אנו מודים איימי חן על עזרתה בהכנה לצילומי הווידאו ולהפגין את הטכניקה. עבודה זו שנערכה על ידי ENIGMA: מערכות אקולוגיות ורשתות משולבות עם גנים והרכבות מולקולריות (http://enigma.lbl.gov), תכנית אזור המוקד מדעי במעבדה הלאומית לורנס ברקלי, נתמכת על ידי משרד מדע, המשרד הביולוגי ו מחקר סביבתי, של משרד אנרגיה של ארה&quot;ב תחת חוזה מס &#39;DE-AC02-05CH11231.

<ol>
	<li>Galperin, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+structure+and+function+of+response+regulator+output+domains.">Diversity of structure and function of response regulator output domains.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 150-159 (2010).</li><li>Casino, P., Rubio, V., Marina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+signal+transduction+by+two-component+systems.">The mechanism of signal transduction by two-component systems.</a> Curr Opin Struct Biol. 20, 763-771 (2010).</li><li>Aparicio, O., Geisberg, J. V., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+for+determining+the+association+of+proteins+with+specific+genomic+sequences+in+vivo.">Chromatin immunoprecipitation for determining the association of proteins with specific genomic sequences in vivo.</a> Curr Protoc Cell Biol. 17 (17), (2004).</li><li>McCleary, W. R., Stock, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetyl+phosphate+and+the+activation+of+two-component+response+regulators.">Acetyl phosphate and the activation of two-component response regulators.</a> J Biol Chem. 269, 31567-31572 (1994).</li><li>Novichkov, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RegPrecise+web+services+interface:+programmatic+access+to+the+transcriptional+regulatory+interactions+in+bacteria+reconstructed+by+comparative+genomics.">RegPrecise web services interface: programmatic access to the transcriptional regulatory interactions in bacteria reconstructed by comparative genomics.</a> Nucleic Acids Res. 40, 604-608 (2012).</li><li>Studholme, D. J., Buck, M., Nixon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+potential+sigma(N)-dependent+promoters+in+bacterial+genomes.">Identification of potential sigma(N)-dependent promoters in bacterial genomes.</a> Microbiology. 146 (12), 3021-3023 (2000).</li><li>Rajeev, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+two+component+response+regulators+to+gene+targets+in+a+model+sulfate+reducing+bacterium.">Systematic mapping of two component response regulators to gene targets in a model sulfate reducing bacterium.</a> Genome Biol. 12, 99 (2011).</li><li>Crooks, G. E., Hon, G., Chandonia, J. M., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WebLogo:+a+sequence+logo+generator.">WebLogo: a sequence logo generator.</a> Genome Res. 14, 1188-1190 (2004).</li><li>Barbieri, C. M., Mack, T. R., Robinson, V. L., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+response+regulator+autophosphorylation+through+interdomain+contacts.">Regulation of response regulator autophosphorylation through interdomain contacts.</a> J Biol Chem. 285, 32325-32335 (2010).</li><li>Bourret, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receiver+domain+structure+and+function+in+response+regulator+proteins.">Receiver domain structure and function in response regulator proteins.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 142-149 (2010).</li><li>Gao, R., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+strategies+for+phosphorylation-mediated+regulation+of+response+regulator+activity.">Molecular strategies for phosphorylation-mediated regulation of response regulator activity.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 160-167 (2010).</li><li>Hung, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomerization+of+the+response+regulator+ComE+from+Streptococcus+mutans+is+affected+by+phosphorylation.">Oligomerization of the response regulator ComE from Streptococcus mutans is affected by phosphorylation.</a> J Bacteriol. 194, 1127-1135 (2012).</li><li>Ladds, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+regulator+Spo0A+from+Bacillus+subtilis+is+efficiently+phosphorylated+in+Escherichia+coli.">The response regulator Spo0A from Bacillus subtilis is efficiently phosphorylated in Escherichia coli.</a> FEMS Microbiol Lett. 223, 153-157 (2003).</li><li>Wen, Y., Feng, J., Scott, D. R., Marcus, E. A., Sachs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+HP0165-HP0166+two-component+system+in+expression+of+some+acidic-pH-upregulated+genes+of+Helicobacter+pylori.">Involvement of the HP0165-HP0166 two-component system in expression of some acidic-pH-upregulated genes of Helicobacter pylori.</a> J Bacteriol. 188, 1750-1761 (2006).</li><li>Liu, X., Noll, D. M., Lieb, J. D., Clarke, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIP-chip:+rapid+and+accurate+determination+of+DNA-binding+specificity.">DIP-chip: rapid and accurate determination of DNA-binding specificity.</a> Genome Res. 15, 421-427 (2005).</li><li>Gossett, A. J., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Immunoprecipitation+(DIP)+for+the+Determination+of+DNA-Binding+Specificity.">DNA Immunoprecipitation (DIP) for the Determination of DNA-Binding Specificity.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Mascher, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Streptococcus+pneumoniae+cia+regulon:+CiaR+target+sites+and+transcription+profile+analysis.">The Streptococcus pneumoniae cia regulon: CiaR target sites and transcription profile analysis.</a> J Bacteriol. 185, 60-70 (2003).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10, 669-680 (2009).</li><li>Lefrancois, P., Zheng, W., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-Seq+using+high-throughput+DNA+sequencing+for+genome-wide+identification+of+transcription+factor+binding+sites.">ChIP-Seq using high-throughput DNA sequencing for genome-wide identification of transcription factor binding sites.</a> Methods Enzymol. 470, 77-104 (2010).</li><li>Ho, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-chip+versus+ChIP-seq:+lessons+for+experimental+design+and+data+analysis.">ChIP-chip versus ChIP-seq: lessons for experimental design and data analysis.</a> BMC Genomics. 12, 134 (2011).</li><li>Liu, X., Lee, C. K., Granek, J. A., Clarke, N. D., Lieb, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+comparison+of+Leu3+binding+in+vitro+and+in+vivo+reveals+the+importance+of+nucleosome+occupancy+in+target+site+selection.">Whole-genome comparison of Leu3 binding in vitro and in vivo reveals the importance of nucleosome occupancy in target site selection.</a> Genome Res. 16, 1517-1528 (2006).</li></ol>

יש הסופרים שאין ניגוד עניינים לחשוף.

