אנו מודים לג Højer לקריאה ביקורתית של כתב היד, ב &#39;ינגול (Genentech) להשתתפות בקריינות תסריט, נ&#39; ביין-Ly על שיתוף החוויה של הדמיה כלי דם משופרת עם הזרקה לוריד זנב של צבע לקטינים, ו-M Solloway (Genentech ) לעכברים משמשים בהדמיה לבלב. שורת ה-GFP-M נוצרה על ידי ג &#39;יי סאנס (אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) ועכברי CX3CR1-GFP על ידי ר&#39; ליטמן (NYU). העבודה נתמכת על ידי Genentech, Inc

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות IACUC (הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש) על עכברים ~ ישנים 3-5 חודשים. המחבר מצהיר שום אינטרסים כלכליים מתחרים. 1. בעלי החיים זלוף והכנת רקמה עיתוי: 30-60 דקות לכל עכבר + לפרסם קיבעון-(כמה שעות עד לילה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעלי החיים ולהרדים באמצעות קטמין (80-200 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (7-20 מ&quot;ג / קילוגרם) או Avertin 2.5% (0.5 משקל גוף ml/25 g-IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן מספר דקות להרדמה ייכנס לתוקף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את הבוהן והזנב של בעלי החיים על מנת לוודא כי בעל החיים הוא בהרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה הראשון ב RT עם 0.1 M פוספט חוצץ (PB) או 0.1 M פוספט הצפת מלוח (PBS) עבור 5-10 דקות עד הדם נמחק לחלוטין מהרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף לפתרון מקבע: PFA 4% ב 0.1 M PB (או 0.1 M PBS) ולהמשיך זלוףעם PFA 4% עבור 30-40 דק &#39;במהירות של 3 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האיבר / s של עניין בזהירות מבלי לפגוע, למשל, להימנע מניקוב ולסחוט את הרקמות שנמצא בגזורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקמה נוספת המקיפה את האיברים (רקמת חיבור, קרומי המוח או עניין הדורה) בצלחת פטרי מלאה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את האיברים PFA 4% במשך כמה שעות או הלילה ב 4 º C. הימנע הודעה קיבעון ארוך בגלל PFA עלול להרוות את האות או להגדיל את שעות נוספות autofluorecense 10 במיוחד עבור ערוץ ה-GFP (אשר מהווה בעיה פחותה בערוצים אדומים אדומים וכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האיברים 2-3x עם PBS ב RT ממש לפני שמתחיל את הליך הסליקה. </li></ol> 2. סליקת רקמות עיתוי: 2-3 שעות לאיברים קטנים ו1-4 ימים לאיברים גדולים. הערות: ניאון התיוג של הרקמות על ידי ביטוי transgene, transfection הנגיפי, התחקות צבע או אנטיתיוג הגוף אמור להסתיים לפני ניקוי. כל צעדי סליקת הרקמה מבוצעים ב RT. פתרונות הסליקה THF, DBE, באב (בנזיל אלכוהול חלק 1 ותכשיר 2 חלק) וdichloromethane הם רעילים ושאיפה יש להימנע (ניסויי התנהגות במנדף מאוורר כראוי) ומגע ישיר עם עור (כפפות nitrile שימוש). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50% (כרך / כרך), 70%, ודילולי THF 80% במים מזוקקים בבקבוקי זכוכית נפרדים כדלקמן: לTHF 50%, למשל, לערבב 25 THF מיליליטר ו25 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית עם נפח של גדול מ50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי פתרונות רועדים את הבקבוק לדקות 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית בקבוק הזכוכית בצורה ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לסגור את הבקבוקים ולשמור על פתרונות העבודה בארון חשוך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אל תשתמשו בפתרוני עבודה באותו זמן רב יותר מאשר 1-2 שבועות. לכן, להורות על פתרונות הסליקה כמו הנפח הקטן ביותר העומד לרשות להיות ריאגנטים המניה טריים שימוש מסוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">למלא את צלוחיות זכוכית (למשל, מיליליטר 2-3) עם פתרון הסליקה הראשון, 50% THF, ולהעביר את האיברים מPBS לתוך צלוחיות זכוכית להתחיל סליקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לסגור את צלוחיות זכוכית עם המכסים שלהם ולהשתמש מסובב (למשל, stirrer גלגל) לערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות ולשמור על צלוחיות זכוכית בחושך. התחל המסובב לעורר דגימות בצלוחיות הזכוכית לזמן המצוין (טבלת 1) במהירות קבועה (~ 30V סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הסליקה ולהוסיף את הבאה בפרוטוקול כאשר הזמן בטבלה 1 הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את פסולת הסליקה לתוך מכולות פסולת זכוכית שנשמרות במכסת מנוע. חזור על שלב קודם עבור כל פתרון סליקה בפרוטוקול ועד הסוף. השתמש פיפטה פסטר חדשה כאשר פתרון סליקה חדש נוסף (למשל, שינוי מTHF לDBE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הסליקה הסופי עם באב או DBE, ניתן להאריך פעמים הדגירה או shortened עד הדגימות להיות שקופות לחלוטין באור הנראה (או צהבהבים / שקופה אם זה הוא רקמה גדולה מאוד כמו מוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את האיברים פינו בפתרון הסליקה הסופי