אנו מודים לירדן דייוויס, Yanyan לין, אריק Schadler וJimiao ג&#39;נג לעזרה הטכנית שלהם בעבודה זו. עבודה זו נתמכה על ידי NSF קריירה להעניק MCB-1054962 לALA

1. הכנת צלחות מיץ-אגר גדולות של אפל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את 4 צלחות, להוסיף 375 מיליליטר H 2 O, אגר זבוב 11.25 גרם ובר ומערבבים בבקבוק 1,000 מיליליטר. זה מיקס א החיטוי מיקס עם מכסה הבקבוק כתרים על מחזור 30 דקות-עיקור אחד עבור מוצרים נוזליים באופן רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה 125 מיץ מיליליטר תפוח, 12.5 סוכר שולחן גרם ובר ומערבבים לכוס 500 מיליליטר. זה המיקס B. חום המיקס B על פלטפורמה מחוממת תוך כדי ערבוב ולשמור על הטמפרטורה בכ 70 ° C עד מעוקר של המיקס הוא סיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת מיקס מעוקר, להעביר מיקס B למערבב א שמור ערבוב את התערובת בשילוב בעדינות ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות. הימנע על קירור וההתמצקות אגר הביאה לפני התוספת של חומר משמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פתרון 4-hydroxybenzoate תיל 10% (משקל / נפח) באתנול. זה ישמש כחומר משמר. הוספת 3.75 מיליליטר של הפתרון לתערובת מיץ התפוחים אגר לעיל. שמור ערבוב במשך another 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את תערובת מיץ תפוחים אגר מיליליטר 125 עם חומר משמר לכל פלסטיק 300 2 סנטימטר או צלחת קלקר. תן לזה להתקרר לRT ולחזק. הימנע מיצירה של בועות אוויר בעת המזיגה. הערה: צלחות מיץ התפוחים אגר מוכנות לשימוש באופן מיידי. כסה צלחות שאינן בשימוש עם עוטף ברור ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע. </li></ol> 2. אוסף תסיסנית וטיפול טרום crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען כלוב אוכלוסייה עם כ 40,000 50,000 זבובים שממנו העוברים ייאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע שתי צלחות המכילה כל אחת 125 מיליליטר של קמח תירס, מולסה הסטנדרטי בינוני 12 ומפזר כ 4 גרם של שמרי אופה מיובש על כל צלחת. הנח צלחות אלה לתוך כלוב האוכלוסייה בC חממת 25 ° ל48 שעות לפטם את הזבובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות מיץ אגר חמות 2 תפוחים ל25 ° C. מפזר כ 1 גרם של שמרים יבשים אופה בכלצלחת. מניחים את 2 הצלחות בכלוב האוכלוסייה להתחיל לאסוף 0-1 עוברי HR-ישן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את הצלחות בסוף אוסף 1 שעות. החלף עם 2 צלחות חדשות, אם יש צורך בסיבוב של אוסף אחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מספיק מים כדי לכסות את הצלחות וresuspend את העוברים בעדינות עם מברשת צבע עדינה. יוצקים את עוברי resuspended דרך מסננת שתי שכבה עשויה מרשת תיל פלדה אל חלד. הערה: השכבה העליונה עשויה רשת גודל נקבובית בינוני (850 מיקרומטר) אשר אוספת חלקי זבוב גדולים בעת נותן דרך עוברים. השכבה התחתונה עשויה מרשת בסדר (75 מיקרומטר) אשר אוספת עוברים בעת נותן באמצעות שמרים ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במברשת הצבע העדינה להעביר את העוברים שנאספו לתוך סל איסוף נעשה עם צינור 50 מיליליטר ורשת ניילון דק. יש לשטוף את העוברים לזמן קצר במים ולאחר מכן למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העוברים באקונומיקת 50% עם מתערבל בעדינות במשך 3 דקות. יש לשטוף יסודיly עם מים כדי להסיר כל אקונומיקה שנותרה. למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את עוברי dechorionated בisopropanol עם תסיסה עדינה ל15 שניות או עד שההתמוטטות של גושים רב עובר (זה לא אמור לקחת זמן רב יותר מאשר 30 שניות). למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש ביסודיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את העוברים בheptane במשך 5 דקות תוך השימוש בפיפטה כדי להזרים heptane על העוברים