שיטת DAP-השבב שתוארה כאן הייתה הצלחה בשימוש כדי לקבוע את מטרות הגן במשך כמה RRs בDesulfovibrio vulgaris 7 Hildenborough של איזה מהם מוצג כאן כתוצאה נציג. לDVU3023 RR, בחירת יעד גן מועמד הייתה פשוטה. DVU3025 ממוקם מייד במורד הזרם של גן RR, וגני RR והיעד הם נשמרים בכמה מיני Desulfovibrio, ובנוסף יש DVU3025 אמרגן sigma54 תלוי חזה. EMSA מספק שיטה פשוטה לבדיקת מהירות RR לכריכה לגן יעד המועמד, וגם מאפשר ההערכה של הפעילות של מדגם החלבון מטוהר, כמו גם לקבוע תנאים המחייבים-DNA החלבון אופטימליים. הפעילות מחייבת DNA יכולה גם להיבדק בנוכחות והיעדרות של פוספט אצטיל כדי לראות אם זירחון הוא הכרחי עבור ה-DNA מחייבת. לא כל RRs הם phosphorylated על ידי תורמי מולקולה קטנים9, במקרים אלה קינאז החיישן מאותו המקור מטוהר, אם הוא זמין, ניתן להשתמש בו כדי להפעיל את החלבון. ישנם גם RRs טיפוסי ידוע כי חוסר שאריות אתר פעילים מרכזיות בתחום המקלט ואינם מופעל על ידי זירחון 10. עבור רוב RRs למד, זירחון מגרה-DNA מחייבת 11. עם זאת יש דוגמאות שבי זירחון אינו משפיע ב-DNA המבחנה מחייב 12, וגם יש דוגמאות שבי זירחון נדרש לכריכת 13, ומקרים שבם קבוצת המשנה של יזמים מחויבים עולה עם זירחון 14. שיטת DAP-השבב יכולה להתבצע עם ובלי זירחון כדי לקבוע אם יש הבדלים בקבוצה של יזמים מחויבים RR. עם זאת, ראוי גם לציין כי חלק RRs ניתן יהיה לטהר בצורה פונקציונלית פוספורילציה מE. coli 13. הפרוטוקול המתואר כאן הוא לprotei מתויג-n כך כי ה-DNA הנכנס החלבון היא הזיקה מטוהרת באמצעות שרף agarose Ni-נ.ת. ע, אבל זה יכול בקלות להיות מותאם לכל סוג של חלבון מתויג על ידי שימוש בשרף הזיקה המתאים לנפתח. בעקבות צעדי DAP-WGA, צעד qPCR מספק שליטה נוספת על מנת להבטיח כי התנאים מחייבים חלבון gDNA היו מתאימים וכי ה-DNA הנכנס החלבון מועשר בהצלחה על ידי טיהור הזיקה. העשרה גדולה יותר פי 3 היא מספיק כדי להמשיך לשלב ההכלאה. בניגוד לתגובת EMSA, אין DNA מתחרה שאינו ספציפי כמו פולי dI.dC הוסיף לgDNA מחייב תגובה מאחר והוא משבש את צעד WGA. בגלל זה אם מדגם החלבון יש פעילות מחייבת DNA שאינו ספציפית אז העשרה ברורה של ה-DNA היעד אישר לא נצפתה על ידי qPCR. לכן צעד שליטת qPCR ניתן להשתמש כדי לייעל את כמות החלבון המשמשת בתגובה המחייבת gDNA. ערכות זמינות מסחרי עבור ההגברה הגנום כולו טוענות לתנטרנהoduce אין הטיה הגברה כאשר בעקבות ההנחיות שלהם לחומר מינימאלי ההתחלה ה-DNA ומספר נמוך של מחזורי הגברה. ההטיה ההגברה ניתן לבדוק באמצעות qPCR עם ערכות פריימר שונות על מוגבר לעומת DNA לא מוגבר. כל השפעה על הכלאת מערך מורד הזרם יכולה להיות גם שנקבעה על ידי באופן דיפרנציאלי תיוג וההכלאה נקווה מוגברת ולא מוגבר הדנ&quot;א הגנומי. הרשימה של פסגות שנוצרו בעקבות ניתוח נתוני מערך היא בדרך כלל ארוכה עם כמה פסגות בשווי שיעור גילוי שווא של 0. לכן שילוב של תכונות שיא אחרות כגון גבוה יומן 2 ציוני R וערכי cutoff_p (כפי שנוצר על ידי ניתוח המערך תוכנה המשמשת במחקר זה) משמשות כדי לברור את הרשימה עד למטרות גן האמון הגבוהות ביותר. הנוכחות של יעד הגן נקבע מראש בין חמשת הלהיטים העליונים מאוד מחזקת את האמון בערכת נתונים. ביצוע assay זה עבור מספר החלבונים רגולטוריים לכאן ולכאןמ &#39;באותו אורגניזם גם יעזור לזהות רצפי DNA המופיעים בכמה נתונים &quot;דביקים&quot; קובע 7. בנוסף, אם מוטיב אתר קישור ניתן לחזות ומאומתים אז הנוכחות של המוטיב בפסגות נמוכה יותר למטה ברשימה עשויה לשמש גם לבחירת רשימת גן יעד שמרנית. העשרה של רצפי DNA אחרים מאשר אזורי אמרגן עשויה להיות חפצים של הכלאת מערך או עשוי להצביע על הסדרת מסגרות קריאה פתוחה מזוהות קודם לכן או RNA הקטן 7. לרגולטורים שבו יעד גן לא יכול להיות קבוע מראש באמצעות EMSA, assay DAP-השבב ניתן לבצע &quot;עיוור&quot; 7. במקרים כאלה גם, זיהוי מוטיב אתר קישור ישפר את הבחירה של מטרות גן. קביעת ריכוז החלבון כדי לשמש assay יהיה תלוי בפעילות מחייבת שאינו הספציפית של החלבון, אשר עשוי להיות מוערך על ידי EMSA באמצעות מצעי DNA שנבחרו באקראי. ריכוזים נמוכים יותר לעבוד טוב יותר עבור tחלבוני צינור עם פעילות ספציפי מחייב גבוה. האמינות של DAP-שבב עיוור ניתן לשפר על ידי ביצוע מבחני לשכפל עם ריכוזי חלבון שונים. לRRs עם כמה מטרות, רק שניים או אפילו assay אחד עשוי להיות מספיק כדי ליצור רשימת יעד שעשוי להיות מאומתת באמצעות EMSAs שלאחר מכן. נתוני DAP-השבב לRRs כאלה בדרך כלל להראות קפיצה בולטת בציוני יומן 2 R או ערכי cutoff_p מעבר לכמה פסגות הראשוניות. לRRs עם כמה מטרות, נתונים משלושה משכפל עשויים להיות מנותחים כדי ליצור רשימה של פסגות משותפות, שחלקם עשוי להיבחר לאימות EMSA. היכולת לחזות מוטיבים אתר קישור המבוססים על מטרות DAP-השבב מוסיפה לערך של שיטה זו ומגדיל בהרבה את המידע שנצבר. EMSA מספק שוב פרוטוקול יעיל כדי לוודא בניסוי את התחזיות. תסריטי תוכנה בפרל או שפת תכנות אחרת עשויים לשמש כדי לחפש במהירות הדרך seque גנום זמיןnces. התוצאות תהיה לזהות שני גנים orthologous היעד, כמו גם גנים המטרה מוסדרים באופן ייחודי בגנומים חיפשו. בתוצאת הנציג המוצגת כאן, שלוש מתוך ארבעת אזורי היעד במעלה הזרם המזוהים עבור DVU3023 לי מבוארות פונקציות גן הקשור לספיגה וחמצון חומצת החלב. בנוסף מאז מוטיב אתר הקישור לDVU3023 קבל תוקף, גנומים אחרים יכולים להיות חיפשו אתרי מוטיב דומים. יחד תוצאות המחקר מראים כי DVU3022-3023 TCS נשמרת היטב בDesulfovibrio והפחתת חיידקים-סולפט נלווים אחרים, וכי הוא מסדיר גנים להובלת חומצת החלב וחמצון ליצטטו. מאז חומצת החלב הוא מקור פחמן ואלקטרונים העיקרי בשימוש על ידי אורגניזמים אלה, DVU3023 סביר ממלא תפקיד מרכזי בפיסיולוגיה שלהם. בין פסגות DAP-השבב העליונה לRR DVU3023, היה גם אזור intergenic. למרות מוטיב אתר קישור לא נמצא באזור זה, הנוכחות של-54 תלויים סיגמא אמרגן חזה מרמזת tכובע ייתכנו ORF לא מזוהה או Srna מקודד, וכי היא יכולה להיות מטרה אמיתית לDVU3023. ממצא זה מדגיש את הערך של גישת DAP-שבב הניסוי בשילוב עם תחזיות אתר קישור בניגוד לקביעת אתרי יעד המבוססים על תחזיות חישובית לבד. שיטות דומות במבחנה כמו זה המתואר כאן, היו בשימוש רק בכמה מקרים 15-17 ולעתים רחוקות מאוד לרגולטור לא נחקר בעבר. אופטימיזציה EMSA וqPCR צעדים לפני הכלאת המערך יהיה משמעותי לסייע בניתוח התוצאות כאשר השיטה היא לשמש לרגולטור רומן. אם הדפסת מערך הופכת להיות מכשול, צעדי DAP עשויים להיות משולבים עם רצף הדור הבא כדי לקבל אתרי קישור 18,19. ככל שיותר שיטות המבוסס על מערך להיות מוחלפות עם אסטרטגיות רצף מבוססים, הסתגלות עתיד כזה של השיטה עוקפת את הצורך לעצב microarrays ריצוף המותאם אישית עבור organism של עניין. טכנולוגיות שבב Seq לגרום לרגישות רבה יותר וספציפיות של זיהוי של פסגות בהשוואה לשיטות שבב שבב, וגם הופכות להיות יותר 20 חסכוניים במהירות. למרות שמאמר זה התמקד בשני רגולטורים תגובת רכיב, שיטה זו יכולה לשמש לכל גורם שעתוק פרוקריוטים או אוקריוטים 15. לעתים קרובות יש תפוסות הנוקלאוזום השפעה על מטרות שמוסדרות ומשווה את יעד אתרי קישור לגורמי שעתוק אוקריוטים ידי in vivo ו במבחנה ניתוחים יכול לחשוף את ההשפעות הללו 21.