בכל העת, כולל צעדי ההדמיה. </li></ol> 3. הכנת איברים הותרו להדמיה עיתוי: 5-15 דקות. הערה: תמונת האיברים פינו בהקדם סליקה מלאה מושגת. לשם כך, בצע את השלבים הבאים כדי להכין את הדגימות במיקרוסקופ אור גיליון (למשל, Ultramicroscopy) או הדמיה מיקרוסקופיה confocal / רב פוטון. הערה: איברים כחכחו יהיו רופפים כוח פלואורסצנטי שלהם לאורך זמן (במיוחד חלבוני ניאון למשל, GFP, תיוג נוגדן הוא עמיד יותר ואולי אפילו לתת תוצאות טובות יותר עם ​​incubations יותר). עבור הדמיה, ניתן להשתמש בם כל עוד טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שונות כמו טיפול נאות של האיברים בקליאהפתרון טבעת מושגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ אור גיליון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום או הר המדגם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את האיבר פונו על ידי סיבוב הבורג של בעל מדגם 4 באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הדגימה לחדר ההדמיה (רצוי מזכוכית) של מיקרוסקופ thelight גיליון כי הוא מלא באב או DBE, מה שיהיה בשימוש בצעד הסליקה הסופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה פוטון / confocal הרב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את המדגם על שקופיות הדמיה (או חדר הדמיה) עם פתרון ההדמיה הסופי כדי להיות מסוגל תמונה עם פוטון רב או confocal, אשר משתמשים בשמן או מטרות מים שקועים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק דנטלי כדי להפוך את גבול מסביב לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הבריכה עם באב או DBE ממש לפני מלט שיניים מקבל נוקשה באופן מלא. הערה: מלט השיניים מתמצק במהירות; לתרגל כמה פעמים כדי להכיר אותו לפני שאתה מנסה את הדגימות בפועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקוםהמדגם פינה באמצע הבריכה ולכסות אותו עם כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מכסה הזכוכית עד שהוא אטום לחלוטין על ידי מלט שיניים ונוגע על פני השטח של האיבר מסומן, אשר יאפשר להגיע לעומק המרבי הדמיה על ידי מיקרוסקופית רב פוטון / confocal. הערות: הדבר מבטיח כי אין פתרון סליקה יישפך במהלך ההדמיה. הימנע מטבילת עדשת ההדמיה ישירות לתוך פתרון סליקה, אשר יכולה לפגוע בעדשה, אלא אם כן הוא עמיד בפני באב / DBE או שיש כיסוי מגן. </li></ol></li></ol> איברים 4. הדמיה כחכחו עיתוי: 15-45 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף Z-סריקה מכסה את הרקמה כולה פינתה (אם העדשה בשימוש מאפשרת) ברזולוציה הטובה ביותר שיכול לספק המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרב על האזורים של עניין כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהות יותר. </li></ol> 5. בחינה של נתונים עם תוכנת עמירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תמונת סרייהשל תוכנת עמירה עם מודול ResolveRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את גדלי voxel הנכונים בחלון &quot;תמונה קראו פרמטר&quot; ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Multi פלנר תצוגה&quot; תת היישום. לאחר מכן השתמשתי במחוון &quot;עובי&quot; כדי לבחור את הסף האופטימלי לערכים האפורים, התאמת ערכי 2D and 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את המדגם על ידי גלישה בפרוסות באורינטציות 2D שונות ובאמצעות מודול יבול פינה בתצוגת 3D. הערה: ניתן למצוא מדריך לפתרון בעיות מפורט בפרוטוקול באל Ertürk et 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ome+sweet+ome:+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome.">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li><li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy.">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li><li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket.">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li><li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegenerative+disease.">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li><li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Disease:+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice.">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy.">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pr&#228;paraten. , (1903).</li><li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury.">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li><li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+alterations+in+human+Alzheimer's+disease+following+Abeta42+immunization.">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li><li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich's+ataxia:+A+case+study.">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury.">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li></ol>

