Name: isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy
Uploaded: 2014-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי לאומי ללב, ריאות ודם מכון גרנט HL-36,573. אנו מודים למר דוד Sowa לעריכת כתב היד הזה.

כל המחקר על עכברים שנעשה על פי נהלים והנחיות של המכון הלאומי לבריאות, והפרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת טולדו, המכללה לרפואה ומדעי חיים. 1. הכנת מערכת זלוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום לפני הבידוד, למלא את כל מערכת זלוף (כולל מאגרים) עם תמיסה של חומר ניקוי ללא שאריות אלקליין מהיר. אפשר הפתרון לספוג לתוך המערכת לכמה שעות או למשך לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, כוון את טמפרטורת thermocycler 37 ° C ולאפשר הפתרון כדי להתחמם. הסר את תמיסת הסבון ולשטוף את המערכת ביסודיות עם מים מזוקקים מעוקרים. אל תשכחו את כל הענפים בצד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את המערכת עם חיץ זלוף באמצעות משאבת peristaltic מתמדת ולצייר כל בועות אוויר יצא מהאולם אב העורקים (מלכודת בועה) עם מזרק צד רכוב כדי להגן עלהלב מחסימה כלילית. קצב הזרימה של משאבת peristaltic צריך להיבדק באופן שיגרתי. </li></ol> 2. הכנת חוצץ, תרבות מדיה, וצלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף הצפת: הפוך 500 מיליליטר של חיץ 1x זלוף לפני השימוש. חיץ סידן ללא זה מכיל 113 mM NaCl, 4.7 מ&quot;מ KCl, 0.6 מ&quot;מ KH 2 PO 4, 0.6 מ&quot;מ Na 2 HPO 4, 1.2 מ&quot;מ MgSO 4, 10 מ&quot;מ Na-HEPES, 12 מ&quot;מ NaHCO 3, 10 מ&quot;מ KHCO 3, 0.032 פנול מ&quot;מ אדום, טאורין 30 מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ BDM, ו5.5 גלוקוז מ&quot;מ. התאם את ה-pH ל 7.0 עם 2 M HCl ולסנן דרך 0.2 מסנן מיקרומטר, לאחסן ב 4 ° C. הערה: א) פתרון זלוף צריך להיות מוכן באותו היום שבו נעשה בו שימוש. במקרים מסוימים, זה מקובל לאחסן את הפתרון בפחות מ 3 ימים ב 4 ° C. ב) יש חיץ זה ריכוז אשלגן גבוה עד 15.3 מ&quot;מ, אשר יכול לשמור על שריר הלב שקט, להפחית ג ה-ATPonsumption ולהגדיל את Ca 2 + היכולת סובלנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיכול חוצץ (300 U / ml, 25-50 מיליליטר / לב): להכין רק לפני זלוף. שוקל 15,000 U של פעילות הכוללת של הסוג II collagenase, מתמוסס ב50 חיץ זלוף מיליליטר במכסת מנוע בתרבית. הוסף 25 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2 (פתרון מניות, מסנן מעוקר) כדי להפוך את ריכוז סידן הסופי 50 מיקרומטר. לחמם את החיץ ל37 מעלות צלזיוס כאשר מוכן לבידוד. שלא כמו טריפסין, collagenase עובד הכי טוב בנוכחות של 50-100 מיקרומטר Ca + 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחנה חוצץ (50 מיליליטר / לב): לפעול במכסת מנוע בתרבית. מערבבים 45 מיליליטר של חיץ זלוף עם 5 מיליליטר FBS סטרילי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + פתרון אני (12.5 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 2.5 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-20 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + הפתרון השני (100 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 10 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + פתרון III (400 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 40 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ca 2 + IV פתרון (900 מיקרומטר Ca 2 +): הוסף 90 μl של 100 מ&quot;מ CaCl 2-10 מיליליטר של חיץ לעצור ולערבב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי בינוני (50 מיליליטר / לב): העברה 43 מיליליטר של ממ המכיל 2 מ&quot;מ L-גלוטמין ו1.26 מ&quot;מ CaCl 2 לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי במכסת מנוע בתרבית ולהוסיף 5 מיליליטר של FBS, 1 מיליליטר של פתרון מניות BDM ( 500 מ&quot;מ, מסנן מעוקר), ו0.5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml). לערבב ולאזן במשך 2-3 שעות לפני בידוד myocyte ב2% CO 2, חממת 37 ° C עם כיפות רופפות. ממש לפני ציפוי myocyte, להוסיף 0.5 מיליליטר של 200 מ&quot;מ ATP (pH 7.2, פתרון מניות, מסנן מעוקר) לבינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות בינונית (50 מיליליטר / לב): העברה 48 מיליליטר של ממ המכיל 2 מ&quot;מ L-גלוטמין ו1.26 מ&quot;מ CaCl 2 לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי במכסת מנוע בתרבית ולהוסיף 1 מיליליטר של פתרון מניות BDM (500 מ&quot;מ, filter מעוקר), ו0.5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין (10,000 U / ml). לערבב ולאזן ב2% CO 2, חממת 37 מעלות צלזיוס לפני בידוד myocyte. לפני השימוש, מוסיף 0.5 מיליליטר של 100 מ&quot;ג / מיליליטר BSA (מסנן מעוקר) לבינוני. הערה: שימוש בחממה 2 CO 2% מאפשר שמירה על רמת חומציות התרבות בינונית ב6.9-7.0, אשר מסייעת myoctyes לשמור עד 24 שעות המורפולוגיה בצורת המוט שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Laminin מנות (1-2 מיקרוגרם / 2 סנטימטר) מצופים או צלחות: העברה 200 μl של 1 מ&quot;ג / מיליליטר laminin עכבר טבעי ל20 מיליליטר של PBS מעוקר (w / o סידן ומגנזיום) ומערבבים. הוסף 1 מיליליטר למאכלי 35 מ&quot;מ, 2.5 מיליליטר למאכלי 60 מ&quot;מ, או 5 מיליליטר למאכלי 100 מ&quot;מ, לנער כדי לכסות באופן שווה על המשטחים, ומקום ב2% CO 2, חממת 37 מעלות צלזיוס עד לציפוי myocyte. הערה: אם המנות או צלחות לא משמשות ביום המצופה, הם יכולים להיות אטומים עם Parafilm ומאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס (ציפוי איטי) למשך הלילה. איטום הוא requIRED כדי למנוע אידוי וזיהום. יכולות להיות כל הזמן צלחות מצופות על 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע עד 1. </li></ol> 3. ההסרה מאוס לב וCannulation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את המספריים ומלקחיים ב70% אתנול ל30 דקות ולתת להם להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את העכבר כדי 0.1 גרם הקרוב ביותר. הקלט את משקל הגוף שלה, מתח, מין ותאריך לידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 200 הפרין μl (100 IU / עכבר) ip 10 דקות לפני הרדמה כדי למנוע קרישת דם בעורקים הכליליים. להרדים את העכבר עם 200 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף של קטמין ו10 מ&quot;ג / קילוגרם משקל גוף של xylazine ידי הזרקת ה-IP ולחכות 5-10 דקות עד שהעכבר מפסיק להגיב לצובט זנב / הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאבטח את העכבר במצב שכיבה בעדינות על ידי תיקון הרגליים הקדמיות וhindpaws למשטח עבודת pinnable (קלקר כלומר) על מגש ניתוחים בבעלי חיים או ספסל שולחן ליד מערכת זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגב