואר בטבלת חומרים וציוד. ריכוזים סופיים לכל מגיב רשום בסוגריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד חיידקים מהצלחת באמצעות המוליך כותנה שקצה סטרילי ולחסן לתוך מרק ברוצלה שונה שהוכן ממרכיבים (ראה חומרים וציוד בלוח) והשלים עם כולסטרול. דגירה תרבויות הלילה בשעה 37° C באוויר חדר בתוספת 5% CO 2 עם רועד ב200 סיבובים לדקה (סל&quot;ד). הערה: כולסטרול משמש במקום של סרום שור עוברי בשל העובדה שהסרום הוא מורכב; המכיל מספר רב של מקורות ברזל תזונתי כגון heme הגורם לשונות בתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום culturing חיידקים, זרע תאי האפיתל של הקיבה אנושי AGS (ATCC CRL-1739) על coverslips טופל poly-D- ליזין ב12 גם צלחות (כ 1 x 10 5 תאים לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לדלל תרבויות חיידקים לOD600 של 0.3 במרק ברוצלה שונה לבד או בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3, dipyridyl 200 מיקרומטר (chelator ברזל סינטטי), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3. דגירה תרבויות אלה במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס באוויר חדר בתוספת 5% CO 2 עם הרועד בסל&quot;ד 200. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיידקי צנטריפוגה XG ב 1000 לאיסוף תאים ולהסיר supernatants לפני resuspending אניn נפח שווה של מרק ברוצלה שונה טרי בתוספת כולסטרול. מדד OD600 של התרבות (OD600 = 1.0 = 5.5 x 10 8 תאים / מיליליטר) ולהוסיף חיידקים לתאי האפיתל בריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 20: 1. לבצע דילולים סידוריים ותאי חיידקיים צלחת על גבי צלחות אגר דם כדי להעריך את כדאיות תא חיידק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה H. שיתוף תרבויות תאי האפיתל של הקיבה אנושי פילורי וAGS במשך 4 שעות על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2 בתנאים סטטיים לפני הביצוע במיקרוסקופ אלקטרונים סורק הכנת מדגם (SEM). </li></ol> 2. SEM לדוגמא הכנה לדמיין H. פילורי CAG-T4SS פילי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר H. פילורי ושיתוף תרבויות AGS מsupernatant תרבות חממה ולמזוג (למעט IL-8 ELISA). לשטוף בעדינות שלוש פעמים עם 0.05 חיץ M נתרן cacodylate (pH 7.4). תקן את הדגימות ל2-4 שעות בטמפרטורת חדר בתמיסה של paraformaldehyde 2.0%, 2.5gluteraldehyde%, וחיץ cacodylate 0.05 M נתרן. לאחר קיבוע ראשוני, לשטוף דגימות שלוש פעמים עם חיץ cacodylate 0.05 M נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע קיבעון המשני באמצעות 0.1% tetroxide אוסמיום ב0.05 חיץ cacodylate M נתרן בשני 10 ברצף צעדי קיבעון דקות. לאחר קיבוע המשני, לשטוף דגימות שלוש פעמים עם חיץ cacodylate 0.05 M נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע ראשוני והמשני, ליבש דגימות על ידי שטיפה רציפה עם ריכוזים גוברים של אתנול לפי טבלת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התייבשות אתנול, לבצע שלושה שוטף רציף של נוזל פחמן דו חמצני. דגימות ואז יבשות בנקודה קריטית באמצעות מכונה מייבש נקודה קריטית בטמפרטורה של 31.1 ºC ולחץ של 1073 PSI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר coverslips על ספחי מדגם האלומיניום SEM ולצייר עם קו דק של מי כסף בקצה המדגם כדי להשיג הארקה מתאימה ולהימנע מלחייב במהלך ההדמיה SEM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות מעיל עם 5 ננומטר שלזהב-פלדיום באמצעות מכונה מעיל גמגום להגדיל מדגם אותות משני אלקטרונים ואפקט קצה. </li></ol> 3. פרמטרי הדמיה לניתוחים ברזולוציה הגבוה SEM <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בדוגמאות עם אקדח מיקרוסקופ סורק אלקטרוני פליטת שדה (FEG-SEM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה במצב ואקום גבוה במרחק עבודה של 5-10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המתח המאיץ עד 5 קילו וולט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את גודל מקום ל2-2.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את המדגם בין 15-25 מעלות כדי להשיג ראייה טובה יותר של ממשק המאכסן לפתוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתעדף הדמיה חיידקים חסיד לקצוות של תאי האפיתל לצפייה הגדלה גבוהה, כתחומים של אינטראקציה המאכסן לפתוגן אלה מועשרים לחיידקים יוצרי פילים. </li></ol> 4. ניתוח סטטיסטי כדי להעריך את הפילים Quantifications <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח H. פילי CAG-T4SS פילורי באמצעות תוכנת ImageJ לכמת מספר פילים / תא, כמו גם אחוז של תאים המציגים piliated Phenotype בהתאם להנחיות למטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי מיקרוסקופ פתוחים בתוכנת ImageJ. לזהות פילים כמבנים שנוצרו בין תא החיידק והתא מארח, עם רוחב אחיד (10-13 ננומטר) ואורך (60-150 ננומטר). הערה: מבנה pilus קיים בזני חיידקי WT, אבל נעדרו בזני isogenic כגון זנים מוטנטים כלוב Δ, שנמל איון בגן המקודד את ATPase המרכזי שהרכבת pilus הפרשת IV סוג סמכויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כייל את כלי המדידה על ידי ציור קו עם כלי הקו הישר ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסייה &quot;נתח&quot;. בחר &quot;סולם הגדר&quot; מהתפריט הנפתח והזן את הערך בר הגדלה לתוך התיבה &quot;מרחק ידוע&quot; שכותרתו ולהגדיר את יחידת האורך להגדרה המתאימה (ננומטר). לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד פילי CAG-T4SS שימוש באפשרות הקו הישר לצייר על האורך או הרוחב של pilus ולאחר מכן לחץ על &quot;Ctrl-M&quot; למדוד כל pilus. שים לב תיבה דו-שיח עם הערכים שנמדדו. רשום את הערכים הללו או להעתיק ולהדביק לתוך תכנית גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באורך ורוחב פרמטרים שנקבעו בעבר 24 תכונות התעלמות, שאינו מתאימות לפרופיל של CAG-T4SS. ואז לכמת את מספר הפילים המבוססים על ערכים הנמצאים בהפסקות 10-13 ננומטר רוחב ו60-150 ננומטר אורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הכימות של פילים סטטיסטיים על ידי מבחן t של סטודנט שני זנב באמצעות תוכנת GraphPad פריזמה. </li></ol> 5. אופציונלית: הערכה של IL-8 ההפרשה במיתאם עם Pilus הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות supernatants משלב 2.1, לבצע ELISA IL-8 לפי הוראות יצרן עם הערכה (ראה חומרים וציוד בלוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את IL-8 מופרש על ידי תאי מארח ולחשב את האינדוקציה IL-8 אחוזים ביחס לWT PMSS1 גדלו במדיום לבד. ביצוע ניתוחים סטטיסטיים באמצעות מבחן t של סטודנט שני זנב באמצעות GraphPad פריזמה כךftware. </li></ol>