היכולת של חיידקים לשרוד ולשגשג תלויה באופן קריטי על כמה טוב הם מסוגלים לקלוט ולהגיב להפרעות בסביבתם, וזה בתורו הוא תלוי במערכות העברת אותותיהם. מספר מערכות אזעקת encodes חיידק כבר נקרא &quot;IQ של חיידקים&quot; שלה ויכול להיות אינדיקציה של שתי השתנות של סביבתו ואת יכולתו לחוש אותות מרובים ולכוונן את תגובתה 1. שתי מערכות רכיב אות התמרה (TCS) הן מערכות האיתות הנפוצות ביותר בשימוש על ידי חיידקים, והם מורכבים מקינאז היסטידין (HK) שחש את האות החיצונית ומעביר באמצעות זירחון לרגולטור תגובת מפעיל (RR) 2. RRs יכול להיות מגוון של תחומים פלט ומצבים שונים ובכך מפעיל, אבל התגובה הנפוצה ביותר היא תקנת תעתיק באמצעות DNA מחייב תחום 1. האותות חשו ופונקציות המקבילה vasלא רוב TCSs אינו ידוע. למרות in vivo שיטות כגון שבב שבב משמשות באופן שיגרתי לקביעת אתרי קישור הגנומי של שעתוק גורמי 3, הם יכולים לשמש רק לRRs שתי מערכת מרכיב חיידקים אם התנאים להפעלה או אותות ידועים. לעתים קרובות הרמזים הסביבתיים המפעילים TCS הם יותר קשים לקבוע ממטרות הגן שלהם. במבחנה microarray assay המבוסס המתואר כאן ניתן להשתמש ביעילות ובמהירות כדי לקבוע את מטרות הגן ולחזות פונקציות של TCSs. assay זה מנצל את העובדה שניתן phosphorylated RRs וכך הופעל במבחנה באמצעות תורמי מולקולה קטנים כמו פוספט אצטיל 4. בשיטה זו, בשם DAP-שבבים עבור ה-DNA זיקה מטוהר שבב (איור 1), גן RR של עניין הוא משובט עם התג שלו בE. coli, וטהר לאחר מכן חלבון מתויג מותר דוnd לטעון הדנ&quot;א הגנומי. ה-DNA חייב החלבון מועשר לאחר מכן על ידי זיקה לטיהור, ה-DNA המועשר וקלט הם מוגברות, שכותרתו fluorescently, אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף כי הוא עשה מותאם אישית לאורגניזם של עניין (איור 1). ניסויי microarray כפופים לחפצים, ולכן צעדים נוספים מועסקים כדי לייעל את assay. צעד אחד כזה הוא לנסות ולקבוע יעד אחד לRR תחת מחקר באמצעות מבחני משמרת ניידות electrophoretic (EMSA) (ראה זרימת עבודה באיור 2). לאחר מכן, בעקבות מחייב הדנ&quot;א הגנומי וצעדי DAP, ה-DNA חייב החלבון והקלט נבדקים על ידי qPCR כדי לראות אם היעד החיובי הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון ביחס לשבריר הקלט, ובכך אישרה תנאים אופטימליים מחייב עבור RR (איור 2). לאחר הכלאת מערך, הנתונים מנותחים למצוא פסגות של אות בעוצמה גבוהה המעידות על לוקוסים הגנומי שבו שעות החלבוןמודעה קשורה. פונקציות יכולות להיות חזויה עבור RR מבוסס על מטרות הגן שהושגו. הלוקוסים הגנומי היעד משמשים כדי לחזות מוטיבים אתר מחייב, אשר לאחר מכן בניסוי תוקף באמצעות EMSAs (איור 2). התחזיות פונקציונליות ומטרות גן לRR יכולים אז להיות מורחבות למינים קשורות באופן הדוק המקודדים RRs orthologous ידי סריקת הגנום אלה למוטיבים המחייבים דומים (איור 2). שיטת DAP-השבב יכולה לספק שפע של מידע לTCS בהם בעבר לא היה כלום. גם השיטה יכולה לשמש לכל רגולטור תעתיק אם החלבון יכול להיות מטוהרת וניתן לקבוע תנאים המחייבים DNA, ולכל אורגניזם של עניין עם רצף הגנום זמין. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. מטוהר-DNA-זיקת השבב (DAP-אסטרטגית שבב) 7. גן RR מהאורגניזם של עניין הוא משובט עם התג שלו carboxy-מסוף לE. זן ביטוי coli. חלבון שלו מתויג מטוהר מופעל על ידי זירחון עם פוספט אצטיל, ומעורבב עם הדנ&quot;א הגנומי טעון. Aliquot של התגובה מחייבת נשמר כDNA קלט, ואילו השאר הוא נתון לטיהור זיקה באמצעות שרף Ni-נ.ת. ע. הקלט ואת ה-DNA הנכנס RR הוא הגנום כולו מוגבר, ושכותרתו עם Cy3 וCy5, בהתאמה. ה-DNA שכותרתו היא אספו יחד והכלאה למגוון ריצוף, אשר לאחר מכן נותח על מנת לקבוע מטרות הגן. איור שונה והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מ7. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. סיכום של זרימת עבודה. לכל מטוהר protei מתויגn, להתחיל על ידי קביעת יעד באמצעות EMSA. אפשר לחלבון לקשור הדנ&quot;א הגנומי ולאחר מכן ה-DNA זיקה לטהר (DAP) והגנום כולו להגביר את ה-DNA והקלט המועשר (WGA). אם יעד גן ידוע, השתמש qPCR כדי להבטיח כי היעד הידוע הוא מועשר בשבריר מאוגד החלבון. אם לא ניתן לקבוע יעד, להמשיך ישירות לתיוג ה-DNA וכלת מערך. אם העשרה על ידי qPCR לא יכולה להיות שנצפתה, ולאחר מכן לחזור על החלבון מחייב-gDNA וצעדי DAP-WGA המשתמשים בכמויות חלבון שונות. השתמש בניתוח מערך למצוא פסגות ולמפות אותם כדי למקד את הגנים. השתמש באזורים במעלה הזרם של גנים המטרה לחזות מוטיבים אתר קישור. לאמת את המוטיבים בניסוי באמצעות EMSAs. השתמש במוטיב לסרוק את הגנום של מינים קרובים קידוד orthologs של RR תחת מחקר, ולחזות גנים ממוקדים במינים אלה גם כן. בהתבסס על מטרות הגן השיגו, התפקוד הפיזיולוגי של RR וorthologs ניתן לחזות. איור שונה והודפס מחדש באמצעות ג יצירתייםommons רישיון מ7.