את החזה והבטן עם 70% אתנול. הפוך עור קו האמצעncision מאמצע הבטן לסרעפת עם מספריים כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את הסרעפת עם עוד מספריים כירורגית והחזק את עצם החזה עם מלקחיים משוננים מעוקלים. לחתוך בילטרלי וretroflect כלוב בית החזה כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם את הלב מעט באמצעות מלקחיים משוננים וatraumatic מעוגלים עדינים ולנתח את הלב מתוך חלל החזה הקרוב ככל האפשר אל קיר בית החזה הגבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הלב לצלחת 100 מ&quot;מ המכילה חיץ זלוף קר. לקצץ בזהירות רקמות חיבור, כגון ריאות, בלוטת התימוס, והסמפונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את אב העורקים וענפי הגולגולת שלה, אשר בדרך כלל מוסתרים על ידי בלוטת התימוס וכרית שומן. חותכים את אב העורקים מתחת סניפה הראשון 13, אחוז בקיר אב העורקים, הרם את הלב, ומעט להחליק אותו לצינורית זלוף מלא נוזל אב העורקים (צינורית הנירוסטה OD 1.0 מ&quot;מ עם קצה קהה / שטוח וחריצי 1 ו -2 מ&quot;מ מעל טיפ, או מחט האכלה לשימוש חוזר G 22) באמצעות שני f עדין קצה אולטרהorceps. הערה: א) נוזל זלוף צריך להיות נוטף במהלך cannulation לב כדי למנוע בועות גז מלהיכנס לעורקים הכליליים; ב) שמור על הקצה של הצינורית בדיוק מעל שסתום אב העורקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את אב העורקים לצינורית ולקשור את אב העורקים לצינורית עם 6-0 משי כירורגית. כל cannulation צריך לקחת פחות מ 120 שניות. </li></ol> 4. לב זלוף ועיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הלב עם חיץ זלוף ללא סידן בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה על 4-5 דקות עד השפכים יתבהרו, ולאחר מכן לעבור לחיץ עיכול המכיל 50 מיקרומטר CaCl 2 ותנקבו ל3.5-20 דקות בהתאם לזן עכבר, לחץ זלוף ופעילות collagenase. במידת צורך, להגביר את לחץ אב העורקים ל70-80 מ&quot;מ כספית, כאשר לעכל. בעת צורך, perfusate האנזים יכול להיות ממוחזר לעיכול. בדרך כלל, 300 חיץ U / מיליליטר אנזים יהיה לעכל את לב ב10-12 דקות בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה;אם הפעלת לחץ afterload ב70 מ&quot;מ כספית, 300 U / ml ייקח רק 3.5-5.5 דקות בקצב זרימה של 4 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק עיכול כאשר הלב הופך מעט חיוור ורפוי. זה צריך להיות ספוגי כאשר צבט בעדינות. </li></ol> 5. ניתוק תאים והשבת סידן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך את אב העורקים מהצינורית עם מלקחיים ספוגי אתנול 70% ולשים הלב לתוך צלחת 60 מ&quot;מ סטרילי המכילה 2.5 חיץ עיכול מיליליטר. לעבור למכסת המנוע בתרבית באמצעות אספקה ​​סטרילית, להישאר מודע לטכניקות סטריליות לכך וצעדי מעקב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את אב העורקים, אטריה, וכלי גדול עם מספריים כירורגיות עדינים. בעדינות להקניט את החדר ל10-12 חתיכות קטנות עם שני מלקחיים עדין קצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה חתיכות לב ותאים למעלה ולמטה ~ 10x עם טפטפת העברה 10 מ&quot;ל ולאחר מכן להעביר לצינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ&quot;ל. יש לשטוף את הצלחת עם 7.5 מיליליטר תמיסת סידן אני מכיל 12.5 מיקרומטר CaCl 2 והעברהזה לתוך הצינור, וכתוצאה מכך נפח סופי של 10 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה באמצעות פיפטה העברה עדין קצה לפזר את החתיכות הגדולות של רקמת לב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז צנטריפוגות במשך 3 דקות ב20 XG להפריד את תאים שאינם קטנים myocyte כגון תאים וfibroblasts אנדותל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את supernatant ו resuspend את כדור myocyte ב10 מיליליטר תמיסת סידן אני עם תוספת של של 200 מ&quot;מ ATP 100 μl (pH 7.2, פתרון מניות, מסנן מעוקר). השאר את השפופרת במכסת המנוע של 3-5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה לשכפל 10 aliquots μl לhemacytometer לספור myocytes מוט בצורה ועגול. לחשב את המספר הכולל של myocytes ולחשב את אחוז myocytes בצורת המוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה myocytes במשך 3 דקות ב20 x גרם. הסר את supernatant ו resuspend את כדורים ב10 השני פתרון מיליליטר סידן המכיל 100 מיקרומטר CaCl 2. לפזר את myocytes עם פיפטה ההעברה עדין הקצה על ידי pipettingלמעלה ולמטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על השלב לעיל (5.8) באמצעות פתרון סיד III (400 מיקרומטר CaCl 2) ורביעי (900 מיקרומטר CaCl 2), בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתרבות העיקרית myocyte עכבר, resuspend את כדור myocyte הסופי ב 5 מיליליטר של ציפוי בינוני. לספור את המספר הכולל של myocytes ולחשב את אחוז myocytes בצורת המוט. </li></ol> 6. תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של myocytes בצורת המוט ל25,000 myocytes / מיליליטר בצורת מוט בצינור 50 מ&quot;ל. בעדינות פיפטה myocytes באמצעות פיפטה 10 מ&quot;ל להשעות אותם היטב. הימנע משקיעת תא בפיפטה והצינור כדי להבטיח צפיפות תאים שווה לכל מנה או צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר aspirating את פתרון ציפוי laminin, צלחת myocytes לאלה מנות או צלחות. חלק בעדינות את המנות או צלחות קדימה ושלושה עד ארבעה פעמים אחורה ומצד אל צד בתבנית דמוית צלב על פני השטח של מכסה המנוע בתרבית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים או הצלחות בCO 2%2 באינקובטור ב 37 ° C. דגירה של 1-3 שעות כדי לאפשר מצורף myocyte בשיעור של כ -80%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התקשרות, בעדינות לשאוב את המדיום המכיל myocytes פנוי ופסולת תא. בעדינות להוסיף מדיום תרבות לצדדים של המנות או צלחות. לבצע את זה שינוי בינוני אחד אחד. מייד להחזיר את הכלים או צלחות לאינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תרבות O / N, ניתן לשנות myocytes לאותו מדיום ללא BDM לפני הלימודים של תא איתות לטווח קצר. שמור BDM בתרבות לטווח ארוך עבור מבחני hypertrophic או אפופטוזיס. הערה: BDM (monoxime 2,3-butanedione) יכול לעכב את שרירן-ATPase ולמנוע התכווצות. העיכוב של התכווצות מבוססת שרירן שלה הוא הפיך בקלות. הוא דיווח כי BDM יכול להיות כמה תופעות לוואי אפשריות, כגון מתנהג כמו פוספטאז שאינו ספציפי, הגדלת שחרור סידן מSR, ושינוי של ריכוז סידן חופשי ונכס חשמלי סלולאריrties, ולכן לפני הטיפול, יש להסיר BDM. יתר על כן, במקרים מסוימים, Blebbistatin מעכב ספציפי שרירן השני יכול להיות תרופה חלופית לעכב 8,9 התכווצות cardiomyocyte. עם זאת, במקרים שלנו, BDM הוא טוב יותר מאשר Blebbistatin למען האיכות והכמות של שריר הלב. </li></ol>