אין מה לחשוף.

שיטות ניקוי רקמות מטרתם להפחית את הפיזור של ההדמיה אור על ידי מדדי השבירה של שכבות רקמה שונות המתאימות באיברים מסומן. כתוצאה מכך, אור ההדמיה יכול לחדור עמוק לתוך רקמות ולגרות את התאים / מולקולות שכותרתו. הרעיון הישן הזה של רקמת ניקוי 17 זכה לתשומת לב הולך וגדל לאחר היישום הראשון המתוחכם של הטכניקה על מוח עכבר בשלמות על ידי Dodt ועמיתים 2. מאז, יש רשימה הולכת וגדלה במהירות של שיטות סליקה חדשות כולל 3DISCO, SCA / דואר, ClearT2, בהירות וSeeDB 3,4,7,18-20. בעיקרו של הדבר, כל מה שהם שואפים להפוך את האיברים שקופים להדמית רקמות עמוקה על ידי שמירה על תווית הניאון. ביניהם, 3DISCO בולט כאחת השיטות פשוטות ולשעתק ביותר. זה לעומת מהיר יחסית לשיטות אחרות סליקה שהוזכרו לעיל (1-5 ימים לעומת 2-3 שבועות למוחות בוגרים, בהתאמה) 21. זה כבר היה הצלחהמיושם באופן מלא לאיברים שונים כגון המוח, חוט השדרה, בלוטות לימפה, טחול, ריאות, גידולים מוצקים, לבלב, ובלוטות החלב 3,4,9. בנוסף, מספר פרסומים על ידי קבוצות מחקר עצמאיות שכבר השתמשו בשיטה זו כדי להשיג תוצאות ההדמיה 22,23. עם זאת, נהלי סליקת רקמות שונים יכולים להיות יתרון עבור תנאים שונים. לדוגמא, בעוד SCA / דואר וSeeDB חלים הטובים ביותר על רקמות עוברי 6,7, הם שיטות סליקה על בסיס מים, שיכול להיות קל יותר לטפל במהלך הדמיה. לעומת זאת, בהירות היא שיטת סליקה מסובכת ויקרה. אבל זה יכול להיות יתרון בהקשר של תיוג נוגדן, בעיקר ברקמות גדולות כגון מוח 8. השלב הקריטי ביותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהדמית 3DISCO הוא תיוג רקמות, שנעשה לפני סליקת הרקמות. זה חיוני כדי להתחיל עם אות הניאון החזקה ביותר האפשרית. זה יכול bדואר שהושג בדרכים שונות, כולל ביטוי מהונדס של חלבוני ניאון, התחקות על ידי צבעים סינטטיים, transfection הנגיפי או תיוג נוגדן. יש לזכור כי כל הליך סליקה יפחית את אות הניאון של הרקמות. לפיכך, אם אות הניאון היא לא מספיק חזקה בהתחלה - כלומר הוא לא ניתן לגילוי בקלות לפני הסליקה ההדמיה של הרקמות פינו יספק תוצאות עניות. ישנן מספר מגבלות סליקת שיטות שמחכות לשיפורים. מגבלה קריטית היא שמאז ריאגנטים סליקה לשנות את המבנה של האיברים התפזרו, הם לא יכולים לשמש ברקמה חי. לפיכך, יש לבצע ניסויים כגון עם mEos2 photoactivatable 24 לפני תיקון והסליקה. על הסליקה, הדמיה ברזולוציה סופר של אות הניאון מחלבונים בהירים וphotostable הופכת לאפשרית. בנוסף, בגלל פרוטוקול הסליקה פוחתאינטנסיביות של חלבוני הניאון, לא ניתן לאחסן האיברים פינו לתקופות ממושכות. חשוב לציין כי חלק מהאיברים הם יותר קשים להיות מסומנות. במיוחד, אם האיברים גזורים לשמור על כמויות גבוהות של תאי דם (למשל, טחול, כבד), שהם קשים יחסית כדי לנקות ותמונה. זה גם יחסית קשה יותר להשגת סליקה מלאה לרקמות גדולות, כגון מוח מכרסם מבוגר. רקמות כגון ייתכן שתצטרכנה פעמים דגירה ארוכות יותר, אשר יכולה, מצד שני, להפחית את אות הניאון. בנוסף, פיתוח של שיטות מיקרוסקופית שיכול איברים גדולים ושקופים תמונה בבת אחת ברזולוציה גבוהה הוא צורך מחכה שיפנו אליו. מגבלה נוספת חשובה של הטכניקה היא תיוג רקמות. בעוד אות ניאון חזקה באמצעות ביטוי גנטי או וירוס היא אידיאלית, לא בכל תא או מולקולה יכול להיות מתויג גנטי או באופן ויראלי. מצד השני, תיוג נוגדן של רקמות עבות הוא לא הליך פשוט או אפילו לא פוssible ברוב המקרים. זה אולי צריך פרוטוקולי permeabilization מיוחדים וזמני דגירה ארוכה (מספר ימים עד מספר שבועות) 3. כמו כן, חשוב לזכור כי הרקמות להתכווץ ~ 20% בכל ממד (נמדד לרקמת חוט השדרה) לאחר ניקוי בעיקר עקב התייבשות וdelipidation. הצטמקות זו מתרחשת ratiometrically וצריכה להיות מתוקנת בצעדי כימות. כפי שנצפה בתוצאות שהוצגו, המבנים שכותרתו fluorescently נותרו על כנן, המהווה את אינדיקציה לתקינות חלבון ברקמות מסומנות. בגלל האופי ההידרופובי של הרקמה פינתה הסופית, זה לא יכול להיות מוכתם נוסף עם נוגדנים או מוטבע בפתרונות מים המכילים למשל, Focusclear-המשמש בגליצרול CLARITY-או 80%. לבסוף, זה אתגר לנתח גדלים מכריעות של נתוני הדמיה. לדוגמא, כאשר המוח עכברי כולו נסרק ברזולוציה סלולרית, זה יהיה קשה מאוד להתחקות אחר ולכמת str הרצויuctures (למשל, עצבי או רשתות גליה) ולהשוות על מדגמים שונים באופן אוטומטי. לסיכום, בעוד שחוקרים שואפים לגלות שיטות סליקה חדשות, האתגרים השונים לעיל (קושי בניקוי רקמות מגוונות, הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים גדולים יותר, וניתוח נתונים מסובך) יש לשפר במקביל. לסיכום, טכניקות ניקוי רקמות שפותחו לאחרונה, כולל 3DISCO, אלגנטיות להוכיח כי 3D הדמיה ברזולוציה גבוהה של איברים שלמים עכשיו זה אפשרי. שימוש בשיטות אלה, מדענים יכולים להשיג מידע האנטומי של תאים ומולקולות באיבר שלם. מחקרי אלה חלוצי 3D הדמיה על איברים שקופים לעורר מספר גדל והולך של חוקרים לפענח אנטומי מורכבות וארגונים מולקולריים של רקמות / איברים בהית ומחלות.