<table><tbody><tr><td>HisTrapFF column (Ni-Sepharose column)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5255-01</td><td></td></tr><tr><td>Akta explorer (FPLC instrument)</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 26/10 Desalting column</td><td>GE Lfe Sciences, Pittsburgh, PA, USA</td><td>17-5087-01</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Gel extraction kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled oligonucleotides</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>6% polyacrylamide-0.5x TBE precast mini DNA retardation gel</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>EC63652BOX</td><td>Alternately, you can pour your own gel.</td></tr><tr><td>Nylon membrane</td><td>EMD Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>INYC00010</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-dry electrophoretic transfer cell</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Extra thick blot paper, 8 x 13.5 cm</td><td>Biorad, Hercules, CA, USA</td><td>170-3967</td><td></td></tr><tr><td>UV crosslinker Model XL-1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-992-89</td><td></td></tr><tr><td>Nucleic Acid chemiluminescent detection kit (Pierce)</td><td>Thermo fisher Scientific, Rockford, IL, USA</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA agarose resin</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>GenomePlex Whole genome amplification kit (Fragmentation buffer, library preparation buffer, library stabilization solution, library preparation enzyme, 10x amplification master mix, WGA polymerase)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>WGA2-50RXN</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA</td><td>For quantitation of DNA</td><td></td></tr><tr><td>Perfecta Sybr Green SuperMix, with ROX</td><td>Quanta biosciences</td><td>95055-500</td><td>Any Sybr Green PCR mix may be used</td></tr><tr><td>PlateMax Ultra clear heat sealing film for qPCR</td><td>Axygen</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>96-well clear low profile PCR microplate</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>PCR-96-LP-AB-C</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems StepOne Plus Real time PCR system</td><td>Life Technologies, Grand Island, NY, USA</td><td>4376600</td><td>Any real time PCR system may be used</td></tr><tr><td>Qiaquick PCR purification kit</td><td>Qiagen Inc, Valencia, CA, USA</td><td>28104</td><td>Any PCR clean up kit may be used</td></tr><tr><td>Cy3/Cy5-labeled nonamers</td><td>Trilink biotechnologies, San Diego, CA, USA</td><td>N46-0001, N46-0002</td><td></td></tr><tr><td>Klenow polymerase 50,000 U/ml, 3&#039;-5&#039; exo&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;</td><td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td><td>M0212M</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization system</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td>This company no longer makes arrays or related items, so alternate sources such as Agilent or Affymetrix will need to be used.</td></tr><tr><td>Custom printed microarrays and mixers</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization kit (2x Hybridization buffer, Hybridization component A, Alignment oligo)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer kit (10x Wash buffer I, II, III, 1 M DTT)</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4200A microarray scanner</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td>This model has been replaced by superior ones</td><td></td></tr><tr><td>GenePix Pro microarray software</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nimblescan v.2.4, ChIP-chip analysis software</td><td>Roche-Nimblegen, Madison, WI, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