<ol>
	<li>Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+cardiomyocyte+isolation,+culture,+and+gene+transfer.">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> J. Mol. Cell. 51, 288-298 (2011).</li><li>Gross, D. R., Gross, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Isolated heart preparations, problems, and pitfalls. In: Animal Models in Cardiovascular Research. , 109-130 (2009).</li><li>Schl&#252;ter, K. D., Piper, H. M., Dheim, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+ventricular+cardiomyocytes.">Isolation and culture of adult ventricular cardiomyocytes.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 557-567 (2005).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Ni, Y. G., Lin, K. M., Han, H. P., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+cardiac+myocytes+for+signaling+studies.">Isolation and culture of adult cardiac myocytes for signaling studies.</a> AfCS research reports. 1 (5), 1-9 (2003).</li><li>O&#39;Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpon, P. C., Vivanco, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes.">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 35, 271-296 (2007).</li><li>Nilolskaya, A., Sharma, V., Sigg, D. C., Laizzo, P. S., Xiao, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture+models+and+methods.">Cell culture models and methods.</a> Cardiac Electrophysiology Methods and Models. , 213-235 (2010).</li><li>Merx, M. W., Schrader, M., Dhein, S., Mohr, F. W., Delmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+working+heart.">The working heart.</a> Practical Methods in Cardiovascular Research. , 173-189 (2005).</li><li>Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+extends+culture+life+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+and+allows+efficient+and+stable+transgene+expression.">Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 294, 1667-1674 (2008).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dynamic+instability+and+wavelength+in+arrhythmia+maintenance+as+revealed+by+panoramic+imaging+with+blebbistatin+vs.+2,3-butanedione+monoxime.">The role of dynamic instability and wavelength in arrhythmia maintenance as revealed by panoramic imaging with blebbistatin vs. 2,3-butanedione monoxime.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 302, 262-269 (2012).</li><li>Liu, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+Na/K-ATPase+potentiates+Marinobufagenin-induced+cardiac+dysfunction+and+myocyte+apoptosis.">Reduction of Na/K-ATPase potentiates Marinobufagenin-induced cardiac dysfunction and myocyte apoptosis.</a> J. Biol. Chem. 287 (20), 16390-16398 (2012).</li><li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+roles+of+the+cardiac+Na+/Ca2+-exchanger+in+ouabain-induced+inotropy,+cell+signaling,+and+hypertrophy.">Different roles of the cardiac Na+/Ca2+-exchanger in ouabain-induced inotropy, cell signaling, and hypertrophy.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 304, 427-435 (2013).</li><li>Liu, L. J., Zhao, X. C., Pierre, S. V., Askari, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+PI3K-AKT+signaling+pathway+with+digitalis-induced+hypertrophy+of+cardiac+myocytes.">Association of PI3K-AKT signaling pathway with digitalis-induced hypertrophy of cardiac myocytes.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 293, 1489-1497 (2007).</li><li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Cell+Transcriptional+Profiling+of+Adult+Mouse+Cardiomyocytes.">Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes.</a> J. Vis. Exp. (58), (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