כדי לשמור אותם מושעים. למחוק את הרשת על מגבות נייר לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את העוברים עם זרמים של בופר פוספט, pH 7.4 (PBS) המכילים 0.1% טריטון X-100 (PBST) במשך 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את סל האיסוף ולהעביר את העוברים יחד עם הרשת לצינור 15 מיליליטר מכיל 10 PBST מיליליטר. להפוך את הצינור בעדינות כדי לשטוף את העוברים מחוץ לרשת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרשת מהצינור. שים את הצינור במצב אנכי ולתת את העוברים לשקוע לחלק התחתון של הצינור על ידי כוח הכבידה. הערה: כ 100-300μl של עוברים צפוי לאוסף 1 שעות מכלוב אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את PBST ותמשיך לבצע crosslinking באופן מיידי. </li></ol> 3. בvivo crosslinking של עוברים שנאספו <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פורמלדהיד 0.2% בPBST מייד לפני השימוש. הוסף 10 מיליליטר של מקבע פורמלדהיד לעוברים ולדגור על 25 ° C עם תסיסה עדינה על שייקר רוטרי 10 דקות. בטל מקבע שאינו בשימוש על ידי סופו של היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תגובת crosslinking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של crosslinking, בואו העוברים לשקוע לתחתית של התחתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון פורמלדהיד. מייד להוסיף 10 מיליליטר של 0.25 M גליצין בPBST כדי להרוות את תגובת crosslinking. לדגור על 25 ° C עם תסיסה עדינה על שייקר סיבובי למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו העוברים לשקוע לתחתית של התחתית. הסר את הפתרון להרוות. לשטוף את העוברים עם 10 מיליליטר של PBST שלוש פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר לחלוטין את Pפתרון לשטוף BST באמצעות פיפטה. עוברי חנות ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li></ol></li></ol> 4. לדוגמא הכנת חלבון וImmunoprecipitation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize עוברי crosslinked 500 μl באמצעות homogenizer Dounce ב2 מאגר תמוגה מיליליטר (0.5 M אוריאה, 0.01% SDS, 2% Triton-X 100, פלואוריד 2 מ&quot;מ phenylmethanesulfonyl [PMSF] ומעכבי פרוטאז קוקטייל PBS). הערה: בצע את זה ואת השלבים הבאים בRT אלא אם צוין אחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את lysate ל1.5 צינורות צנטריפוגה מיליליטר ועדינות רוק על במה מסתובב במשך 15 דקות כדי להבטיח תמוגה יסודית. צנטריפוגה lysate XG 16,000 במשך 5 דקות עד גלולה פסולת הסלולר. שמור את supernatant בצינור מיליליטר נקי 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl חרוזים agarose אנטי HA בלועים לsupernatant ולדגור על פלטפורמה מסתובבת ל2.5 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה ב2,500 XG במשך 5 דקות. הסר את supernatant אך להשאיר את approximately 250 μl בצינור. Resuspend את החרוזים supernatant נותר ולהעביר לטור ספין 1.5 מיליליטר עם מסנן נקבובית 10-מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה עמודת הספין על XG 12,000 ל10 שניות וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את החרוזים על ידי הוספת 200 לשטוף חיץ μl (0.1 M גליצין, 1 M NaCl, IGEPAL 1% CA-630, Tween-20 0.1%, ב-PBS). צנטריפוגה העמודה ב12,000 XG במשך 10 שניות וזורקים את הכביסה. חזור על לשטוף פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 חיץ elution μl (2 מ&quot;ג / מיליליטר HA-peptide בPBS) לחרוזים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך דקות 15 עם תסיסה עדינה כל 5 דקות. צנטריפוגה העמודה ב12,000 XG במשך 10 שניות ולאסוף את eluate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר elution של המתחם על ידי ניתוח כתם המערבי באמצעות אנטי HA נוגדן 13. </li></ol>