<ol>
	<li>Cover, T. L., Blaser, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+in+health+and+disease.">Helicobacter pylori in health and disease.</a> Gastroenterology. (6), 1863-1873 (2009).</li><li>Sycuro, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptidoglycan+crosslinking+relaxation+promotes+Helicobacter+pylori's+helical+shape+and+stomach+colonization.">Peptidoglycan crosslinking relaxation promotes Helicobacter pylori's helical shape and stomach colonization.</a> Cell. 141 (5), 822-833 (2010).</li><li>Kodaman, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+and+Helicobacter+pylori+coevolution+shapes+the+risk+of+gastric+disease.">Human and Helicobacter pylori coevolution shapes the risk of gastric disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (4), 1455-1460 (2014).</li><li>Tegtmeyer, N., Wessler, S., Backert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+cag-pathogenicity+island+encoded+type+IV+secretion+system+in+Helicobacter+pylori+pathogenesis.">Role of the cag-pathogenicity island encoded type IV secretion system in Helicobacter pylori pathogenesis.</a> FEBS J. 278 (8), 1190-1202 (2011).</li><li>Fischer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+molecular+mode+of+action+of+the+Helicobacter+pylori+Cag+type+IV+secretion+apparatus.">Assembly and molecular mode of action of the Helicobacter pylori Cag type IV secretion apparatus.</a> FEBS J. 278 (8), 1203-1212 (2011).</li><li>Odenbreit, S., Puls, J., Sedlmaier, B., Gerland, E., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Helicobacter+pylori+CagA+into+gastric+epithelial+cells+by+type+IV+secretion.">Translocation of Helicobacter pylori CagA into gastric epithelial cells by type IV secretion.</a> Science. 287 (5457), 1497-1500 (2000).</li><li>Bourzac, K., Guillemin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-host+cell+interactions+mediated+by+type+IV+secretion.">Helicobacter pylori-host cell interactions mediated by type IV secretion.</a> Cell Microbiol. 7 (7), 911-919 (2005).</li><li>Bronte-Tinkew, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+cytoxin-associated+gene+A+activates+the+signal+transducer+and+activator+of+transcription+3+pathway+in+vitro+and+in+vivo.">Helicobacter pylori cytoxin-associated gene A activates the signal transducer and activator of transcription 3 pathway in vitro and in vivo.</a> Cancer Res. 69 (2), 632-639 (2009).</li><li>Johnson, E. M., Gaddy, J. A., Cover, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+Helicobacter+pylori+triggered+by+contact+with+gastric+epithelial+cells.">Alterations in Helicobacter pylori triggered by contact with gastric epithelial cells.</a> Front. Cell. Infect. Microbiol. (2), 17 (2012).</li><li>Rohde, M., Puls, J., Buhrdorf, R., Fischer, W., Haas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+sheathed+surface+organelle+of+the+Helicobacter+pylori+cag+type+IV+secretion+system.">A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system.</a> Mol. Microbiol. 49 (1), 219-234 (2003).</li><li>Cover, T. L., Peek, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet,+microbial+virulence+and+Helicobacter+pylori+induced+gastric+cancer.">Diet, microbial virulence and Helicobacter pylori induced gastric cancer.</a> Gut Microbes. 4 (6), 482-493 (2013).</li><li>Queiroz, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+gastric+IL-1&#946;+concentration+and+iron+deficiency+parameters+in+Helicobacter+pylori+infected+children.">Increased gastric IL-1&#946; concentration and iron deficiency parameters in Helicobacter pylori infected children.</a> PLoS One. 8 (2), 57420 (2013).</li><li>Harris, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-associated+hypochlorhydria+and+development+of+iron+deficiency.">Helicobacter pylori-associated hypochlorhydria and development of iron deficiency.</a> J. Clin. Pathol. 66 (4), 343-347 (2013).</li><li>Noto, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+deficiency+accelerates+Helicobacter+pylori-induced+carcinogenesis+in+rodents+and+humans.">Iron deficiency accelerates Helicobacter pylori-induced carcinogenesis in rodents and humans.</a> J. Clin. Invest. 123 (1), 479-492 (2013).</li><li>Tan, S., Noto, J. M., Romero-Gallo, J., Peek, R. M., Amieva, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+perturbs+iron+trafficking+in+the+epithelium+to+grow+on+the+cell+surface.">Helicobacter pylori perturbs iron trafficking in the epithelium to grow on the cell surface.</a> PLoS Pathog. 7 (5), (2011).</li><li>Danielli, A., Roncarati, D., Delany, I., Chiarini, V., Rappouli, R., Scarlato, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dissection+of+the+Helicobacter+pylori+Fur+regulatory+circuit+by+genome-wide+location+analysis.">In vivo dissection of the Helicobacter pylori Fur regulatory circuit by genome-wide location analysis.</a> J. Bacteriol. 188 (13), 4654-4662 (2006).</li><li>Pich, O. Q., Carpenter, B. M., Gilbreath, J. J., Merrell, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+analysis+of+Helicobacter+pylori+Fur-regulated+promoters+reveals+a+Fur+box+core+sequence+and+novel+Fur-regulated+genes.">Detailed analysis of Helicobacter pylori Fur-regulated promoters reveals a Fur box core sequence and novel Fur-regulated genes.</a> Mol. Microbiol. 84 (5), 921-941 (2012).</li><li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Iron+in+infection+and+immunity.">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li><li>Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+in+urinary+tract+infection.">Host-pathogen interactions in urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7 (8), 430-441 (2010).</li><li>Brickman, T. J., Cummings, C. A., Liew, S. Y., Relman, D. A., Armstrong, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+the+iron+starvation+response+in+Bordatella+pertussis+provides+new+insights+into+siderophore+utilization+and+virulence+gene+expression.">Transcriptional profiling of the iron starvation response in Bordatella pertussis provides new insights into siderophore utilization and virulence gene expression.</a> J. Bacteriol. 193 (18), 4798-4812 (2011).</li><li>Mobley, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+factors+associated+with+disease+development.">Helicobacter pylori factors associated with disease development.</a> Gastroenterology. 113 (6), 21-28 (1997).</li><li>Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+requirements+and+antibiotic+resistance+patterns+of+Helicobacter+species+in+chemically+defined.">Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined.</a> J. Clin. Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).</li><li>Senkovich, O., Ceaser, S., McGee, D. J., Testerman, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+host+iron+utilization+mechanisms+of+Helicobacter+pylori+revealed+with+iron-deficient+chemically+defined+media.">Unique host iron utilization mechanisms of Helicobacter pylori revealed with iron-deficient chemically defined media.</a> Infect. Immun. 78 (5), 1841-1849 (2010).</li><li>Shaffer, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+exploits+a+unique+repertoire+of+type+IV+secretion+system+components+for+pilus+assembly+at+the+bacteria-host+cell+interface.">Helicobacter pylori exploits a unique repertoire of type IV secretion system components for pilus assembly at the bacteria-host cell interface.</a> PLoS Pathog. 7 (9), (2011).</li><li>Barrozo, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+plasticity+in+the+type+IV+secretion+system+of+Helicobacter+pylori.">Functional plasticity in the type IV secretion system of Helicobacter pylori.</a> PLoS Pathog. 9 (2), (2013).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