לעריכה הטובה ביותר, השלבים הקריטיים ביותר הם: 1) מייד משדלת את לב העכבר לצינורית לאחר כריתה; 2) זלוף לב המתאים. כמו כן, שימו לב כי איכות מים, טמפרטורת זלוף, ה-pH של חיץ, עיקור, טוהר כימי, וצינורות נקיים, שאינו מזוהם ותאים הם גם גורמים חשובים. 18.2 mΩ H כיתה ביולוגיה המולקולרי 2 O מומלץ ביותר להכנת מאגר. ה-pH של 200 פתרון מניות מ&quot;מ ATP צריכה להיות מותאם ל7.2, צעד שהוא החמיץ בקלות. זה חיוני כדי לזהות במהירות את אב העורקים ולחתוך ממש מתחת הסניף הראשון שלה, כפי שמוצג על ידי 13 פלין. למערכת מרכזית יעילה, צינורית נירוסטה מתאימה בגודל עם חריצים ומהדק צלב משונן קטן מומלצות. לאחר קשירה, הקצה של הצינורית צריך להיות מעל שסתום אב העורקים על מנת לסייע collagenase אינטראקציה מלא עם רקמת לב במהלך מחזור דם כלילי. לפעמים, תשואת התא נראית גדול בתחילהאבל תאים רבים לאחר שלב סובלנות סידן בצורה עגולות. הסבר אחד הוא שהדם קרוש בכלי לא יכול להסיר לחלוטין מהלב, מה שמוביל לעיכול לקוי. אפשרות נוספת היא על מערכת העיכול של הלב. חשיפה ממושכת לcollagenase מפחיתה myocyte סידן סובלנות 2. במהלך ניתוק והשבת סידן, חשוב גם לטפל בשריר הלב בעדינות ככל האפשר כדי לשמור על כדאיות myocyte. לסיכום, תרבות cardiomyocyte מבוגר מעכברים מהונדסים גנטי היא כלי רב עוצמה למחקר לב. עם זאת, עבודה בעתיד צריכה לזכור את ההבדל הגנטי בין בני האדם ומכרסמים בעת פירוש תוצאות.