<ol>
	<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome research. 22, 1813-1831 (2012).</li><li>Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA+binding+sites+by+CLIP-seq.">Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq.</a> Methods. , (2013).</li><li>Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utility+of+formaldehyde+cross-linking+and+mass+spectrometry+in+the+study+of+protein-protein+interactions.">Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions.</a> Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).</li><li>Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+role+of+specific+Tudor+domains+in+Tudor-Aubergine+protein+complex+assembly+and+distribution+during+Drosophila+oogenesis.">Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis.</a> Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).</li><li>Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Tudor+domains+in+germline+development+and+polar+granule+architecture.">The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture.</a> Development. 133, 4053-4062 (2006).</li><li>Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+gene+required+for+assembly+of+the+germ+plasm+in+Drosophila+melanogaster.">a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster.</a> Cell. 43, 97-104 (1985).</li><li>Thomson, T., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+tudor+is+essential+for+polar+granule+assembly+and+pole+cell+specification,+but+not+for+posterior+patterning.">Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning.</a> Genesis. 40, 164-170 (2004).</li><li>Arkov, A. L., Ramos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+RNA-protein+granules:+insight+from+the+germline.">Building RNA-protein granules: insight from the germline.</a> Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).</li><li>Gao, M., Arkov, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organelles:+Structure+and+role+of+germ+granules+in+the+germline.">Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline.</a> Molecular reproduction and development. , (2012).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+methylarginine-dependent+recognition+of+Aubergine+by+Tudor.">Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor.</a> Genes &amp; development. 24, 1876-1881 (2010).</li><li>Liu, N., Han, H., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasa+promotes+Drosophila+germline+stem+cell+differentiation+by+activating+mei-P26+translation+by+directly+interacting+with+a+(U)-rich+motif+in+its+3.">Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3.</a> UTR. Genes &amp; development. 23, 2742-2752 (2009).</li><li>Matthews, K. A., Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster:+Practical+Uses+in+Cell+and+Molecular+Biology.">Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology.</a> Methods in Cell Biology. 44, 13-32 (1995).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: A laboratory manual. , (2001).</li><li>Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+new+polar+granule+components+in+Drosophila+reveals+P+body+and+ER+associated+proteins.">Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins.</a> Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).</li><li>Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+protein-protein+interactions+using+in+vivo+cross-linking+and+mass+spectrometry.">Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry.</a> Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).</li><li>Klockenbusch, C., Kast, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+formaldehyde+cross-linking+for+protein+interaction+analysis+of+non-tagged+integrin+beta1.">Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).</li><li>Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation.">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li><li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation.">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694 (2006).</li><li>Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+facets+interacts+with+vasa+in+the+Drosophila+pole+plasm+and+protects+it+from+degradation.">Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation.</a> Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פורמלדהיד כבר בשימוש נפוץ כמגיב crosslinking לזיהוי חלבונים ואינטראקציות חומצת חלבון גרעין. חדירות טובות שלה מסיסות וקרום תא, יחד עם התאימות לנהלי ספקטרומטריית מסה במורד הזרם, להפוך פורמלדהיד סוכן מועמד אידיאלי עבור יישומי crosslinking תאיים 3,15-17. בפרט, הוא השתמש בהצלחה כדי לזהות mRNAs הקשורים לושה, helicase RNA תאי נבט קריטי ב11 דרוזופילה. בנוסף, לפורמלדהיד אחת מהזרועות הקצרים ביותר spacer (2.3-2.7 Å) בקרב crosslinkers זמין מסחרי, מה שמרמז כי מולקולות היחידים שקיימות בסמיכות יהיו crosslinked בתנאים הנכונים, חיזוק ספציפי של השותפים באינטראקציה של חלבון המטרה . מהסיבות האמורות לעיל, פורמלדהיד נבחר כסוכן crosslinking בפרוטוקול שלנו. עם זאת, זה לא צריך לשלול את usefulness של סוכני crosslinking אחרים ביישום vivo לעוברי דרוזופילה. עם זאת, יש לנו ניסיתי להשתמש dithiobis (propionate succinimidyl) (DSP), crosslinker N-hydroxysuccinimide (NHS) אסתר משפחה משמש לעתים קרובות בשילוב עם פורמלדהיד במבחני שבב 17,18, להחליף פורמלדהיד במחקר שלנו, אבל לא TUD לכאורה מורכב הושג עם crosslinker הזה מצד השני, DSP עשוי להיות יעיל לקומפלקסי חלבונים אחרים אשר צריך להיקבע על בסיס כל מקרה לגופו. בנוסף לin vivo גישת crosslinking, במבחנה crosslinkers מbismaleimidohexane משפחה (BMH) הוכח כיעיל בלכידת אינטראקציות בין חלבונים בעוברי דרוזופילה 14,19, עם זאת, בניסויים אלה התרחש crosslinking לאחר תמציות עובר נעשו. זמן crosslinking, הטמפרטורה וריכוז פורמלדהיד הם העומדים השלושה הגדולותtors המשפיעים על יעילות crosslinking. הפרוטוקול שלנו נבדק באמצעות ניסויי פיילוט לכל גורם בודד, ולכן, זה כבר מותאם לcrosslinking של חלבון TUD והשותפים באינטראקציה שלה בעוברי דרוזופילה in vivo, תוך שמירה על האיזון בין הספציפיות של מתחם crosslinked ואת הסיכון של crosslinking מולקולות ספציפיות. crosslinking ספציפי מוביל לנוכחות של תוצאות חיוביות שגויות במתחם וחייב להיות מבוקר בקפידה עם שליטת חלבון שאינה קשורה, למשל ה-GFP, ששמשה בניסויים שלנו. בנוסף, תנאי crosslinking אופטימליים עשויים להשתנות עם מולקולות יעד שונות. לכן, באמצעות הפרוטוקול שלנו כנקודת התחלה, בפעם crosslinking האופטימלית, טמפרטורה וריכוז פורמלדהיד יצטרך להיקבע לקומפלקס חלבון נתונה של ריבית. ברגע שהתנאים אופטימליים crosslinking הם הקימו אותו הוא קריטי לFOllow בדיוק בכל פעם שעוברת הם crosslinked כדי למזער crosslinking ספציפי. צעד חיוני נוסף הוא שטיפת חרוזים אחרי ה-IP עם ריכוז גבוה של NaCl (1 M) ושני חומרי ניקוי (IGEPAL CA-630 וTween-20) כדי להפחית ספציפי מחייב של חלבונים שאינם קשורים מתמציות עוברי לחרוזים. הפרוטוקול שלנו תלוי בזיקה הגבוהה בין חלבון המטרה והנוגדנים המשמשים לניתץ מורכב החלבון במהלך IP. לכן, אפיטופ של הנוגדן בחלבון המטרה לא צריך להיות נהרס על ידי crosslinking וחייב להיות נגיש לנוגדנים במהלך IP. בנוסף, האינטראקציה חלבון נוגדנים היעד צריכה לעמוד בשוטף המחמיר שמטרתה ההפחתה של חלבוני רקע ספציפיים. דרישות אלה עבור ה-IP המוצלח עשויות למנוע אחד מהעסקת שילוב נוגדן epitope מסוים, עם זאת, זה צריך להיות אפשרי למצוא זוג נוגדנים epitope מתאים לחלבון של עניין. בפרט, epitope HA-התג והנוגדנים המקביל שימשו בהצלחה בפרוטוקול זה. הפרוטוקול המתואר יכול לשמש לבידוד של קומפלקסי חלבוני ילידים במהלך שלבי התפתחות שונים וברקמות שונות. למרות שאנו מראים בשיטה זו לדרוזופילה, הפרוטוקול שלנו יכול להיות מותאם לאורגניזמים אחרים.