הבדיקה היסטולוגית של רקמות ביולוגיות היא גישה בסיסית בהבנת טבעו של מולקולות / תאים בהקשר הטבעי שלהם. באופן אידיאלי, הדמיה ברזולוציה גבוהה של כל האיבר היא אינפורמטיבי ורצוי ביותר. מכיוון שהאור יש לו עומק חדירה מוגבל, בשל פיזור 1, איברים קבועים צריכים להיות מחולקים על מנת לבצע הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה. לפיכך, רוב מחקרי היסטולוגיה מבוצעים על סעיפי רקמות כמה שמייצגים רק חלק קטן מהאיבר. בחלק מהמחקרים, למשל, אלה במטרה לאתר את קשרים עצביים במוח או בחוט השדרה, כל חלקי הרקמות מאברי המטרה נאספים וצלמו לשחזור 3D. עם זאת, יש חתך רקמות וההדמיה הבאה של קטעים בודדים מגבלות שונות. אלה כוללים זמן להיות רב ומובילים לשחזור 3D לא מושלם של הרקמה, עקב עיוותים מכאניות וקשהies ביישור של התמונות שהתקבלו. לאחרונה, איברים שקופים ללא פגע סליקה וההדמיה פותחו כפתרון משמעותי לזה חסרון 2,3. עם הקרחת, כל האיבר הוא שניתנו שקוף המאפשרים את אור ההדמיה לנסוע מקצה לקצה (איור 1) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של איבר unsectioned באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר כגון מיקרוסקופ או פוטון אור גיליון רב ( איור 2). קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולי סליקת רקמה חדשים כדי להיות מסוגל תמונת רקמת עניין שלהם למטרות שונות. אלה כוללים ממס אורגני 2-5, 6,7 המים ואלקטרופורזה 8 פרוטוקולי סליקה מבוסס. ביניהם, הדמיה 3 ממדים של ממס פינתה איברים או 3DISCO הוא פרוטוקול ישים בקלות על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל מערכת עצבים מרכזית איברים (CNS), איברים חיסוניים וגידולים מוצקים. בadditיון, ניתן לשלב אותו עם שיטות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופ אור גיליון הקרינה (LSFM), פוטון רב ומיקרוסקופי סריקת לייזר confocal. 3DISCO מבוסס על ניקוי עם חומרים כימיים זמינים ולא יקרים כגון tetrahydrofuran (THF) ואתר dibenzyl (DBE) 4. כל הפרוטוקול יכול לקחת קצר ככל 3-4 שעות. לפיכך, 3DISCO היא טכניקה חזקה ומהירה בהשוואה לשיטות מסורתיות היסטולוגית שעשויים להימשך שבועות עד חודשים כדי להשלים 9.

<table><tbody><tr><td>Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>CX3CR1 GFP mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Littman lab at NYU.</td></tr><tr><td>TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td><td></td><td></td><td>Can be obtained from Jackson.</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7917-16</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt</td><td>7892-04</td><td></td></tr><tr><td>2-2-2 Tribromoethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>152463</td><td>Used to prepare Avertin solution.</td></tr><tr><td>Saline</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrahydrofuran</td><td>Sigma</td><td>186562-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Sigma</td><td>270997-12X100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzyl ether</td><td>Sigma</td><td>Sigma, 108014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl alcohol</td><td>Sigma</td><td>305197-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Benzyl benzoate</td><td>Sigma</td><td>B6630-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Lectin FITC</td><td>Sigma</td><td>L0401-1MG</td><td></td></tr><tr><td>anti-CC10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9772</td><td>0.388888889</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>APP pharmaceuticals</td><td>504001</td><td>Used in perfusion.</td></tr><tr><td>Glass vials</td><td>VWR</td><td>548-0554</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Mini Rotator</td><td>VWR</td><td>100498-878</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum Foil</td><td>Fisherbrand</td><td>01-213-104</td><td></td></tr><tr><td>100 ml Media Storage Bottles</td><td>Kimax Media Bottles</td><td>EW-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>Minipuls evolution perfusion pump with MF4* medium flow pump head</td><td>Gilson, Inc</td><td>F110701 and F117606</td><td></td></tr><tr><td>Microscopy slide</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>FastWell</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>FW20</td><td></td></tr><tr><td>Cover slip</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>Glass petri dish</td><td>Corning Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Dental cement</td><td>Lang Dental</td><td>1223PNK</td><td></td></tr><tr><td>Quantofix Peroxide Test Strips</td><td>Sigma</td><td>37206</td><td></td></tr><tr><td>Amira with RT resolve microscopy module</td><td>Visage Imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane imaging</td><td>image analysis software</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>freeware</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