שריר לב הוא לא שגשוג. יש כמה שורות תאי cardiomyocyte פרוזדורים, כמו HL-1 ו-AT-1 תאים שמקורם בגידולי פרוזדורי עכבר; עם זאת, אין קווים סלולריים cardiomyocyte חדרית המבוגר זמינים למחקר. תרביות תאים ראשוניות של שריר לב עכבר מבוגר לספק מודל רב עוצמה למחקר לב ברמה התאית ומולקולרית. עד כה, הם היו בשימוש נרחב למחקר ביוכימי, פיסיולוגי, ותרופתי 1. בנוסף, השימוש התכוף בעכברים מהונדסים גנטי יש חייבת שיטות יעילות של בידוד cardiomyocyte. תרבות טהורה מאפשרת לתנאים חופשיים מאינטראקציה עם איברים אחרים ומחזור המערכתי, כגון באמצעות גורמי neurohormonal ודמוי הורמון אנדוגני 2,3. עם זאת, בידוד מוצלח של שריר לב יכול להיות מאתגר. הפרוטוקול אנחנו מציגים כאן מבוסס על החוויות שלנו עם cardiomyocyt חולדה הבוגרתes ואת השיטה שתוארה על ידי או &#39;קונל ואח&#39; 4,5. במיוחד ב2007 5, הם תיארו טכניקות מפורטות מהכנות חיץ לתרבית תאים וassay הפונקציונלי. מאז myocytes העכבר רגישים מאוד להתכווצות שריר הלב בהשוואה לעכברים, המאגרים או מדיה המשמשים לזלוף, עיכול, Ca 2 + סובלנות, ציפוי והתרבות בפרוטוקול העכבר הם השלימו עם מעכב ספציפי עירור התכווצות צימוד, 2, monoxime 3-Butanedione (BDM) לעכב ההתכווצות הספונטנית שלהם, ומכאן את יכולת הקיום והתשואה של myocytes בצורת המוט לשפר באופן משמעותי. בפרוטוקול הציג כאן, myocytes מופרד בחיץ אשלגן גבוה מהלב המבודד על ידי זלוף Langendorff שונה עם הסוג II collagenase. Collagenase השני שובר בצורה יעילה את המטריצה ​​הבינה תאית ותאים משחרר. פתרון זלוף גם שומר חילוף חומרים תאיים ברמה נמוכה 6. בadditiב, מערכת הלב המבודדת מהרווארד Apparatus אנחנו משמשים כאן היא מעוצבים היטב לטמפרטורה מדויקת ושליטה בלחץ קבועה 7. גישה זו מספקת הכנות לשחזור מאוד ואוכלוסיות אחידות מסוג התא בודד, שניתן להשתמש בם בתרבות הלילה למדידת חלבוני איתות או תרבות 2-3 יום למבחני hypertrophic לב.

<table><tbody><tr><td>Isolated heart system for small rodent</td><td>Harvard Apparatus</td><td>IHSR-mouse 73-4019</td><td></td></tr><tr><td>Aortic Cannula, OD 1.0 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-2816</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11294-00</td><td></td></tr><tr><td>Straight sharp serrated scissors</td><td>Fine science tools</td><td>14070-12</td><td></td></tr><tr><td>Serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11050-10</td><td></td></tr><tr><td>Curved, serrated Graefe forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Straight Mini Serrefines clamps</td><td>Fine science tools</td><td>18054-28</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11575-032</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td></td></tr><tr><td>Mucosal universal detergent</td><td>Sigma</td><td>Z637181</td><td>Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.</td></tr></tbody></table>

isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy

התקדמות טכנולוגית הפכו את העכברים מהונדסים גנטי, בם מהונדס ועכברים בנוקאאוט הגן, כלי חיוני בתחומי מחקר רבים. cardiomyocytes מבוגרים מקובלים מאוד כמודל טוב לפיזיולוגיה הסלולר לב ופתופיזיולוגיה, כמו גם להתערבות תרופתית. עכברים מהונדסים גנטי מונעים את הצורך בתהליכי זיהום cardiomyocyte מסובכים כדי ליצור את הגנוטיפ הרצוי, שאינם יעילים בשל בידול המסוף &#39;שריר הלב. בידוד והתרבות של שריר לב פונקציונלי גבוהה כמות ובאיכות באופן דרמטי ייהנו מחקר לב וכלי דם ולספק כלי חשוב למחקר התמרה תא איתות ופיתוח תרופות. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת היטב לבידוד של שריר לב עכבר בוגר שיכול להיות מיושם עם קצת אימון. לב העכבר הוא נכרת וcannulated למערכת לב מבודדת, אז perfused עם p-סידן חופשי וגבוהotassium חיץ ואחריו סוג II עיכול collagenase במצב זלוף המדרדר Langendorff. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית עבור האוסף של שריר לב עכבר בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