בידוד של מכלולי חלבון multisubunit ומתחמי ה-DNA או RNA-חלבון מתבצע לזהות קומפלקסי חלבונים, לוקוסים הגנומי מוכרים על ידי חלבוני רגולטורים-DNA מחייבת או מטרות RNA של חלבוני RNA מחייבים. שיטות שונות מאפשרות זיהוי הגנום של אתרי ה-DNA המוכרים על ידי גורמי שעתוק או חלבוני הכרומטין (שבב-seq) 1 ומטרות RNA הקשורים בחלבון נתון מחייב-RNA (CLIP-seq) 2. הספריות של cDNAs נגזר RNA או DNA מטרות מכן רצף עמוק. שיטות אלה משתמשות כימיות או cross-linking כדי לייצב את מתחמים ואחרי immunoprecipitation (IP) עם נוגדנים נגד מרכיב חלבון של המתחם למד מושרה UV. במהלך ההתפתחות של האורגניזם, קומפלקסי חלבונים רבים יוצרים transiently. לכן, זה הכרחי כדי לנתח את ההרכב ותפקוד של קומפלקסים אלה in vivo כדי להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים development. ניתוח כזה in vivo יהיה מעולה במבחנת גישה שכן הוא כמעט בלתי אפשרי לשחזר ריכוזי יליד מרכיבי האינטראקציה והסביבה ביוכימית תאית במבחנה. כאן אנו מדגימים vivo בגישה שאנחנו בהצלחה להשתמש כדי לבודד את מערכות חלבון גדולות מעוברי דרוזופילה. בשיטה זו, קומפלקסי חלבונים בעוברי החיים הם crosslinked עם ריכוז נמוך של פורמלדהיד, ולאחר מכן מתחמי חלבון של עניין מבודדים על ידי IP עם נוגדנים נגד מרכיב ידוע של מתחמים ואחריו טיהור ג&#39;ל של מתחמים וניתוח ספקטרומטריית מסה כדי לזהות רכיבים מורכבים לא ידועים. מאז פורמלדהיד הוא מסוגל לחדור את קרום התא ויש לו מגוון crosslinking של 2.3-2.7 3, ניתן crosslinked קומפלקסי חלבוני in vivo והרכיבים המורכבים צפויים להיות קרוב אחד לשני. שבמאמר זהמתאר שיטה זו באמצעות הבידוד של טיודור (TUD) חלבון מורכב לדוגמא ירושלים. TUD הוא חלבון בתאי מין שהוא חיוני להתפתחות תאי המין 4-7. חלבון זה מכיל 11 תחומים TUD ידועים אינטראקציה עם arginines או lysines מפוגלים של פוליפפטידים אחרים 8-10. בעבר, יש לנו שנוצרו קו דרוזופילה מהונדס המבטא HA-מתויג TUD הפונקציונלי 5 ולכן, נוגדן אנטי HA ספציפי משמש לניתץ מורכב TUD לאחר crosslinking. בנוסף לcrosslinks חלבונים, פורמלדהיד יכול ליצור crosslinks חומצת חלבון גרעין, והוא משמש בניסויי שבב seq. יתר על כן, בדרוזופילה, in vivo crosslinking עם פורמלדהיד אפשר זיהוי של יעד RNA חלבון helicase Vasa RNA 11. ואילו במאמר זה אנו מתארים שיטה לin vivo crosslinking ופורification של קומפלקסי חלבונים מעוברי דרוזופילה, שיטה זו יכולה להיות מותאמת לאורגניזמים וברקמות אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="858">
	<tbody>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Drosophila agar</td>
			<td style="width:235px;">Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">FLY-8020-1</td>
			<td style="width:289px;">Do not autoclave the water and agar mix for prolonged period of time as it will cause the apple juice plates to become fragile</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">H5501</td>
			<td style="width:289px;">Other name: TEGOSEPT</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Population cage</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">59-104</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Fine nylon mesh</td>
			<td style="width:235px;">Flystuff (http://www.flystuff.com/)</td>
			<td style="width:119px;">57-102</td>
			<td style="width:289px;">When making the collection basket, cut the mesh slightly larger than the opening of the falcon tube cap to ensure a tight seal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Dounce homogenizer</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">D8938-1SET</td>
			<td style="width:289px;">Chill the homogenizer on ice and prerinse with cold lysis buffer before use to prevent protein degradation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Protease inhibitor cocktail&#160;</td>
			<td style="width:235px;">Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)</td>
			<td style="width:119px;">4693132001</td>
			<td style="width:289px;">PBS could be used to prepare concentrated protease inhibitor stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-HA agarose beads</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">The kit also includes HA-peptide and spin columns</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HA-peptide</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Prepare to 2 mg/ml with PBS&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Spin Column</td>
			<td style="width:235px;">MBL international (http://www.mblintl.com/)</td>
			<td style="width:119px;">561-8</td>
			<td style="width:289px;">Spin columns are included as part of the kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP26324</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP151-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Heptane</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">H350-4</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:235px;">Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)</td>
			<td style="width:119px;">AM9625</td>
			<td style="width:289px;">Dilute from 10 X to 1 X with nanopure water before use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP531-500</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0724</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SDS</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0301</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Urea</td>
			<td style="width:235px;">BioRad (www.bio-rad.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">161-0730</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">P7626-1G</td>
			<td style="width:289px;">Prepare 200 mM stock solution in isopropanol then dilute to working concentration of 2 mM in lysis buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td style="width:235px;">Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)</td>
			<td style="width:119px;">I8896-50ML</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tween 20</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">BP337-100</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">15-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">USA Scientific (http://www.usascientific.com/)</td>
			<td style="width:119px;">1475-0511</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bleach</td>
			<td style="width:235px;">Clorox brand</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:289px;">Dilute with equal volume of nanopure water to make 50% bleach</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">50-ml tubes</td>
			<td style="width:235px;">BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)</td>
			<td style="width:119px;">352098</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Top layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1AK</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Bottom layer sieve</td>
			<td style="width:235px;">Fisher Scientific (www.fishersci.com/&#8206;)</td>
			<td style="width:119px;">04-884-1BA</td>
			<td style="width:289px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vivo crosslinking approach to isolate protein complexes from drosophila embryos