הנוירונים מקוטבים מאוד תאים עם מורפולוגיה ארוכה מאוד. הפונקציה שלהם תלויה בקשרים שהם יוצרים בין אחד לשני ועם רקמות אחרות. לפיכך, מיפוי המבנה הארגוני של נוירונים הוא מאוד חשוב על מנת להבין איך הם מתפקדים בבריאות ובחוליים. עם זאת, התחקות קשרים עצביים עצומים כאלה ברחבי connectomics כל העצבים בשם מערכת לאחרונה 11 - עדיין נשארת אחד האתגרים הקשים ביותר במדעי המוח. לשם כך, גם באיחוד האירופי 12 ו13 ארה&quot;ב יזמו פרויקטים גדולים למפה המוח האנושי. בעוד 3DISCO יכול להיות מועסק על איברים שונים, זה כבר שימושי במיוחד כדי לעקוב אחר קשרים עצביים ארוכים בחוט השדרה והמוח. לדוגמא, באמצעות סריקות Ultramicroscopy של מגזרי חוט השדרה פינו גדולים, ניתן בעקבות קשרי אקסון מעל סנטימטרים בחוט השדרה של המכרסמים (איור 2). באופן דומה, המוח כולו פינה העכבר (איור 3 א) וההיפוקמפוס (3 ב איור) ניתן הדמיה לעקוב קשרים עצביים במוח. כאשר פוטון מיקרוסקופיה confocal או רב משמשת באיברים מסומן, ההדמיה ברזולוציה ניתן לשפר באופן משמעותי, במיוחד בZ-ממד. לדוגמא, הדמיה פוטון רב של מיתרי השדרה פינו מעכברי ה-GFP-M קו (איור 4 א) משיגה תמונה חלקה לאורך כל העומק (~ 1.5-2 מ&quot;מ) של חוט השדרה. microcopy confocal על חוט השדרה פינה מספק רזולוציה משופרת באופן דומה (4 ב דמויות וג). הדמיה מיקרוסקופית פוטונים רב של מוח פינה מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד כדי להמחיש פרטים קטנים של מבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (איור 5). הדגימות ל3DISCO יכולות להיות מתויגות בדרכים שונות, כולל ביטוי transgene, virtransfection אל, התחקות צבע וסימון נוגדן. לדוגמא, ניתן לתייג את כל כלי הדם במוח (6 א דמויות וב) וחוט השדרה (6 ג דמויות וד) באמצעות קליעים נותבים ניאון קטינים מצומדת 4, אשר יכול לשמש כדי לחקור דם למוח, המחסום (BBB ) בבריאות ובחוליים. מיקרוגליה והאסטרוציטים שניהם מעורבים מאוד בפתולוגיה של ניוון מוחיים כולל המחלות אלצהיימר ופציעות טראומטיות 14,15. שימוש 3DISCO, ניתן ללמוד בצפיפות וההפצה בחוט השדרה (איור 7) או במוח שלהם. יכולות גם להיות צילמו רקמות שאינן עצביות. לדוגמא, תאי קלרה הריאות מכרסמים כל ניתן immunolabeled עם נוגדנים וצלמו ללא חתך ברמת תא בודדת (איור 8). באופן דומה, אפשר לנקות ותאי תמונה למשלתאי אלפא ברקמת לבלב unsectioned (איור 9). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. סליקת רקמת 3DISCO הופכת רקמות unsectioned שקופות להדמית רקמות עמוקה. (ב) רקמות חוט השדרה בערפול (א) ופינו כפי שניתן לראות באור הנראה. על הסליקה, מיקרוסקופית סריקת לייזר רקמות עמוקות הופך לאפשרי. (ג) רקמות חוט השדרה בערפול ופינו היו הדמיה על ידי מיקרוסקופ 2 פוטונים. סולם ברים ב, b = 0.5 מ&quot;מ ובc = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. ההדמיה 3DISCO של חוט השדרה לעקוב סיומות אקסון. חוט השדרה גזור מן השורה Thy-1 מהונדס GFP עכבר (GFP-M) מחולק לחתיכות קטנות יותר (~4 מ&quot;מ). לאחר ביצוע פרוטוקול סליקה לרקמות קטנות (טבלה 1) מיתרי השדרה השקופים היו דמיינו באמצעות Ultramicroscopy. שחזורי 3D של קטע עמוד השדרה ~ 4 מ&quot;מ אופקי (א), העטרה (ב) והשקפת sagittal (ג). (ד) נציג לייחס אקסונים (אדום) מוצגים בתצוגה שקופה בגווני אפור. (ה) צפה בהגדלה גבוהה של האזור שצוין ב( ד). סולם ברים בA, B, C, D = 0.5 מ&quot;מ ובדואר = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. ההדמיה 3DISCO של מוח וההיפוקמפוס פינה. דוגמאות של מוח והיפוקמפוס של עכברי ה-GFP-M פינה הם צילמו עם אולטרה. פריטים חזותיים 3D של המוח כולו () וההיפוקמפוס (ב) הוכחת netwo העצביRKS ברקמות שקופות הדמיה. סולם ברים ב= 2 מ&quot;מ ובb = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. סליקת רקמות משפרת את הרזולוציה המתקבלת על ידי פוטונים רב ומיקרוסקופיה confocal. מגזרי חוט השדרה שקופים מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב (א) או confocal (ב, ג). שים לב שהניקוי באופן משמעותי משפר את הרזולוציה ועומק הדמיה חושף את המבנה העדין של אקסונים ודנדריטים. סולם ברים ב= 100 מיקרומטר ובb, c = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. ההדמיה 3DISCO של קוצים הדנדריטים. רקמת מוח שקופה מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב. פריטים חזותיים 3D של אזור קליפת המוח הסרוקים מוצגים בverפרספקטיבות tical (א) ואופקיות (ב). (ג) ~ 50 מיקרומטר הקרנה מהרמות שצוינו ב( a, b). הגדלה (ד) גבוהה באזור מצויינים ב( ג) הממחיש את הפרטים הקטנים של המבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (ראשי חץ). סולם ברים ב= 50 מיקרומטר, בb, c = 25 מיקרומטר, בד = 5 מיקרומטר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. 