1. כימות בידוד מוצלחת שני קריטריונים משמשים לכמת את ההצלחה של הבידוד: ראשון, המספר הכולל של שריר לב מבודד, ושנית, היחס של myocytes שאינו סובלני בסידן סובלני לעגל בצורת המוט. באופן כללי פרוטוקול זה לוקח בערך 75-90 דקות מהסרת לב לציפוי myocyte ותשואות סביב 1 מ&#39;cardiomyocytes בצורת מוט (70-90% מmyocytes הכולל שנקטפו) מלב עכבר בוגר אחד. זה עשוי להשתנות עם משקל גוף עכבר ומתח. בדרך כלל, ניתן לאסוף .7-1.0 מיליון myocytes בצורת מוט מעכבר ~ 25 גרם C57BL/6J, 1.2-1,600,000 myocytes בצורת מוט מעכבר שוויצרי שחור 35 גרם ~, ו0.7-1,200,000 myocytes בצורת המוט יכול ייגבה מהטרוזיגוטיים ~ 30 גרם Na / K-ATPase (S α1 / R) 10 או ~ 22 גרם ספציפי NCX-KO 11 עכבר לב. בדרך כלל יש לי myocytes המבודד מוט צורה ברורה עם קצוות מלבניים ופסים צולבים ברורים,מוצג באיור 1. 2. זיהוי תפקוד תא נתונים הקודמים שלנו הראו בבירור כי בשריר לב עכברוש בילוד בתרבית, 100 ouabain מיקרומטר יכול להפעיל PI 3 זירחון Akt K תלוי ולגרום להיפרטרופיה 12. כדי לאשר את התוצאות של אלה בשריר לב עכבר בוגר, cardiomyocytes עכבר C57BL/6J המבוגר היו בתרבית וטופל בouabain. איורים 2 ו 3 מראים בבירור כי ouabain יכול להגדיל זירחון Akt באופן תלוי מינון ולגרום לשילוב [3 H]-לאוצין במהלך סינתזת חלבון. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51357/51357fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51357/51357fig1.jpg" /> איור 1. שריר לב בצורת מוט רגיל מעכבר שוויצרי שחור אחרי הלילהתרבות. myocytes צולמו תחת מיקרוסקופ לעומת שלב באמצעות תוכנת צילום. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51357/51357fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51357/51357fig2.jpg" /> איור 2. הפעלה של AKT ידי ouabain בשריר לב עכבר C57BL/6J מבוגר מתורבת. Myocytes נחשפו לouabain מיקרומטר 0-50 במשך 5 דקות, וlysates היה assayed לפוספורילציה (סר 473) AKT (p-Akt) וAkt ידי מערבי כתמים. הפעלה הייתה לכמת כיחס בין פוספורילציה לAkt הכולל (n = 5-10). * P &lt;0.05 לעומת שליטה, ** P &lt;0.01 לעומת שליטה. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51357/51357fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51357/51357fig3.jpg" /> איור 3. Ouabain ממריץ את סינתזת חלבון בשריר לב עכבר C57BL/6J המבוגר בתרבית לאחר חסך סרום 4 שעות, טופלו myocytes עם התנאים מצויינים בנוכחות או עדר של ouabain או 100 ננומטר ET-1 (בקרה חיובית) יחד עם [3 H]. - לאוצין (1 μCi / מיליליטר) במשך שעה 12. lysates הסלולרי היו זירז עם TCA 5% וresuspended ב0.2 M NaOH/0.1% SDS, והרדיואקטיביות נספרה במונה נצנץ. סינתזת החלבון לדגימה הייתה מחושבת CPM / חלבון ומנורמל בהשוואה לשליטת מ&quot;ג. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> פתרון / הצפת </td><td> זלוף הצפת </td><td> עיכול הצפת </td><td> תפסיק חיץ </td><td> Ca 2 + פתרון אני </td><td> Ca 2 + הפתרון השני </td><td> Ca 2 + פתרון III </td><td> Ca 2 + פתרון IV </td></tr><tr><tד&gt; NaCl, מ&quot;מ </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td><td> 113 </td></tr><tr><td> KCl, מ&quot;מ </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td><td> 4.7 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4, מ&quot;מ </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4, מ&quot;מ </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> MgSO4, מ&quot;מ </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> Na-HEPES, מ&quot;מ </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> 3 NaHCO, מ&quot;מ </td><td> 12 </td><td> 12 </td><td>12 </td><td> 12 </td><td> 12 </td><td> 12 </td><td> 12 </td></tr><tr><td> 3 KHCO, מ&quot;מ </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> פנול אדום, מיקרומטר </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td><td> 32 </td></tr><tr><td> טאורין, מ&quot;מ </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> BDM, מ&quot;מ </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> גלוקוז, מ&quot;מ </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td><td> 5.5 </td></tr><tr><td> FBS,% (v / v) </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Collagenase השני, מ&quot;ג / מיליליטר </td><td> 0 </td><td> 1 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td><td> 0 </td></tr><tr><td> CaCl 2, מיקרומטר </td><td> 0 </td><td> 50 </td><td> 0 </td><td> 12.5 </td><td> 100 </td><td> 400 </td><td> 900 </td></tr></tbody></table> טבלת 1. פתרונות / מאגרים לבידוד שריר לב עכבר בוגר. <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> # קטלוג </td><td> הכנה </td><td> אחסון </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברי (FBS) </td><td> אטלנטה Biolgoicals </td><td> S11550 </td><td> N / </td><td> 25 מיליליטר aliquots ב50 צינורות מיליליטר סטרילי ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> אלבומין בסרום שור (BSA) 100 מ&quot;ג / מיליליטר, 100x </td><td> סיגמא </td><td> A7906 </td><td> 5 גרם ב50 מיליליטר diH 2 O, סינון סטרילי דרך 0.22 מיקרומטר ו מזרק סטריליilter </td><td> 5 מיליליטר aliquots ב15 צינורות מיליליטר סטרילי ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> CaCl 2 100 מ&quot;מ, 100x </td><td> סיגמא </td><td> C4901 </td><td> 0.555 גרם ב50 מיליליטר diH 2 O, וסינון סטרילי דרך 0.22 מיקרומטר מסנן מזרק סטרילי </td><td> 10 מיליליטר aliquots ב15 צינורות מיליליטר סטרילי בטמפרטורת חדר. </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ג laminin / מיליליטר, 100x </td><td> טכנולוגיות חיים </td><td> 23017-015 </td><td> N / </td><td> 200 aliquots μl ב0.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות סטרילי ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> monoxime 2,3-Butanedione (BDM) 500 מ&quot;מ, 50x </td><td> סיגמא </td><td> B0753 </td><td> 1.01 BDM גרם ב20 מיליליטר diH 2 O, לעקר את הפתרון על ידי סינון דרך 0.22 מיקרומטר מסנן במכסת מנוע. </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> מלח disodium אדנוזין-5&#39;-טריפוספט (Na 2-ATP) 200 מ&quot;מ, 100x </td><td> סיגמא </td><td> A6419 </td><td> הוסף 5 מיליליטר diH 2 Oלפזר 1 גרם Na 2-ATP ב50 צינור צנטריפוגות מיליליטר, ואז להשתמש 2 NaOH mol / l לכדי להתאים את pH 7.2 ולהביא את הנפח הסופי עד 9 מיליליטר עם diH 2 O. לעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מסנן מזרק מיקרומטר. </td><td> 0.5 מיליליטר aliquots ב1.5 מיליליטר microcentrifuge צינורות סטרילי ב -20 ° C. </td></tr><tr><td> 3.77 NaCl M, 33.3x </td><td> סיגמא </td><td> S7653 </td><td> 66 גרם ב300 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> KCl 470 מ&quot;מ, 100x </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> P217 </td><td> 3.5 גרם ב100 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 60 מ&quot;מ, 100x </td><td> סיגמא </td><td> P5379 </td><td> 0.82 גרם ב100 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 60 מ&quot;מ, 100x </td><td> סיגמא </td><td> S0876 </td><td> 0.85 גרם ב100 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> MgSO 4 120 מ&quot;מ, 100x </td><td> סיגמא </td><td> M-1880 </td><td> 3 גרם ב100 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> 1 HEPES M, 100x </td><td> טכנולוגיות חיים </td><td> 15630-080 </td><td> N / </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> NaHCO 3 600 מ&quot;מ, 50x </td><td> סיגמא </td><td> S6014 </td><td> 10.1 גרם ב200 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> KHCO 3 M 1, 100x </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> P235 </td><td> 10.1 גרם ב100 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן ב 4 ° C. </td></tr><tr><td> מ&quot;מ 3.2 פנול אדום, 100x </td><td> סיגמא </td><td> P5530 </td><td> 0.12 גרם ב100 מיליליטר diH 2 O </td><td> לאחסן בטמפרטורת חדר. </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הכנת מלאי פתרון ואחסון עבור בידוד ותרבות cardiomyocytes עכבר מבוגר. </strong&gt;