תהליכים תאיים רבים נשלטים על ידי קומפלקסי חלבוני multisubunit. לעתים קרובות מתחמים אלה מהווים transiently ודורשים סביבה מקורית להרכבה. לכן, כדי לזהות קומפלקסי חלבונים פונקציונליים אלה, חשוב לייצב אותם in vivo לפני תמוגה תא וטיהור שלאחר מכן. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד מתחמים גדולים בתום לב חלבון מעוברי דרוזופילה. שיטה זו מבוססת על permeabilization עובר וייצוב של מתחמים בתוך את העוברים על ידי in vivo crosslinking באמצעות ריכוז נמוך של פורמלדהיד, אשר יכול בקלות לחצות את קרום התא. בהמשך לכך, מורכב החלבון של עניין הוא immunopurified ואחריו טיהור ג&#39;ל ונותח על ידי ספקטרומטריית מסה. אנו מדגימים שיטה זו באמצעות טיהור של חלבון מורכב טיודור, שהוא חיוני להתפתחות תאי מין. טיודור הוא חלבון גדול, המכיל תחומים טיודור מרובים - קטןמודולים כי אינטראקציה עם arginines או lysines מפוגלים של חלבוני יעד. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לבידוד של קומפלקסי חלבוני יליד מהאורגניזמים ורקמות שונים.