ברזל הוא יסודות קורט חיוני עבור רוב צורות חיים, כוללים חיידקים פתוגנים. במאמץ להגביל את יכולת הקיום של פלישת מיקרואורגניזמים, מארחי חוליות לעקל ברזל מזין בתהליך המכונה &quot;חסינות תזונתית&quot; 18. בתגובה לכך, חיידקים פתוגנים התפתחו להשתמש בברזל כמולקולת איתות גלובלית לחוש את סביבתם ולהסדיר את הפיתוח של תכונות ארסיות כגון מערכות רכישת ברזל, רעלים, ומכונות הפרשת רעלן 19,20. הליקובקטר פילורי דורש חומרים מזינים כגון ברזל, אבץ, מגנזיום ולגדול 22 ויכול להשתמש במקורות ברזל חלופיים כגון heme, המוגלובין, transferrin, ולקטופרין 23. ח פילורי, כמו רוב פתוגנים מוצלחים, התפתח רפרטואר רחב של גורמים ארסי כדי לסייע לה לחטט ברזל חומרי הזנה מהמארח 21. גורם אחד ארסי, cagA, molecu מפעילle של CAG-T4SS, מעורב בלנתב מחדש את transferrin מהצד basolateral של תאים מקוטבים למשטח הפסגה שבו ניתן להשתמש בו בקלות על ידי תאי החיידקים כמקור ברזל תזונתי ולקדם שכפול 15. כך, נראה אסטרטגיה אבולוציונית אינטואיטיבי כדי לקדם את הפרשת cagA בתנאים של זמינות הנמוכה של ברזל. ח פילורי CAG-T4SS הוא אברון חיידקים חשוב, בשל תגובות תא מארח מעודדי דלקת זה מעורר. ההשפעות של CAG-T4SS נחקרו היטב בשני שיתוף תרבויות ומודלים של בעלי חיים לזיהום. עם זאת, מחקרים של המבנה והרכב macromolecular של מערכת הפרשת רעלן זה כבר התעכבו בשל חוסר פרוטוקולי הדמיה ברזולוציה גבוהה. הדיווחים לומדים CAG-T4SS שפורסמו בעבר שלנו דיווחו על ממוצע של ארבעה פילי CAG-T4SS לתא חיידק על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים ברזולוציה גבוהה ניתוחי 24. השיטה המשופרת שלנו מספקתטכניקת הדמיה חזקה כדי להמחיש את CAG-T4SS באמצעות טכניקת תרבות שמקדמת את הייצור של תכונה זו על פני השטח של תא החיידק. יישום של שיטות לתרבות בשיתוף עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק ברזולוציה גבוהה פליטת שדה אקדח הוא קריטי לפרוטוקול הדמיה זו. העשרה כפולה של תכונת משטח CAG-T4SS היא עלייה משמעותית עבור חוקרים מעוניינים בביצוע immunohistochemical ניתוחים כגון טכניקות immunofluorescence או immunoprecipitation לאפיין את המיקום או הרכב subcellular של CAG-T4SS נוספת. ברגע שההדמיה מיקרוסקופי אלקטרונים ברזולוציה הגבוהה של CAG-T4SS כבר שולטת, אפשר גם לפתח יישומים אחרים, כגון immunogold תיוג, כדי לקבוע את המיקום של חלבונים חיידקיים ביחס לpilus CAG-T4SS 25. מגבלה אחת של הטכניקה שלנו היא העובדה שהחוקר עדיין מוגבל לusing מערכת שיתוף תרבות להדמיה של CAG-T4SS. בשדה אחד, רק קבוצת משנה של ה &#39; פילורי בתנאי תרבות נורמלים ליצור מבנים אלה (כ 50-70 אחוז, ראה איור 3 לוח ב &#39;). רבים כל כך תאים בשדה יהיו-piliated שאינם. לא ידוע מדוע אוכלוסיות אלה קיימים באותו המקום, אבל תאים אלה תמיד היוו בתוך שני quantifications של פילים / תא ואחוז התאים עם פילים על פני השטח. בגלל CAG-T4SS נצפה רק בממשק המארח בקטריאלי, צעדי הקיבעון הראשוניים ומשניים בתוך הכנת מדגם SEM הם קריטיים לשמירה על שני מבנים חלבוניים והקרומים של התאים אוקריוטים ופרוקריוטים. עם זאת, קיבעון על יכול להתרחש אם צעדי קיבעון מתבצעים יותר ממתואר, או אם הפתרונות לא מוכנים טרי. אם קיבעון היתר מתרחש, דגימות תהיה הופעה סלעית כאשר צפו תחת SEM וCAG-T4SS יהיה רעול פנים על ידי זה. לtroubleshoot, לחזור על הכנת מדגם SEM באמצעות fixatives פחות מרוכז ו / או פחות זמן טופח על ידי הנוכחות של המקבע. מערכת שיתוף התרבות גם הופכת אפיון ביוכימי (כמו ספקטרומטר מסה מנתח) מסורבל בגלל הזיהום של כמויות גדולות של חלבוני מארח. עם זאת, הבנת המנגנונים המולקולריים המסדירים את הייצור של מערכת הפרשת חיידקים זה יכול להביא בסופו הטכניקות חדשות שתפעיל היווצרות pilus CAG-T4SS בהעדר תאי מארח. זה ישפר מאוד את טכניקות בידוד וטיהור למבחני ביוכימיים. לסיכום, אנו מדווחים כי תנאים של תוצאת זמינות ברזל מוגבלת בייצור מוגבר של ח פילורי CAG-T4SS שניתן דמיין ידי טכניקות במיקרוסקופ אלקטרונים סורקים ברזולוציה גבוהה. גם אנו מדווחים על דיכוי הברזל תלוי של תכונת פני השטח זה בinterfa המאכסן לפתוגןce. assay זה עשוי להיות מותאם ומנוצל לחיידקים פתוגנים רב היוצרות רעלן-הפרשות-מוסדר ברזל, והוא החלים רחב למגוון של אינטראקציות מארח חיידק.