dna-affinity-purified chip (dap-chip) method to determine gene targets for bacterial two component regulatory systems

בשיטות vivo כגון שבב שבב טכניקות מבוססות היטב המשמשות לקביעת מטרות גן הגלובליות לגורמי שעתוק. עם זאת, הם של שימוש מוגבל בחקר שתי מערכות רגולציה מרכיב חיידקים עם תנאי הפעלת uncharacterized. מערכות כאלה להסדיר שעתוק רק כאשר מופעלים בנוכחות אותות ייחודיים. מאז האותות הללו הם לעתים קרובות לא ידועים, חוץ גופית בשיטה microarray מבוססת שבתוארה במאמר זה וידאו יכול לשמש כדי לקבוע מטרות גן ואתרי קישור לרגולטורי תגובה. שיטה מטוהרת-DNA-זיקת שבב זה עשויה לשמש לכל רגולטור מטוהר בכל אורגניזם עם הגנום רצף. הפרוטוקול כרוך מאפשר מטוהר החלבון מתויג להיקשר הדנ&quot;א הגנומי טעון ולאחר מכן טיהור זיקת DNA הנכנס החלבון, ואחריו ניאון תיוג של ה-DNA וכלאה למערך ריצוף מותאם אישית. שקדמו לצעדים שעשויים לשמש כדי לייעל את assay לספציפיהרגולטורים ג גם מתוארים. הפסגות שנוצרו על ידי ניתוח נתוני מערך משמשות כדי לחזות מוטיבים אתר קישור, אשר לאחר מכן הם תוקף באופן ניסיוני. תחזיות המוטיב יכולות לשמש נוספת כדי לקבוע מטרות גן של רגולטורים תגובת orthologous במינים קרובים. אנו מדגימים את תחולתה של שיטה זו על ידי קביעת מטרות הגן ומחייב מוטיבים אתר ובכך לחזות את הפונקציה עבור DVU3023 רגולטור תגובת sigma54 תלוי בחיידק הסביבתי Desulfovibrio vulgaris Hildenborough.