היעילות של crosslinking והטיהור המוצלחת של החלבון המורכב TUD crosslinked נותחו על ידי SDS-PAGE על 3% - 7% ג&#39;ל צעד (איור 1) ואחריו כתם מערבי (איור 2). מטרת שימוש ב3% - ג&#39;ל שלב 7% מבוססת על ההפרדה היעילה של חלבונים מורכבים TUD crosslinked מהחלבון שנותר uncrosslinked TUD והריכוז המורכב. מתחת in vivo תנאי crosslinking שלנו שהוזכרו לעיל, חלק גדול מחלבון TUD יכול עדיין להישאר uncrosslinked. חלבון TUD חופשי זה הייתי copurify עם מורכב crosslinked במהלך IP עד הפרדה ידי-SDS. למרות גדול בגודל, uncrosslinked חלבון TUD (285 KDA) נודד על פני 3% - גבול 7% ללא שמירה ברורה. בעוד שחלבון מורכב TUD crosslinked עם משקל מולקולרי גדול יותר היה מתקשה נודדים מעבר לגבול ג&#39;ל, וכתוצאה מכך הדואר מורכב ש&quot; לכודים &quot;והתרכזתי בגבול או&quot; עוקב &quot;בסמוך לגבול ולכן, הפרדה מחלבון TUD בחינם. הכללתו של בקרה נאותה היא קריטית כדי לאמת את הספציפיות של פרוטוקול crosslinking זה. לכן, השתמשנו עוברים לבטא חלבון ה-GFP-tagged HA 14 כדי לפקח על היקף crosslinking. יש לנו לבצע ניסויי פיילוט של ריכוזים שונים פורמלדהיד (0.1% - 2%) על עוברים להביע GFP וחלק מתויג-HA של התוצאות (0.1% - 0.5%) מוצג כאן (איור 3). ברור שרוב המוחלט של חלבון ה-GFP בעוברים שטופלו (פורמלדהיד עד 0.5%) נשארו uncrosslinked, אשר תוקף כי פרוטוקול crosslinking שלנו עושה לא חלבון המטרה Crosslink למולקולות המקיפות אקראיות. בפרט, 0.2% טיפול פורמלדהיד (איור 3, מסלול 5 ו -6) לא הראה כל מוצרי crosslinked בהשוואה לuncrשליטת osslinked (איור 3, מסלול 1 ו -2), למרות זמן החשיפה ארוך של הסרט, שהצדיק עוד יותר הבחירה של פורמלדהיד 0.2% שלנו בפרוטוקול זה. עם זאת, תמיד צריכים להיות crosslinked עוברי שליטת ה-GFP במקביל לcrosslinking המורכב TUD באותם תנאים ודגימות חלבון ה-GFP השליטה צריך להיות מנוהל על 3% - 7% ג&#39;ל הצעד יחד עם דגימות מורכבות TUD הבאים ה-IP. בנוסף, שניהם מורכב TUD ושליטת GFP המתאים 3% - אזורי ג&#39;ל 7% יש נכרת והוגשו לניתוח ספקטרומטריית מסה כדי לקבוע מועמדים חיוביים כוזבים שיהיו נוכח בשתי להקה מורכבת TUD ושליטת ה-GFP. את האפקטיביות של vivo crosslinking בנקבעו על ידי השוואת חלבון TUD חופשי ומורכב TUD משליטת uncrosslinked ודגימות עוברי crosslinked בהתאמה (איור 2 א). חלבון TUD חינם מעוברי שליטת uncrosslinked כמעט exclusively נדד על פני 3% - גבול 7% עם כמות מינימאלית נשמרה בסמוך לאזור הגבול (איור 2 א &#39;, מסלול 1). בניגוד לכך, את עוברי crosslinked הראו הנוכחות של קומפלקס crosslinked משקל מולקולרי הגדול TUD ב3% - 7% גבול ג&#39;ל (איור 2 א &#39;, מסלול 2). זה הראה באופן ברור כי הליך crosslinking crosslinked בהצלחה כ 50% בסך הכל חלבון TUD עם in vivo שותפיה אינטראקציה (השווה מסלול איור 2 א 1 ו -2). Elution התחרותי עם HA-peptide אישר את הטיהור המוצלחת וחיזק את הספציפיות של החלבון המורכב TUD המטוהרים (איור 2). שבריר elution ידי HA-peptide הכיל המורכב התרכז סביב 3% - אזור גבול 7% וגם חלבון TUD חופשי (איור 2 ב, מסלול 1). חיץ מדגם SDS הבא eluted בעיקר בחינם TUD שנותר על חרוזים וכמות מזערית של מתחם TUD ( <s<html> טרונג&gt; תרשים 2B, מסלול 2). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51387/51387fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51387/51387fig1.jpg" /> . איור 1 תרשים של 3% -. ג&#39;ל שלב 7% משמש ל- SDS 3% - 7% ג&#39;ל הצעד הוא להפיל באופן ידני בצורה כזאת שהוא מכיל שלוש שכבות. מלמעלה עד למטה, שכבות אלה הן 3% ג&#39;ל ערימה, 3% ג&#39;ל הפרדה ו7% ג&#39;ל הפרדה. כדי לעבוד עם מערכת ה-Mini-משנה הצורה (Bio-Rad) המשמשת בכתב היד הזה, את הגובה של 3% ג&#39;ל ההפרדה היה עשוי להיות כ 1 סנטימטר כמתואר בתרשים. הערה: 3% ג&#39;ל לערום ושכבות ג&#39;ל המפרידות 3% הם מאוד שבירים כל כך להשתמש בזהירות בעת הטיפול בג&#39;ל כדי למנוע עיוות של שכבות אלה. &quot;Src =&quot; upload/51387/51387fig2highres.jpg / files/ftp_upload/51387/51387fig2.jpg &quot;/&gt; . איור 2 תוצאות כתם מערביות של עוברי crosslinked ועוברים בקרת lysates וטיהור של חלבון מורכב טיודור ידי ה-IP לוח, מסלול 1, lysate חלבון הגולמי של עוברי שליטת uncrosslinked.; מסלול 2, lysate חלבון גולמי מעוברי crosslinked פורמלדהיד. לוח ב &#39;, מסלול 1, elution ידי HA-peptide לאחר IP מlysate עובר crosslinked; מסלול 2, elution ידי 2 x חיץ מדגם SDS לאחר elution HA-פפטיד הראשוני. SDS-PAGE נדרס ב200 V ל3.5 שעה. נוגדן אנטי HA (1:1,000) שימש בכתם מערבי. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51387/51387fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51387/51387fig3.jpg" /> איור 3. תוצאות כתם מערביות של עוברי crosslinked ועוברים בקרה להביע GFP-tagged HA. 1 ליין, o lysate חלבון גולמיו עוברי שליטת uncrosslinked; מסלול 2, זהה למסלול 1, אבל פי שתיים מהסכום; מסלול 3, lysate חלבון הגולמי של עוברי crosslinked באמצעות פורמלדהיד 0.1%; מסלול 4, זהה למסלול 3 אלא פי שתיים מהסכום; מסלול 5, lysate חלבון הגולמי של עוברי crosslinked באמצעות פורמלדהיד 0.2%; נתיב 6, זהה למסלול 5, אבל פי שתיים מהסכום; נתיב 7, lysate חלבון הגולמי של עוברי crosslinked באמצעות פורמלדהיד 0.3%; מסלול 8, זהה לנתיב 7 אבל פי שתיים מהסכום. ליין 9, lysate הגולמי של עוברי crosslinked באמצעות פורמלדהיד 0.5%. SDS-PAGE נדרס ב200 V דקות 45 ב4% - ג&#39;ל שיפוע 15%. נוגדן אנטי HA (1:1,000) שימש בכתם מערבי.