H. pylori infection is a significant risk factor for gastric cancer1. However, disease outcomes vary and depend on numerous factors such as host genetics, genetic diversity of H. pylori strains, and environmental elements such as host diet11. Previous reports have established that a correlation exists between H. pylori infection, iron deficiency (as measured by decreased blood ferritin and hemoglobin concentrations), and increased proinflammatory cytokine production, including IL-8 secretion, which ultimately leads to increased gastric disease progression12. Acute H. pylori infection is also associated with hypochlorhydria which impairs the host&#8217;s ability to absorb nutrient iron, and ultimately leads to changes in iron homeostasis13. These clinical findings suggest that iron availability within the gastic niche could be an important factor in disease outcome. In fact, animal models of H. pylori infection have demonstrated that low dietary iron consumption exacerbates gastric disease14. The reduced iron levels in these animals necessitate that H. pylori induce an iron-acquisition response in order to obtain the iron needed for bacterial replication. H. pylori has the capacity to perturb iron trafficking within host cells to facilitate bacterial replication in a CagA-dependent fashion15. Interestingly, the cag-pathogenicity island has been shown to be regulated by the iron-responsive transcription factor Fur16,17. Furthermore, Cag+ strains are associated with increased inflammation and gastric diseases such as cancer1. These findings support a model whereby H. pylori alters Cag-T4SS expression in an effort to obtain iron from host cells that reside in an iron deplete environment resulting in exacerbated disease outcomes. 
Two factors that increase inflammation and morbidity are Cag expression and low dietary iron intake. These facts support the hypothesis that reduced iron availability increases the production of Cag-T4SS pili at the host pathogen interface resulting in worse gastric disease11-14. The goal of the method provided in this manuscript is to establish the role of the micronutrient iron in the regulation of the Cag-T4SS pilus biogenesis. In previous work, we utilized two approaches to observe an iron-dependent increase in Cag-T4SS expression. First, output strains from animals maintained on high and low iron diets were analyzed and revealed that low-iron diet output strains produced more Cag-T4SS pili than high-iron diet strains14. Second, growing the H. pylori 7.13 strain in vitro in iron replete conditions resulted in reduced pili formation while cells grown in the presence of an iron chelator produced significantly more pili. 
We have continued to investigate the iron-dependent regulation of Cag-T4SS pili phenotype and offer the following optimized protocol and representative results performed with an additional Helicobacter pylori strain, PMSS1. The rationale behind the development of this technique was to correlate increased Cag-T4SS activity in conditions of iron-limitation with increased Cag-T4SS pilus formation. The broader implication and use of this technique will provide optimized culture conditions that result in elevated production of the Cag-T4SS pili. This assay will be useful to researchers seeking to determine the composition and architecture of the Cag-T4SS by enriching for this important bacterial surface feature. The sample preparation and visualization by field-emission gun electron microscopy has numerous advantages over alternative techniques such as light-microscopy methods to visualize the Cag-T4SS and will be appropriate to investigators interested in studying the regulation of this organelle10.