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy at JoVE.com

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

isolation-culture-adult-mouse-cardiomyocytes-for-cell-signaling-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

47.5K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences.  אנו מתארים שיטה אמינה לבידוד של שריר לב עכבר בוגר. פרוטוקול זה מניב תוצאה עקבית לתרבות של שריר לב בוגר מתפקד ממגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי. 

Video: Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Isolation and Genetic Manipulation of Adult Cardiac Myocytes for Confocal Imaging

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and a working heart on the other. Thus, cardiomyocytes serve as good models for cardiac cellular physiology and pathophysiology, for pharmaceutical investigations as well as for the exploration of transgenic animal models. Here we describe a method of isolating the cells from the heart. Furthermore we show how a genetic manipulation on cardiac myocytes can be performed without breeding a transgenic animal: This is the combination of long term culture (1 week) and adenoviral gene transfer. The latter one is described from the construction of the virus to the transduction of the cells. It can be used for the expression of genetically encoded biosensors (GEBs), fluorescent fusion proteins, but also for protein over expression and down regulation, e.g. using RNAi. Here we provide an example for the expression of a fusion protein staining a subcellular structure (Golgi). Such protein expression can be visualized by confocal imaging of z-stacks for a 3D-reconstruction of subcellular structures. The protocol comprises state-of-the-art in cell culture, molecular biology and biophysics and thus provides an approach for exploring new horizons in cellular cardiology.

Adult cardiac myocytes are primary cells that can be isolated from animal hearts and cultured for several days. Within this culture period adenoviral gene transfer can be used to express genetically encoded biosensors (GEBs) or fluorescent fusion proteins. Both approaches allow cellular investigations by means of confocal microscopy.

בידוד מניפולציה גנטית של Myocytes לב למבוגרים הדמיה confocal

Cardiac myocytes isolated from adult hearts are widely accepted as a model somewhere half way between embryonic and neonatal muscle cells on one side and ...

Single Cell Transcriptional Profiling of Adult Mouse Cardiomyocytes

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation between cells within a tissue. Isolation of pure cardiomyocyte populations through a collagenase perfusion of mouse hearts facilitates the generation of single cell microarrays for whole transcriptome gene expression, or qPCR of specific targets using nanofluidic arrays. We describe here a procedure to examine single cell gene expression profiles of cardiomyocytes isolated from the heart. This paradigm allows for the evaluation of metrics of interest which are not reliant on the mean (for example variance between cells within a tissue) which is not possible when using conventional whole tissue workflows for the evaluation of gene expression (Figure 1). We have achieved robust amplification of the single cell transcriptome yielding micrograms of double stranded cDNA that facilitates the use of microarrays on individual cells. In the procedure we describe the use of NimbleGen arrays which were selected for their ease of use and ability to customize their design. Alternatively, a reverse transcriptase - specific target amplification (RT-STA) reaction, allows for qPCR of hundreds of targets by nanofluidic PCR. Using either of these approaches, it is possible to examine the variability of expression between cells, as well as examining expression profiles of rare cell types from within a tissue. Overall, the single cell gene expression approach allows for the generation of data that can potentially identify idiosyncratic expression profiles that are typically averaged out when examining expression of millions of cells from typical homogenates generated from whole tissues.

Single cell expression profiling allows the detailed gene expression analysis of individual cells. We describe methods for the isolation of cardiomyocytes, and preparing the resulting lysates for either whole transcriptome microarray or qPCR of specific targets.

פרופיל תא יחיד תעתיק של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

While numerous studies have examined gene expression changes from homogenates of heart tissue, this prevents studying the inherent stochastic variation ...