Watch this Scientific Journal Video about An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos at JoVE.com

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן.

In vivo גישת Crosslinking לבודד חלבון מן מכלולים דרוזופילה עוברים

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

an-vivo-crosslinking-approach-to-isolate-protein-complexes-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

16.7K Views.  Murray State University.  קומפלקסי חלבונים מרובים רכיבים ממלאים תפקידים חיוניים בתפקוד ופיתוח סלולריים. כאן אנו מתארים שיטה המשמשת לבודד חלבון מתחמי יליד מעוברי דרוזופילה לאחר in vivo crosslinking ואחריו טיהור של מתחמי crosslinked לניתוח מבנה פונקציה שלאחר מכן. 

Video: An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated through myosin-actin interactions and play an important role in our physiology.  During development, they enable cells to move from one location to the next in order to form the early structures of tissue.  Traction forces help in the healing processes.  They are necessary for the proper closure of wounds or the migration and crawling of leukocytes through our body.  These same forces can be detrimental to our health in the case of cancer metastasis or vascular growth towards a tumor.  The most common method by which to study cells in vitro has been to use a glass or polystyrene dish.  However, the rigidity of the substrates makes it impossible to physically measure cell traction forces, and there are relatively few methods to study traction forces.  Our lab has developed a technique to overcome these limitations.  The method is based on a vertical array of flexible cantilevers, the stiffness and size scale of which are such that individual cells spread across many cantilevers and deflect them in the process.  The pillars we use are 3 &mu;m in diameter, 10 &mu;m tall, and are configured in a regular array with 9 &mu;m center-to-center spacing.  But these physical dimensions can be readily varied to accommodate a variety of studies.  We start with a silicon master, but the final posts are made out of silicone rubber called poly (dimethyl siloxane), or PDMS.  We can measure the deflections under a microscope and calculate the magnitude and direction of traction forces required to produce the observed deflections.  We call these substrates microfabricated post-array-detectors, or mPADs.  Here, we will show you how we fabricate and use the mPADs to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated Post-Array-Detectors mPADs: an Approach to Isolate Mechanical Forces

In this video, we demonstrate how to fabricate and utilize microfabricated post array detectors (mPADs) to assess modulations of cellular contractility.