<table><tbody><tr><td>Modified brucella broth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peptone from casein (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70172</td><td></td></tr><tr><td>Peptic digest of animal tissue (10 g/L)</td><td>Sigma</td><td>70174</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract (2 g/L)</td><td>Sigma</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>Dextrose (1 g/L)</td><td>Sigma</td><td>D9434</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (5 g/L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol (250X) (4 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>12531018</td><td></td></tr><tr><td>Ferric chloride (100 or 250 uM)</td><td>Sigma</td><td>157740-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dipyridyl (200 uM)</td><td>Sigma</td><td>D216305-100G</td><td></td></tr><tr><td>Modified RPMI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI+HEPES (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>22400-121</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (100 ml/L)</td><td>Life Technologies</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscopy Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (2.0% aqueous)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713</td><td></td></tr><tr><td>Gluteraldehyde (2.5% aqueous)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>16220</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cacodylate (0.05 M)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12300</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide (0.1% aqueous)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (absolute)</td><td>Sigma</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Colloidal silver paint</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>SEM sample stubs</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75220</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-774-383</td><td></td></tr><tr><td>IL-8 Secretion Evaluation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantikine IL-8 ELISA kit</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>D8000C</td><td></td></tr></tbody></table>

high resolution electron microscopy of the helicobacter pylori cag type iv secretion system pili produced in varying conditions of iron availability

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2. H. pylori is the primary cause of gastric cancer, the second leading cause of cancer-related deaths worldwide3. One virulence factor that has been associated with increased risk of gastric disease is the Cag-pathogenicity island, a 40-kb region within the chromosome of H. pylori that encodes a type IV secretion system and the cognate effector molecule, CagA4,5. The Cag-T4SS is responsible for translocating CagA and peptidoglycan into host epithelial cells5,6. The activity of the Cag-T4SS results in numerous changes in host cell biology including upregulation of cytokine expression, activation of proinflammatory pathways, cytoskeletal remodeling, and induction of oncogenic cell-signaling networks5-8. The Cag-T4SS is a macromolecular machine comprised of sub-assembly components spanning the inner and outer membrane and extending outward from the cell into the extracellular space. The extracellular portion of the Cag-T4SS is referred to as the &#8220;pilus&#8221;5. Numerous studies have demonstrated that the Cag-T4SS pili are formed at the host-pathogen interface9,10. However, the environmental features that regulate the biogenesis of this important organelle remain largely obscure. Recently, we reported that conditions of low iron availability increased the Cag-T4SS activity and pilus biogenesis. Here we present an optimized protocol to grow H. pylori in varying conditions of iron availability prior to co-culture with human gastric epithelial cells. Further, we present the comprehensive protocol for visualization of the hyper-piliated phenotype exhibited in iron restricted conditions by high resolution scanning electron microscopy analyses.