3DISCO של כלי דם. כדי לתייג את כלי דם בכל האיברים, צבע לקטינים-FITC שימש במהלך זלוף (לפני הסליקה) כמתואר 16. ראוי לציין להזכיר כי מצאנו כי הזרקה לוריד זנב של נותב נותנת אות טובה יותר זלוף לב של נותב. לאחר איסוף המוח הקבוע וחוט שדרה, הם פונו ואנימאגד ידי Ultramicroscopy. 3D להדמיה של כלי הדם במוח עכבר כולו בHeatmap (א) ואפורה בקנה מידה (א). (ב) להדמיה 3D של כלי הדם של קטע עכבר חוט השדרה בHeatmap (ג) ואפורה בקנה מידה (ד). Heatmaps נוצרו בהתבסס על עוצמת צביעה לקטינים; כחול: בעצימות נמוכות (ברקע) ואדום: בעוצמה גבוהה (כלי דם). סולם ברים ב= 2 מ&quot;מ, מ&quot;מ b = 1, וג, ד = 250 מיקרומטר. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. 3DISCO של תאי גליה ברקמת מערכת העצבים המרכזית מסומנת. מיתרי השדרה של עכברים הטרנסגניים להביע GFP במיקרוגליה TgH (CX3CR1-EGFP) או האסטרוציטים TGN (hGFAP-ECFP) פונו וצלמו על ידי מיקרוסקופ פוטון רב. 3D טיוח של מיקרוגליה מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה ( <sטרונג&gt; ב). (ג) היטל אופטי (~ 50 מיקרומטר) מוצג כדי להראות את הפרטים של מיקרוגליה בחוט השדרה. 3D טיוח של האסטרוציטים מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה (ב). (ו) השלכה אופטית (~ 50 מיקרומטר) מוצגת כדי להראות את הפרטים של האסטרוציטים בחוט השדרה. סולם ברים בA, B, D, E = 100 מיקרומטר ובC, F = 50 מיקרומטר. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8. 3DISCO של אונת ריאה כל הר עם מכתים נוגדן של תאי קלרה. למכתים נוגדן כל ההר של אונות ריאה, היו perfused נקבות עכברי BALB / C 10 בן השבוע דרך החדר ממני עם PBS כדי להסיר דם מהריאות. ריאות היו מנופחות לאחר מכן עם PFA 4% וקבועים O / N ב RT במקבע לפחות שלוש פעמים את היקף הדואר רקמות. למחרת, הריאות היו שטופה בקצרה בPBS והאונה הימנית הייתה לשים 5 מיליליטר של 1% טריטון X-100 בPBS עבור permeabilization ל48 שעות או עד שהרקמה צנחה. כל stainings בוצעו ב0.2% טריטון X-100 בPBS המכיל 5% FBS ו BSA 2% ושטיפות היו ב0.2% טריטון X-100 ב-PBS. צביעה עם אנטי CC10 הייתה ל72 שעות ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב למשך כ 6 שעות. ניאון תיוג של הנוגדן הראשוני הושג עם נוגדנים משני נגד עיזים-Alexa פלואוריד-594 לילה ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב עבור שעות 6 עד הלילה. למחרת, פונו אונות מוכתמות דרך 50%, 70%, וTHF 80% ל30 דקות כל אחד ואחריו שלושה שוטף 30 דקות בTHF 100%, ואחריו 20 דקות בDCM, ואחריו 30 דקות בDBE. סולם ברים ובb = 1 מ&quot;מ ובc = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> דמות<html> 9. 3DISCO של לבלב. לאחר טפטוף של עכברים כפי שתואר לעיל בפרוטוקול, הלבלב היה גזור ופינה עם הפרוטוקול הקצר. הקרינה נובעת מרקומבינציה ROSA26 LSL tdTomato הנגרמת על ידי טיפול בטמוקסיפן של עכברים שנשאו transgene BAC 200 kb פורש לוקוס גלוקגון עכבר אנדוגני עם CreERT2 מוכנס לתוך ATG של גלוקגון. ראשי החץ לסמן חלק מתאי אלפא כותרת הניאון באיון. סולם ברים ב= מ&quot;מ, B ו-C 1 ובד = 500 מיקרומטר. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> טבלת 1. פרוטוקולי סליקת רקמות לרקמות שונות. דוגמאות לפרוטוקולי סליקת רקמה לרקמות שונות. שים לב כי זמן הסליקה לכל שלב ניתן לקצר או להאריך לפי צורך כדי לשפר את ביצועי הסליקה. המשקל המשוער של רקמות קטנות הוא ~ 20-100 מ&quot;ג והמוח הוא ~ 300-500 מ&quot;ג.ttps :/ / www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO at JoVE.com