השיטה הנ&quot;ל יושמה כדי לקבוע את מטרות הגן הגלובליות של RRs בסולפט מודל הפחתת חיידק Desulfovibrio vulgaris 7 Hildenborough. יש אורגניזם זה מספר גדול של TCSs מיוצג על ידי מעל 70 RRs, המעיד על המגוון הרחב של אותות אפשריים שהוא חש ומגיב ל. בvivo מנתח על הפונקציות של מערכות אזעקה אלה הם קשים לביצוע שכן האותות שלהם ובכך התנאים להפעלתם אינם ידועים. הנה שיטת DAP-השבב שימשה כדי לקבוע את מטרות גן ובכך לחזות פונקציות אפשריות עבור DVU3023 RR נציג. DVU3023 הוא-54 תלויים סיגמא RR מקודד באופרון עם (איור 3 א) HK מאותו המקור שלה. הגן שלו מתויג בטרמינל C-שובט ולמטוהר מן E. coli. לקביעת יעד ראשונית, RR המטוהרים נבדק על ההתקשרות לאופרון במורד הזרם שלה, אשר הוא ג עשרה גני אופרון (DVU3025-3035)onsisting של גנים ספיגה וחמצון חומצת החלב. RR DVU3023 העביר את האזור במעלה הזרם של DVU3025 (איור 3 ב). הבא RR DVU3023 הורשה להיקשר לד הטעון הדנ&quot;א הגנומי vulgaris Hildenborough. למרות זירחון לא נדרש על התקשרות לאזור המקדם של DVU3025, פוספט אצטיל התווסף לתגובה במקרה זה נדרש לכריכה ליזמים אחרים. בעקבות טיהור זיקה של שבריר-DNA קשור חלבון, qPCR שימש כדי להראות שהאזור במעלה הזרם של DVU3025 מועשר (8.45 פי) בשבריר מאוגד החלבון (C ט = 6.9) ביחס ל-DNA הקלט (t C = 9.98 ) (איור 3 ג), ובכך מצביעים על כך שהתנאים המחייבים שימוש היו מתאימים לDVU3023 RR. חוסר ההעשרה של האזור המקדם של גן שנבחר באקראי (DVU0013) שימש כביקורת שלילית. הדגימות הנכנס חלבונים ו-DNA הקלט אז תויגו fluorescently והכלאהד מערך ריצוף vulgaris Hildenborough שצפיפות בדיקה גבוהה באזורי intergenic. ארבע פסגות העליונים נבחרו כמטרות הסבירה ביותר לDVU3023 (איור 3D). ארבע פסגות אלה ואחרי שזוהו גם בDAP-שבב מנתח במשך כמה RRs אחר ומופיעים ומכאן להיות DNA הדביק (טבלת 1). איור 3E הוא ייצוג סכמטי של גנים מוסדרים על ידי DVU3023, עוד כמה. DVU3025 היעד החיובי היה השיא הראשון שהושג עם הציון הגבוה ביותר. שתי מטרות גן הן שתי permeases אחר מקודד ביחידים חומצת החלב (DVU2451 וDVU3284). יעד הגן הרביעי אינו טמון באזור נגד הזרם, אבל באזור intergenic בין שני גנים / operons עיבד מתכנס (DVU0652 וDVU0653). זהו אזור intergenic גדול, ובנוסף גם מקודדים אמרגן sigma54 תלוי חזה. יתכן כי יש Srna ידועות מקודד באזור זה שהוא regulated ידי RR DVU3023. שימוש באזורים במעלה הזרם של המטרות שהושגו על ידי DAP-שבב, ממה שימש לחזות מוטיב אתר קישור (איור 3F, טבלת 2). מצעי EMSA נושאים במעלה הזרם מוטיב המסוים של DVU3025 נועדו לאשר כי DVU3023 RR מזהה ונקשר המוטיב חזה. המוטיב קבל תוקף נוסף על ידי ביצוע החלפות בבסיסים נשמרים בתוך המוטיב אשר ביטל את השינוי המחייב (איור 3G). מוטיב תוקף זה שימש לאחר מכן בסקריפטים שנוצרו פרל כדי לסרוק את רצפי הגנום של חיידקי סולפט הפחתה קשורים באופן הדוק אחרים שהיו לי orthologs לDVU3023. לוקוסים נבחרו כמטרות גן אפשריות כאשר המוטיב היה ממוקם באזורים במעלה הזרם של מסגרות פתוחות קריאה (לוח 3). שימוש ברצפי המוטיב חזו לRRs orthologous, מוטיב אתר מחייב קונסנסוס נוצר (איור 3F) שדמה מאוד לone מתקבל עבור ד vulgaris Hildenborough לבד. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. קביעת מטרות הגנומי לד רגולטור תגובת vulgaris DVU3023. א DVU3023 מקודד באופרון עם HK מאותו המקור שלה. יש אופרון מורד הזרם אמרגן sigma54 תלוי (חץ שחור כפוף) ושימש כגן יעד מועמד. ב מטוהר RR DVU3023 מחויב והעביר את האזור במעלה הזרם של DVU3025 7. ג Q-PCR של אזורים במעלה הזרם של DVU3025 (חיובי היעד) וDVU0013 (שנבחר כביקורת שלילית). E הוא שבריר DNA מועשר בכריכת חלבון, אני הוא DNA קלט. ד למעלה ארבע פסגות המתקבלות לאחר ניתוח DAP-שבב. התחלה וסיום מתייחס ל-DNA קואורדינטות בהתחלה והסיום של PEAKS; ציון מתייחס ליחס יומן 2 R של החללית הרביעית הגבוהה ביותר בשיא; רוזוולט = שיעור גילוי שווא; cutoff_p הוא אחוז הפסקת שבשיא היה מזוהה. ייצוג סכמטי א &#39;של מטרות הגן לDVU3023 מבוססות על פסגות DAP-השבב. מספרים בתיבות מצביעים על מספר השיא בגנים HK-RR ד נמצא בגנים ירוקים, יעד בכחול ואחרים בגנים אפורים. חיצים מכופפים שחורים הם יזמים sigma54 תלויים, עיגולים מלאים ירוקים הם חזו מוטיבים אתר קישור. שמות ג&#39;ין הם כדלקמן: por - oxidoreductase ferredoxin פירובט; LLP - חומצת החלב permease; מונואמין GLCD-glycolate; glpC-Fe-S אשכול חלבון מחייב; Pta - phosphotransacetylase; קינאז ack-אצטט; lldE - מקטע מונואמין חומצת החלב; lldF / G - מקטע מונואמין חומצת החלב; MCP -. חלבון chemotaxis קבלה-מתיל פ Weblogo 8 תמונות של predicted מוטיב אתר קישור. למעלה - נגזר ממטרות DAP-שבב; תחתון - נבע מאתרי קישור קיימים בגנומים עם orthologs של 7 DVU3023 ג תיקוף מוטיב אתר קישור חזה באמצעות EMSA.. DVU3023 העביר את מוטיב הסוג בר (w) אך לא את המוטיב שונה (מ &#39;). רצפים למוטיבי w מ &#39;מוצגים בצד הימין 7. איור שונה והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מאל Rajeev ואח&#39; 7. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/51715/51715table1.jpg" width="700" /> טבלת 1. 20 פסגות למעלה מניתוח מערך DAP-שבב. הטבלה מחולקת לשלושה חלקים. תכונות שיא מראות פרטים של הפסגות שכנוצרו על ידי תוכנת ניתוח מערך, שבו מיקום מתייחס לשאלה האם השיא נמצא בגנום או פלסמיד extrachromosomal, התחלה וסיום מתייחסים ליםטארט ולוקוסי הסוף לפסגה, ציון מתייחס ליחסי יומן 2 R לבדיקה הרביעית הגבוהה ביותר בשיא, רוזוולט מתייחס לערך שיעור גילוי השווא, וcutoff_p הוא אחוז הפסקת שבשיא היה מזוהה. שני סעיפים האחרים התחילו לתאם מיפוי וסיים לתאם מפת מיפוי לוקוסי ההתחלה וסיום, בהתאמה, של השיא לגנים. בקטעים אלה גדיל ג&#39;ין מתייחס לגדיל קידוד הגנטי, אופסט מציין מרחק מההתחלה של הגן (ערכים חיוביים מצביעים על הלוקוסים הוא במעלה הזרם של גן, בעוד שערכים שליליים מצביעים על לוקוסים הוא בתוך הגן), ערך גן החפיפה הוא TRUE אם מוקד חופף גן, DVU מתייחס ל# ^ ש של הגן שקואורדינטות מפה ולתיאור מציין את ביאור הגן. הותאם שולחן והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מאל Rajeev ואח&#39; 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51715/51715table1.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה באל</a>גרסת arger של השולחן הזה. <img alt="טבלה 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51715/51715table2.jpg" width="500" /> שונה רצפי טבלה 2. משמשים לבניית יעד DAP-שבב הקונצנזוס מבוסס מוטיב באיור 3. שולחן והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מאל Rajeev ואח&#39; 7. <img alt="טבלה 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51715/51715table3.jpg" width="600" /> לוח 3. מוטיבים אתר קישור לDVU3023 orthologs ההווה בDesulfovibrio רצף אחר ומינים קרובים. עבור כל הגנום הסרוק, שם האורגניזם מצויינים, ואחריו את תג המוקד לortholog DVU3023 וזהות אחוזים לDVU3023 בסוגריים. ציון מציין את הערך שהוקצה על ידי תכנית פרל על סמך דמיון לsequen הקלטCES. תיאור קובע את ההסברים גנטיים לגנים באופרון היעד. הותאם שולחן והודפס מחדש באמצעות הרישיון של Creative Commons מאל Rajeev ואח&#39; 7. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51715/51715table3.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems at JoVE.com

DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

In vivo methods such as ChIP-chip are well-established techniques used to determine global gene targets for transcription factors. However, they are of ...

dna-affinity-purified-chip-dap-chip-method-to-determine-gene-targets

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

DNA-affinity-purified Chip (DAP-chip) Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

16.7K Views.  Lawrence Berkeley National Laboratory.  מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב. 

Video: DNA-affinity-purified Chip DAP-chip Method to Determine Gene Targets for Bacterial Two component Regulatory Systems

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Genetics

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Bioengineering

An Assay for Quantifying Protein-RNA Binding in Bacteria

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding of an RNA binding protein (RBP) to the initiation region of the mRNA, which interferes with ribosome binding. In the presented method, we utilize this blocking phenomenon to quantify the binding affinity of RBPs to their cognate and non-cognate binding sites. To do this, we insert a test binding site in the initiation region of a reporter mRNA and induce the expression of the test RBP. In the case of RBP-RNA binding, we observed a sigmoidal repression of the reporter expression as a function of RBP concentration. In the case of no-affinity or very low affinity between binding site and RBP, no significant repression was observed. The method is carried out in live bacterial cells, and does not require expensive or sophisticated machinery. It is useful for quantifying and comparing between the binding affinities of different RBPs that are functional in bacteria to a set of designed binding sites. This method may be inappropriate for binding sites with high structural complexity. This is due to the possibility of repression of ribosomal initiation by complex mRNA structure in the absence of RBP, which would result in lower basal reporter gene expression, and thus less-observable reporter repression upon RBP binding.

In this method, we quantify the binding affinity of RNA binding proteins (RBPs) to cognate and non-cognate binding sites using a simple, live, reporter assay in bacterial cells. The assay is based on repression of a reporter gene.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

In the initiation step of protein translation, the ribosome binds to the initiation region of the mRNA. Translation initiation can be blocked by binding ...

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription factors, histone modifications, and other DNA-associated proteins. ChIP-seq data can also be used to find differential binding of transcription factors in different environmental conditions or cell types. Initially, ChIP was performed through hybridization on a microarray (ChIP-chip); however, ChIP-seq has become the preferred method through technological advancements, decreasing financial barriers to sequencing, and massive amounts of high-quality data output. Techniques of performing ChIP-seq with bacterial biofilms, a major source of persistent and chronic infections, are described in this protocol. ChIP-seq is performed on Salmonella enterica serovar Typhimurium biofilm and planktonic cells, targeting the master biofilm regulator, CsgD, to determine differential binding in the two cell types. Here, we demonstrate the appropriate amount of biofilm to harvest, normalizing to a planktonic control sample, homogenizing biofilm for cross-linker access, and performing routine ChIP-seq steps to obtain high quality sequencing results.

Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing ChIP-seq

Chromatin immunoprecipitation coupled with next-generation sequencing (ChIP-seq) is a method used to establish interactions between transcription factors and the genomic sequences they control. This protocol outlines techniques for performing ChIP-seq with bacterial biofilms, using Salmonella enterica serovar Typhimurium bacterial biofilm as an example.