בדוח זה, אנחנו הוכחנו כי יש להם תנאים משתנים זמינות ברזל היכולת לווסת את ה biogenesis pilus פילורי CAG-T4SS בממשק שהפתוגן המארח. כאשר בתרבית בינונית בלבד, ח &#39; פילורי מהווה ממוצע של 3 פילים / תא. כאשר ה &#39; פילורי הוא גדל בברזל לרוקן את תנאים (באמצעות dipyridyl chelator הסינתטי), כי הם תת-מעכבים להתפתחות חיידקים (איור 1), החיידקים לייצר CAG-T4SS רב פילים (~ 7 פילים / תא) כאשר שיתוף תרבותי עם תאי קיבה אנושיים (איור 2). לעומת זאת, כאשר מקור אקסוגני של ברזל תזונתי קיים, ההיווצרות של פילי CAG-T4SS מודחקת (pilus פחות מ 1 / תא במדגם FE, pilus פחות מ 1 / תא במדגם מח&quot;ש FE +) (איור 2). כימות של הפילים בממשק שהמאכסן לפתוגן, עולה כי בתנאים של הגבלת ברזל, ח &#39; פילורי מציג גידול של פי 2 בCAG-T4SS פילים (p &lt;0.000<html> 1) ועליות תאי אחוזים piliated ב -11% (p &lt;0.05) בהשוואה לתאים שגודלו במדיום בלבד (איור 3). מעניין לציין, הפעילות של CAG-T4SS, כפי שנמדדו על ידי מארח הפרשת IL-8, היא משופרת 107% בתנאים של הגבלת ברזל ומודחק 49% בתנאים של זמינות עודפת ברזל בהשוואה לבינוני בלבד (p = 0.03, וp &lt; 0.001, בהתאמה) תוצאה שתומכת בנתוני SEM. עם זאת, ממדי פילים להישאר עקביים בין כל התנאים של זמינות ברזל (איור 4). יתר על כן, זמינות ברזל אינה משנה את biogenesis של פילים על פני השטח של מוטציה כלוב, וגם לא לשנות את היכולת של נגזר isogenic זה כדי לגרום לתגובת IL-8 מתאי מארח, התומך בהשערה כי המבנים הפגינו הם, למעשה, CAG-T4SS ולא תכונת פני השטח נוספת שאינה קשורה. n &quot;src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52,122 / &quot;width =&quot; 52122fig1highres.jpg 500 &quot;/&gt; איור 1:. כדאיות בקטריאלי שנקבעה בתנאים שונים של זמינות ברזל H. פילורי היה בתרבית במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בתוספת של 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח&quot;ש), או dipyridyl 200 מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 (מח&quot;ש FE +). חיידקים בדילול סדרתי ומצופים על מדיום בקטריולוגית לפני דגירה עבור 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס בנוכחות של 5% CO 2. מושבות נספרו והמושבה להרכיב יחידות / מ&quot;ל ​​(CFU / ml) חושבה. ברים לציין ממוצעים של שלושה ניסויים בלתי תלויים +/- SEM. טיפול במח&quot;ש, FE, או FE + מח&quot;ש אינו משנה באופן משמעותי את הכדאיות בקטריאלי. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52122/52122fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2: r הגבוהבמיקרוסקופ אלקטרונים סורק esolution ניתוחים של H. פילי פילורי CAG-T4SS. חיידקים גודלו ב) בינוני לבד, B) בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3, בינוני ג) בתוספת 200 dipyridyl מיקרומטר, או D) בינוני בתוספת 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 לפני התרבות המשותפת עם אדם AGS תאי קיבה. חצים מצביעים על פילי CAG-T4SS נוצרו בממשק המאכסן לפתוגן. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה כדי להעריך biogenesis CAG-T4SS. תנאים של זמינות ברזל נמוכה להגדיל את השכיחות של היווצרות pilus CAG-T4SS, בעוד תנאים של ברזל תזונתי זמין עודף לדכא היווצרות pilus CAG-T4SS. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52122/52122fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: כימות פילים / תא ואחוזים piliated תאים בתרבית בשונהתנאים של זמינות ברזל. חיידקים גדלו במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח&quot;ש), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 (מח&quot;ש FE +) לפני שיתוף תרבות עם תאי האפיתל בקיבה אנושיים. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה ופילים נפקדו באמצעות תוכנת ImageJ. ) Scatterplot של פילים לכל תא (* p &lt;0.0001 בהשוואה למדיום לבד) ו- B) אחוזים מתארים גרף עמודות של תאי piliated (* p &lt;0.05 בהשוואה לבינונית בלבד) נגזרים 60-112 תאים לכל תרבות מצב נגזר מ3 נפרד ניסויים ביולוגיים. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52122/52122fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4: ממדי Pilus נמדדו מהתאים בתרבית בתנאים שונים של זמינות ברזל. Bacteria גדלו במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח&quot;ש), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 (מח&quot;ש FE +) לפני שיתוף תרבות עם תאי האפיתל בקיבה אנושיים. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה וממדים פילים נמדדו באמצעות תוכנת ImageJ. ) רוחב Pilus הוא ממוצע של 13.1 +/- 2.4 ננומטר בין כל התנאים. B) אורך Pilus הוא ממוצע של 75.8 +/- 16.0 ננומטר בין כל התנאים. לא נמצא הבדל משמעותי בממדי pilus נראה בתנאים השונים של זמינות ברזל. איור נוסף 1: מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה ניתוחים של H. המוטציה פילורי כלוב בתנאים שונים של זמינות ברזל. חיידקים גודלו במדיום) בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3, B) בינוני בתוספת dipyridyl מיקרומטר 200 (Dבינוני IP) או C) בתוספת dipyridyl 200 מיקרומטר (מח&quot;ש) בתוספת 250 מיקרומטר FeCl 3 לתרבות משותפת קודמת עם תאי קיבה אנושיים AGS. דגימות נותחו על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הסורקים ברזולוציה גבוהה כדי להעריך biogenesis CAG-T4SS. תנאים של ברזל נמוך או גבוה לא לווסת כל biogenesis pilus CAG-עצמאי, התומך בהשערה כי המבנים דמיינו באיור 2 הם פילי CAG-T4SS. איור נוסף 2: ניתוח ELISA של מארח הפרשת IL-8 בתגובה לחיידקים גדלו במשתנים תנאים של זמינות ברזל. Wild-type (פסים לבנים) או מוטציה כלוב (פסים אפורים) חיידקים גדלו במרק ברוצלה שונה לבד (בינוני לבד), או בינוני בתוספת 100 מיקרומטר FeCl 3 (FE), 200 dipyridyl מיקרומטר (מח&quot;ש), או 200 dipyridyl מיקרומטר בתוספת 250 אום FeCl 3 (מח&quot;ש FE +) לתרבות המשותפת קודמת עם תאי האפיתל בקיבה אנושיים. תוצאות הגבלת ברזל בIL המוגבר-8, תגובת מארח שהוא תלוי בפעילות של החטיבה-T4SS. ברים לציין ממוצע +/- SEM, נגזר מ3 ניסויים ביולוגיים נפרדים. (* P &lt;0.05 בהשוואה לPMSS1 גדל במדיום לבד).