Microfabricated פוסט מערך גלאים (mPADs): גישה לבודד כוחות מכניים

In this video, we will present our approach to measure cellular traction forces using a microfabricated array of posts.  Traction forces are generated ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in buoyant density. However, when cells are disrupted prior to centrifugation, proteins and organelles in this non-native environment often inappropriately stick to each other. Here we describe a method to separate organelles by density in intact, living Drosophila embryos. Early embryos before cellularization are harvested from population cages, and their outer egg shells are removed by treatment with 50% bleach. Embryos are then transferred to a small agar plate and inserted, posterior end first, into small vertical holes in the agar. The plates containing embedded embryos are centrifuged for 30 min at 3000g. The agar supports the embryos and keeps them in a defined orientation. Afterwards, the embryos are dug out of the agar with a blunt needle. Centrifugation separates major organelles into distinct layers, a stratification easily visible by bright-field microscopy. A number of fluorescent markers are available to confirm successful stratification in living embryos. Proteins associated with certain organelles will be enriched in a particular layer, demonstrating colocalization. Individual layers can be recovered for biochemical analysis or transplantation into donor eggs. This technique is applicable for organelle separation in other large cells, including the eggs and oocytes of diverse species.

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

We describe a method to separate organelles by density in living Drosophila embryos. Embryos are embedded in agar and centrifuged. This technique yields reproducible separation of major organelles along the anterior-posterior embryo axis. This method facilitates colocalization experiments and yields organelle fractions for biochemical analysis and transplantation experiments.

In-vivo צנטריפוגה של עוברים תסיסנית

A major strategy for purifying and isolating different types of intracellular organelles is to separate them from each other based on differences in ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos. In brief, a large amount of staged embryos from young and healthy flies are collected, sterilized, and then physically dissociated into a single cell suspension using a glass homogenizer. After being plated on culture plates or chamber slides at an appropriate density in culture medium, these cells can further differentiate into several morphologically-distinct cell types, which can be identified by their specific cell markers. Furthermore, we present conditions for treating these cells with double stranded (ds) RNAs to elicit gene knockdown. Efficient RNAi in Drosophila primary cells is accomplished by simply bathing the cells in dsRNA-containing culture medium. The ability to carry out effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical, cell imaging analyses, will allow a variety of questions to be answered in Drosophila primary cells, especially those related to differentiated muscle and neuronal cells.

Primary Cell Cultures from Drosophila Gastrula Embryos

We provide a detailed protocol for preparing primary cells dissociated from Drosophila embryos. The ability to carry out the effective RNAi perturbation, together with other molecular, biochemical and cell imaging methods will allow a variety of questions to be addressed in Drosophila primary cells.

תא תרבויות ראשי מ תסיסנית Gastrula עוברים

Here we describe a method for preparing and culturing primary cells dissociated from Drosophila gastrula embryos.   In brief, a large amount of staged ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a variety of neurodegenerative diseases, understanding microtubule based motor transport and its regulation will likely ultimately lead to improved therapeutic approaches. Kinesin-1 is a eukaryotic motor protein which moves in an anterograde (plus-end) direction along microtubules (MTs), powered by ATP hydrolysis. Here we report a detailed purification protocol to isolate active full length kinesin from Drosophila embryos, thus allowing the combination of Drosophila genetics with single-molecule biophysical studies. Starting with approximately 50 laying cups, with approximately 1000 females per cup, we carried out overnight collections. This provided approximately 10 ml of packed embryos. The embryos were bleach dechorionated (yielding approximately 9 grams of embryos), and then homogenized. After disruption, the homogenate was clarified using a low speed spin followed by a high speed centrifugation. The clarified supernatant was treated with GTP and taxol to polymerize MTs. Kinesin was immobilized on polymerized MTs by adding the ATP analog, 5'-adenylyl imidodiphosphate at room temperature. After kinesin binding, microtubules were sedimented via high speed centrifugation through a sucrose cushion. The microtubule pellet was then re-suspended, and this process was repeated. Finally, ATP was added to release the kinesin from the MTs. High speed centrifugation then spun down the MTs, leaving the kinesin in the supernatant. This kinesin was subjected to a centrifugal filtration using a 100 KD cut off filter for further purification, aliquoted, snap frozen in liquid nitrogen, and stored at -80 &deg;C. SDS gel electrophoresis and western blotting was performed using the purified sample. The motor activity of purified samples before and after the final centrifugal filtration step was evaluated using an in vitro single molecule microtubule assay. The kinesin fractions before and after the centrifugal filtration showed processivity as previously reported in literature. Further experiments are underway to evaluate the interaction between kinesin and other transport related proteins.

Isolation and Purification of Kinesin from Drosophila Embryos

This is a protocol to isolate active full length Kinesin from Drosophila embryos for single-molecule biophysical studies. We show how to collect embryos, make the embryo lysate, and then polymerize microtubules (MTs). Kinesin is purified by immobilizing it on the MTs, spinning down the Kinesin-MT complexes, and then releasing the kinesin from the MTs via ATP addition.

בידוד וטיהור של kinesin מ תסיסנית עוברים

Motor proteins move cargos along microtubules, and transport them to specific sub-cellular locations. Because altered transport is suggested to underlie a ...