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-seq) is a technique that can be used to discover the regulatory targets of transcription ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Immunology and Infection

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג&#39;ין

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays to study gene expression, but most are limited in terms of providing an overall picture of the expression of the whole transcriptome. DNA microarrays offer a fast and economic research technology, which gives a full overview of global gene expression and have a vast number of applications including identification of novel genes and transcription factor binding sites, characterization of transcriptional activity of the cells and also help in analyzing thousands of genes (in a single experiment). In the present study, the conditions for bacterial transcriptome analysis from cell harvest to DNA microarray analysis have been optimized. Taking into account the time, costs and accuracy of the experiments, this technology platform proves to be very useful and universally applicabale for studying bacterial transcriptomes. Here, we perform DNA microarray analysis with Streptococcus pneumoniae as a case-study by comparing the transcriptional responses of S. pneumoniae grown in the presence of varying L-serine concentrations in the medium. Total RNA was isolated by using a Macaloid method using an RNA isolation kit and the quality of RNA was checked by using an RNA quality check kit. cDNA was prepared using reverse transcriptase and the cDNA samples were labelled using one of two amine-reactive fluorescent dyes. Homemade DNA microarray slides were used for hybridization of the labelled cDNA samples and microarray data were analyzed by using a cDNA microarray data pre-processing framework (Microprep). Finally, Cyber-T was used to analyze the data generated using Microprep for the identification of statistically significant differentially expressed genes. Furthermore, in-house built software packages (PePPER, FIVA, DISCLOSE, PROSECUTOR, Genome2D) were used to analyze data.

A Fast and Reliable Pipeline for Bacterial Transcriptome Analysis Case study: Serine-dependent Gene Regulation in Streptococcus pneumoniae

This manuscript describes the use of state-of-the-art technology provided by DNA-microarrays. Microarrays provide an overview of the transcriptomic changes in bacteria incurred under a specific condition. Moreover, we highlight the ease by which large amounts of data can be analyzed by using convenient in-house developed software packages.

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em

Gene expression and its regulation are very important to understand the behavior of cells under different conditions. Various techniques are used nowadays ...

Functional Complementation Analysis (FCA): A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very common in biochemistry, genetics and many other disciplines. A comprehensive overview of the technique to supplement the teaching of biochemical pathways pertaining to amino acids, peptidoglycan and the bacterial stringent response is reported in this manuscript. Two cDNAs from the model plant organism Arabidopsis thaliana that are involved in the metabolism of lysine (L,L-diaminopimelate aminotransferase (dapL) and tyrosine aminotransferase (tyrB) involved in the metabolism of tyrosine and phenylalanine are highlighted. In addition, the bacterial peptidoglycan anabolic pathway is highlighted through the analysis of the UDP-N-acetylmuramoyl-L-alanyl-D-glutamate-meso-2,6-diaminopimelate ligase (murE) gene from the bacterium Verrucomicrobium spinosum involved in the cross-linking of peptidoglycan. The bacterial stringent response is also reported through the analysis of the rsh (relA/spoT homolog) bifunctional gene responsible for a hyper-mucoid phenotype in the bacterium Novosphingobium sp. Four examples of FCA are presented. The video will focus on three of them, namely lysine, peptidoglycan and the stringent response.

Functional Complementation Analysis FCA: A Laboratory Exercise Designed and Implemented to Supplement the Teaching of Biochemical Pathways

The validation of enzymatic activities involved in biochemical pathways can be elucidated using functional complementation analysis (FCA). Described in this manuscript is the FCA assay demonstrating the enzymatic activity of enzymes involved in the metabolism of amino acids, bacterial stringent response and bacterial peptidoglycan biosynthesis.

השלמת אנליזה פונקציונלית (FCA): תרגיל מעבדה ומומש כדי להשלים את הוראת הביוכימיים

Functional complementation assay (FCA) is an in vivo assay that is widely used to elucidate the function/role of genes/enzymes. This technique is very ...

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli (p)ppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in seconds, which leads to accumulation of levels that approach or exceed those of GTP pools. Stress reversal occasions a rapid disappearance of (p)ppGpp, often with a half-life of less than a minute. The presence of (p)ppGpp results in alterations of cellular gene expression and metabolism that counter the damaging effects of stress. Gram-negative and Gram-positive bacteria have different response mechanisms, but both depend on (p)ppGpp concentration. In any event, there is a need to simultaneously monitor many radiolabeled bacterial cultures at time intervals that may vary from 10 seconds to hours during critical stress transition periods. This protocol addresses this technical challenge. The method takes advantage of temperature- and shaker-controlled microtiter dish incubators that allow parallel monitoring of growth (absorbance) and rapid sampling of uniformly phosphate-radiolabeled cultures to resolve and quantitate nucleotide pools by thin-layer chromatography on PEI-cellulose. Small amounts of sample are needed for multiple technical and biological replicates of analyses. Complex growth transitions, such as diauxic growth and rapid (p)ppGpp turnover rates can be quantitatively assessed by this method.

Using Microtiter Dish Radiolabeling for Multiple In Vivo Measurements Of Escherichia coli pppGpp Followed by Thin Layer Chromatography

The growth of radiolabeled bacterial cultures in microtiter dishes facilitates high throughput sampling that allows multiple technical and biological replicate assays of nucleotide pool abundance, including that of (p)ppGpp. The effects of growth transitions provoked by sources of physiological stress as well as recovery from stress can be monitored.

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה

The (p)ppGpp nucleotide functions as a global regulator in bacteria in response to a variety of physical and nutritional stress. It has a rapid onset, in ...

שיטת צ'יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שיטה המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית ללמוד הכונה חיידקי ברקמות נגוע

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות

הגנום כולו ניתוח באמצעות שבב זיהוי איזופורם ספציפי מטרות ג'ין

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב

צינור מהיר ואמין למחקר בקטריאלי transcriptome ניתוח מקרה: ויסות גני Serine תלויה ב

השלמת אנליזה פונקציונלית (FCA): תרגיל מעבדה ומומש כדי להשלים את הוראת הביוכימיים

באמצעות Microtiter צלחת Radiolabeling עבור מספר מדידות Vivo של es, coli (p) ppGpp ואחריו כרומטוגרפיה שכבה דקה