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K Views.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

Video: Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and its associated LNs. The CNS-associated lymphatic system is involved in the drainage of CSF macromolecules and meningeal immune cells toward CNS-draining LNs, thereby regulating waste clearance and immune surveillance within CNS tissues. Presented is a novel approach to obtain three-dimensional (3D) and cellular resolution images of CNS-associated lymphatics while preserving the integrity of their circuits within surrounding tissues. The iDISCO+ protocol is used to immunolabel lymphatic vessels in decalcified and cleared whole mount preparations of the vertebral column that are subsequently imaged with light sheet fluorescence microscopy (LSFM). The technique reveals the 3D structure of the lymphatic network connecting the meningeal and epidural spaces around the spinal cord to extravertebral lymphatic vessels. Provided are 3D images of the drainage circuits of molecular tracers previously injected into either the CSF via the cisterna magna or the thoracolumbar spinal parenchyma. The iDISCO+/LSFM approach brings unprecedented opportunities to explore the structure and function of the CNS-associated lymphatic system in neurovascular biology, neuroimmunology, brain and vertebral cancer, or vertebral bone and joint biology.

Three-Dimensional Imaging of the Vertebral Lymphatic Vasculature and Drainage using iDISCO+ and Light Sheet Fluorescence Microscopy

A protocol is presented combining tissue clearing with light sheet fluorescence microscopy (LSFM) to obtain three-dimensional and cellular resolution images of the lymphatic vessels and lymph nodes (LNs) collecting the cerebrospinal fluid (CSF) and spinal epidural fluid.

הדמיה תלת מימדית של כלי הדם והניקוז הלימפטיים החולייתיים באמצעות iDISCO+ ומיקרוסקופית פלואורסצנטית גיליון אור

The lymphatic system associated with the central nervous system (CNS) includes the lymphatic vasculature that spins around the brain, the spinal cord, and ...

Immunology and Infection

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

הדמיה וניתוח של כל המוח החד-תאי של מוחות עכברים שלמים של ילודים באמצעות MRI, ניקוי רקמות ומיקרוסקופיה של יריעות אור

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in biology. Transitional methods require a substantial amount of time and effort to obtain a 3D image and including sectioning the intact tissue, immunolabeling, and imaging serially-sectioned tissue, which produces a loss of information at each step of the process. In recently developed approaches for high-resolution imaging within intact tissue, molecular characterization has been restricted to the labeling of proteins. However, currently available protocols for organ clearing require a considerably long process time, making it difficult to implement tissue clearing techniques in the lab. We recently established a rapid and highly-reproducible protocol termed ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs), which allows for tissue clearance within several hours. Moreover, ACT-PRESTO enables rapid immunolabeling with conventional methods and accelerates antibody penetration into the deep layer of densely-formed, thick specimens by applying pressure or convection flow. We describe how to prepare tissues, how to clear by lipid removal using electrophoresis, and how to immuno-stain by a pressure-assisted delivery. The rapidity and consistency of the protocol will expedite the performance of 3D histological research and volume-based diagnoses.

ACT-PRESTO (active clarity technique&#8211;pressure related efficient and stable transfer of macromolecules into organs) enables rapid, efficient, but inexpensive tissue clearing and rapid antibody penetration into cleared tissues by passive diffusion or pressure-assisted delivery. Using this method, a wide range of tissues can be cleared, immunolabeled by multiple antibodies, and volume-imaged.