Watch this Scientific Journal Video about High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability at JoVE.c

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

Helicobacter pylori is a helical-shaped, gram negative bacterium that colonizes the human gastric niche of half of the human population1,2.  H. pylori is ...

high-resolution-electron-microscopy-helicobacter-pylori-cag-type-iv

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

15.0K Views.  Vanderbilt University School of Medicine. Here we describe a method to visualize the oncogenic bacterial organelle known as the Cag Type IV Secretion System (Cag-T4SS). We find that the Cag-T4SS is differentially produced on the surface of H. pylori in response to varying conditions of iron availability.

Video: High Resolution Electron Microscopy of the Helicobacter pylori Cag Type IV Secretion System Pili Produced in Varying Conditions of Iron Availability

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single particle electron cryo-microscopy (cryo-EM) data. The protocol presented here describes in detail how to obtain a near-atomic resolution structure starting from cryo-EM micrograph movies by guiding users through all steps of the single particle structure determination pipeline. These steps are controlled from the new SPHIRE graphical user interface and require minimum user intervention. Using this protocol, a 3.5 &#197; structure of TcdA1, a Tc toxin complex from Photorhabdus luminescens, was derived from only 9500 single particles. This streamlined approach will help novice users without extensive processing experience and a priori structural information, to obtain noise-free and unbiased atomic models of their purified macromolecular complexes in their native state.

This paper presents a protocol for processing cryo-EM images using the software suite SPHIRE. The present protocol can be applied for nearly all single particle EM projects that target near-atomic resolution.

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Biochemistry

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

הנדסת חיידקי חסיד ידי יצירת Curli אופרון סינטטי יחיד

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioengineering

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin sections of the specimen. Although preparing serial ultrathin sections is considered to be very difficult, it is rather easy if the proper method is used. In this paper, we show a step-by-step procedure for safely obtaining serial ultrathin sections of microorganisms. The key points of this method are: 1) to use the large part of the specimen and adjust the specimen surface and knife edge so that they are parallel to each other; 2) to cut serial sections in groups and avoid difficulty in separating sections using a pair of hair strands when retrieving a group of serial sections onto the slit grids; 3) to use a 'Section-holding loop' and avoid mixing up the order of the section groups; 4) to use a 'Water-surface-raising loop' and make sure the sections are positioned on the apex of the water and that they touch the grid first, in order to place them in the desired position on the grids; 5) to use the support film on an aluminum rack and make it easier to recover the sections on the grids and to avoid wrinkling of the support film; and 6) to use a staining tube and avoid accidentally breaking the support films with tweezers. This new method enables obtaining serial ultrathin sections without difficulty. The method makes it possible to analyze cell structures of microorganisms at high resolution in 3D, which cannot be achieved by using the automatic tape-collecting ultramicrotome method and serial block-face or focused ion beam scanning electron microscopy.