Isolation and Cultivation of Adult Rat Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise investigation of the behavior of these cells under specific treatments and environments is possible. This manuscript presents a protocol for successful isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC).
The rat is sacrificed by cervical dislocation under deep anesthesia. Then, the heart is extracted and the aorta is uncovered. Subsequently, perfusion on the Langendorff perfusion system with calcium depletion and collagenase treatment is performed. Afterwards, ventricular tissue gets minced, re-circulated, and filtered, followed by three centrifugation steps with gradual addition of CaCl2 until physiological calcium concentration is reached. ARVC are plated on cell culture dishes. After refreshing the cell culture medium, ARVC can be cultivated for up to six days without changing the serum-containing culture medium. Isolation of ARVC is a calcium sensitive process. Small changes in the intracellular calcium concentration cause a decrease in the quality and viability of the isolated cells.
Freshly isolated ARVC are rod shaped. Within the first days of cultivation they lose the rod-shaped morphology and form pseudopodia-like structures (spreading). During this morphological formation ARVC initially degrade their contractile elements followed by a reformation through actin stress fibers and de novo sarcomerogenesis. After one week of cultivation, most ARVC show a widespread appearance with a clearly detectable cross striation. This process is sensitive to intracellular calcium concentration, as treatment with ionomycin attenuates spreading. Key markers in this process of de- and re-differentiation are &#946;-myosin heavy chain (&#946;-MHC), oncostatin M (OSM), and swiprosin-1 (EFHD2). Recent studies have suggested that cardiac re- and de-differentiation occurring under culture conditions mimics features seen in vivo during cardiac remodeling. Therefore, isolation and cultivation of ARVC play a key role in understanding the biology of cardiomyocytes.

Here, we present a protocol for the isolation and cultivation of adult rat ventricular cardiomyocytes (ARVC). Isolated ARVC can be used for short and long-term cultivation. The isolation and cultivation of ARVC can play a key role in developing new treatment regimens for cardiac diseases.

בידוד, טיפוח של עכברים בוגרים Cardiomyocytes

In an intact heart, adjacent cells influence adult cardiomyocytes. With the method of isolation and cultivation of adult cardiomyocytes, a precise ...

Medicine

Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow for easy investigation and manipulation of biochemical pathways, and their effect on the biomechanical properties of spontaneously beating cardiomyocytes.	
The following 2-day protocol describes the isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. We show how to easily dissect hearts from neonates, dissociate the cardiac tissue and enrich cardiomyocytes from the cardiac cell-population. We discuss the usage of different enzyme mixes for cell-dissociation, and their effects on cell-viability. The isolated cardiomyocytes can be subsequently used for a variety of morphological, electrophysiological, biochemical, cell-biological or biomechanical assays. We optimized the protocol for robustness and reproducibility, by using only commercially available solutions and enzyme mixes that show little lot-to-lot variability. We also address common problems associated with the isolation and culture of cardiomyocytes, and offer a variety of options for the optimization of isolation and culture conditions.

Primary mouse cardiomyocyte cultures are one of the pivotal tools for the investigation of myofibrillar organization and function. The following protocol describes the isolation and culture of primary cardiomyocytes from neonatal mouse hearts. The resulting cardiomyocyte cultures may be subsequently used for a variety of biomechanical, biochemical and cell-biological assays.

בידוד והתרבות של שריר לב עכבר בילוד

Cultured neonatal cardiomyocytes have long been used to study  myofibrillogenesis and myofibrillar functions. Cultured cardiomyocytes allow  for easy ...

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

בידוד, תרבות ואפיון פונקציונלי של Cardiomyoctyes מאוס למבוגרים

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Isolation, Transfection, and Long-Term Culture of Adult Mouse and Rat Cardiomyocytes

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. Adult mammalian CMs are terminally differentiated cells with minimal proliferative capacity. The post-mitotic state of adult CMs not only restricts cardiomyocyte cell cycle progression but also limits the efficient culture of CMs. Moreover, the long-term culture of adult CMs is necessary for many studies, such as CM proliferation and analysis of gene expression.
The mouse and the rat are the two most preferred laboratory animals to be used for cardiomyocyte isolation. While the long-term culture of rat CMs is possible, adult mouse CMs are susceptible to death and cannot be cultured more than five days under normal conditions. Therefore, there is a critical need to optimize the cell isolation and long-term culture protocol for adult murine CMs. With this modified protocol, it is possible to successfully isolate and culture both adult mouse and rat CMs for more than 20 days. Moreover, the siRNA transfection efficiency of isolated CM is significantly increased compared to previous reports. For adult mouse CM isolation, the Langendorff perfusion method is utilized with an optimal enzyme solution and sufficient time for complete extracellular matrix dissociation. In order to obtain pure ventricular CMs, both atria were dissected and discarded before proceeding with the disassociation and plating. Cells were dispersed on a laminin coated plate, which allowed for efficient and rapid attachment. CMs were allowed to settle for 4-6 h before siRNA transfection. Culture media was refreshed every 24 h for 20 days, and subsequently, CMs were fixed and stained for cardiac-specific markers such as Troponin and markers of cell cycle such as KI67.

Here, we present a protocol for the isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes.

בידוד, טרנס-תירבה ותרבות ארוכת טווח של עכבר מבוגר וקרדיומיוציטים עכברים וחולדות

Ex vivo culture of the adult mammalian cardiomyocytes (CMs) presents the most relevant experimental system for the in vitro study of cardiac biology. ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

בידוד ותרבות בו זמנית של מיוציטים פרך, מיוציטים חדריים, ולא מיוציטים מלב עכבר בוגר

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video