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Biology

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה חד-תאית של אורגנואידים שלמים

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Imaging the Gut with "CLARITY"

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving acrylamide embedding to delipidate tissue (without sectioning) and to preserve the 3-D tissue structure for immunostaining. The technique is highly relevant in imaging the dynamic gut environment where different cell types interact during homeostasis and disease states. This method optimized for the mouse gut is described here, which helps to trace cell types like epithelia, enteroendocrine, neurons, glia, and the neuronal projections into the epithelia or enteroendocrine cells that mediate microbial sensing or nutrient chemo sensing respectively. The gut tissue (1-1.5 cm) is fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &#176;C overnight on day 1. On day 2, PFA is discarded, and the tissue is washed thrice with PBS. The tissue is hydrogel embedded to preserve its integrity by incubation in 4% hydrogel (acrylamide) solution in PBS (diluted from 30% ProtoGel) overnight at 4 &#176;C. On day 3, the tissue-hydrogel solution is incubated at 37&#160;&#176;C for 1 h to allow hydrogel polymerization. Tissue is then washed thrice gently with PBS to remove excess hydrogel. The subsequent step of delipidation (clearing) involves tissue incubation in sodium dodecyl sulfate (8% SDS in PBS) at 37 &#176;C for 2 days (days 4 &#38; 5) on a shaker at room temperature (RT). On day 6, the cleared tissue is thoroughly washed with PBS to remove SDS. Tissue can be immunostained by incubation in primary antibodies (diluted in 0.5% normal donkey serum in PBS containing 0.3% Triton X-100), overnight at 4&#176;C, and subsequent incubation in appropriate secondary Alexa Fluor antibodies for 1.5 h at RT, and nuclear staining with DAPI (1: 10000). The tissue is transferred onto a clean glass slide and mounted using VectaShield for confocal imaging.

We describe the protocol for passive CLARITY (PACT) staining of mouse intestine to enable visualization of subepithelial tissues, including neurons, glia and enteroendocrine cells (EEC) without tissue sectioning. The protocol involves hydrogel embedding of formaldehyde-fixed tissue, and subsequent delipidation using an anionic detergent to "clear" the tissue.

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) has recently evolved as a valuable technique involving ...

3D Visualization of Immune Cell Populations in HIV-Infected Tissues via Clearing, Immunostaining, Confocal, and Light Sheet Fluorescence Microscopy

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 million individuals infected worldwide and no widely accessible cure. Despite intensive efforts, a detailed understanding of virus and host cell interactions in tissues during infection and in response to therapy remains incomplete. To address these limitations, water-based tissue clearing techniques CUBIC (Clear, Unobstructed Brain/Body Imaging Cocktails and Computational analysis) and CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/Immunostaining/in situ-hybridization-compatible Tissue hYdrogel) are applied to visualize complex virus host-cell interactions in HIV-infected tissues from animal models and humans using confocal and light sheet fluorescence microscopy. Optical sectioning of intact tissues and image analysis allows rapid reconstruction of spatial information contained within whole tissues and quantification of immune cell populations during infection. These methods are applicable to most tissue sources and diverse biological questions, including infectious disease and cancer.

Tissue clearing, combined with immunofluorescence microscopy, allows spatial visualization and quantification of immune-cell populations and virus proteins within intact tissues. Optical sectioning of cleared tissues with confocal and light sheet fluorescence microscopy can generate 3D models of complex tissue environments and reveal spatial heterogeneity exhibited during HIV infection.

Human Immunodeficiency Virus (HIV), the causative agent of Acquired Immune Deficiency Syndrome (AIDS), is a major global health concern with nearly 40 ...

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקולים אופטימליים לניקוי רקמות להדמיה תלת-ממדית של אבי העורקים בעכברים

Three-Dimensional Imaging of Aortic Tissues in Atherosclerosis

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial wall, including the intima plaque, the media, and the adventitia, which forms the outer connective tissue coat of arteries. Our recent studies have suggested that the adventitia is used by the peripheral nervous system as a conduit for reaching all tissue cells. We also found that the peripheral nervous system, that is, the sensory and sympathetic nervous system, undergoes major remodeling processes involving the neogenesis of axon networks adjacent to atherosclerotic plaques. In this context, understanding the structure of the neural network and its interactions with vascular components of diseased arteries holds major promises for a better understanding of cardiovascular disease pathogenesis. To achieve these objectives, methods to visualize the subcellular architecture of the intact healthy and diseased arteries together with their surrounding perivascular compartments are needed. Tissue clearing allows intact deep-tissue imaging of larger tissue compartments that are otherwise inaccessible. It allows volumetric imaging of intact arteries through the integration of labeling, clearing, advanced microscopic imaging, and image processing tools. Here, we describe two distinct but complementary passive tissue clearing approaches, that is, aqueous-based 2, 2-thiodiethanol (TDE) clearing and solvent-based immunolabeling-enabled three-dimensional imaging of solvent-cleared organ (iDISCO) clearing to image isolated aortic segments or whole aorta in-situ in the whole mouse.

<meta charset="utf8"></head><body>הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

Here, we present optimized tissue-clearing protocols to image the murine aorta in three dimensions (3D). We delineate state-of-the-art procedures for immunostaining, optical clearing, and imaging with the intent to define the anatomical proximity of the peripheral nervous system with atherosclerotic plaques and the adventitia in atherosclerosis.

הדמיה תלת מימדית של רקמות אבי העורקים בטרשת עורקים

Recent research has advanced the understanding of atherosclerosis as a transmural chronic inflammatory disease involving all three layers of the arterial ...