This study presents reliable and easy procedures for obtaining serial ultrathin sections of a microorganism without expensive equipment in transmission electron microscopy.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

Engineering

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

gingivalis Porphyromonas כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאי מארח

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

ויזואליזציה של תנועתיות מפרכסים אפיון תפקידו של<em&gt; PilG</em&gt; ב<em&gt; Fastidiosa Xylella</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ever-increasing share of published structural data. Recent advances in TEM technology and automation have boosted both the speed of data collection and quality of acquired images while simultaneously decreasing the required level of expertise for obtaining cryo-EM maps at sub-3 &#197; resolutions. While most of such high-resolution structures have been obtained using state-of-the-art 300 kV cryo-TEM systems, high-resolution structures can be also obtained with 200 kV cryo-TEM systems, especially when equipped with an energy filter. Additionally, automation of microscope alignments and data collection with real-time image quality assessment reduces system complexity and assures optimal microscope settings, resulting in increased yield of high-quality images and overall throughput of data collection. This protocol demonstrates the implementation of recent technological advances and automation features on a 200 kV cryo-transmission electron microscope and shows how to collect data for the reconstruction of 3D maps that are sufficient for de novo atomic model building. We focus on best practices, critical variables, and common issues that must be considered to enable the routine collection of such high-resolution cryo-EM datasets. Particularly the following essential topics are reviewed in detail: i) automation of microscope alignments, ii) selection of suitable areas for data acquisition, iii) optimal optical parameters for high-quality, high-throughput data collection, iv) energy filter tuning for zero-loss imaging, and v) data management and quality assessment. Application of the best practices and improvement of achievable resolution using an energy filter will be demonstrated on the example of apo-ferritin that was reconstructed to 1.6 &#197;, and Thermoplasma acidophilum 20S proteasome reconstructed to 2.1-&#197; resolution using a 200 kV TEM equipped with an energy filter and a direct electron detector.

High-resolution cryo-EM maps of macromolecules can be also achieved by using 200 kV TEM microscopes. This protocol shows the best practices for setting accurate optics alignments, data acquisition schemes, and selection of imaging areas that are all essential for the successful collection of high-resolution datasets using a 200 kV TEM.

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in humans. Several mouse models of gastric Helicobacter infection have been developed to study the molecular and cellular mechanisms whereby H. pylori bacteria colonize the stomach of human hosts and cause disease. Herein, we describe protocols to: 1) prepare bacterial suspensions for the in vivo infection of mice via intragastric gavage; 2) determine bacterial colonization levels in mouse gastric tissues, by polymerase chain reaction (PCR) and viable counting; and 3) assess pathological changes, by histology. To establish Helicobacter infection in mice, specific pathogen-free (SPF) animals are first inoculated with suspensions (containing &#8805;105 colony-forming units, CFUs) of mouse-colonizing strains of either Helicobacter pylori or other gastric Helicobacter spp. from animals, such as Helicobacter felis. At the appropriate time-points post-infection, stomachs are excised and dissected sagittally into two equal tissue fragments, each comprising the antrum and body regions. One of these fragments is then used for either viable counting or DNA extraction, while the other is subjected to histological processing. Bacterial colonization and histopathological changes in the stomach may be assessed routinely in gastric tissue sections stained with Warthin-Starry, Giemsa or Haematoxylin and Eosin (H&#38;E) stains, as appropriate. Additional immunological analyses may also be undertaken by immunohistochemistry or immunofluorescence on mouse gastric tissue sections. The protocols described below are specifically designed to enable the assessment in mice of gastric pathologies resembling those in human-related H. pylori diseases, including inflammation, gland atrophy and lymphoid follicle formation. The inoculum preparation and intragastric gavage protocols may also be adapted to study the pathogenesis of other enteric human pathogens that colonize mice, such as Salmonella Typhimurium or Citrobacter rodentium.

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Mice represent an invaluable in vivo model to study infection and diseases caused by gastrointestinal microorganisms. Here, we describe the methods used to study bacterial colonization and histopathological changes in mouse models of Helicobacter pylori-related disease.

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

החלת הדמיית תאים בשידור חי וטומוגרפיה ממוחשבת כדי לפתור את התכונות הספאטימיות של הלגיונרים האלה מערכת הפרשות

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Impact of Helicobacter pylori Infection on Retina and Choroid Using SS-OCT

Retinal and Choroidal Thickness Changes in Populations with Helicobacter pylori Infection by Swept-Source Optical Coherence Tomography

Around half of the world&#39;s population is infected with Helicobacter pylori (H. pylori), which is closely related to several ocular diseases. The study aims to evaluate the retinal and choroidal thickness changes in subjects with H. pylori infection by swept-source optical coherence tomography (SS-OCT). The ophthalmic examination and 13C-urea breath test (13C-UBT) were performed on all subjects participating in the cross-sectional study. The participants were divided into H. pylori (+) and H. pylori (&#8722;) groups depending on the 13C-UBT results. This study covered 2574 right eyes from 2574 subjects with H. pylori infection and 2574 right eyes from 2574 age- and sex-matched individuals without H. pylori infection. Out of the nine sectors of the early treatment diabetic retinopathy study (ETDRS) grid, the maximum retinal thickness was in the inner superior sector, while the minimum was in the center sector. The maximum choroidal thickness was in the inner superior sector, while the minimum was in the outer nasal sector. The choroid of each area of the ETDRS subfield in the H. pylori (+) group was significantly thicker than that in the H. pylori (&#8722;) group, but retinal thickness did not show any difference between the two groups. Increased choroidal thickness may be an early indicator of H. pylori-associated retinal or choroidal diseases.

Here, we compared macular retinal and choroidal thickness in populations with and without Helicobacter pylori infection using a swept-source optical coherence tomography (SS-OCT) device, which is one of the recent milestones in the development of retinal and choroidal visualization.

Around half of the world&#39;s population is infected with Helicobacter pylori (H. pylori), which is closely related to several ocular diseases. The study ...

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video