עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומי למדע NSF-IOS מענק # 1144391 לSHB.

1. הכנת הצמחים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן ניבטו זרעי ארבידופסיס ישירות על קרקע או על צלחות של טרשת נפוצה. לגדל את הצמחים לארבעה עד שישה שבועות בתאי צמיחה עם photoperiod של 12 שעות (22 ° C יום, 15 מעלות צלזיוס בלילה 14). צמחי מים פעמיים פעם אחת עד שבוע. השתמש במגש תחתון להשקיה, אין צמחי מים מלמעלה; לאפשר את המגשים לייבוש לפני מחדש השקיה. ודא שצמחים שתו מספיק בזמן קציר. </li></ol> 2. הכנת פתרונות ומנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2-EDTA K: בצע פתרון 100 מ&quot;מ K-2 EDTA פתרון מניות, שיכול להישמר במקרר. ביום של האוסף, לדלל פתרון אחד לחמישה (חלק אחד EDTA פתרון, מים חלקים ארבעה) כדי להשיג 20 מ&quot;מ פתרון K-2 EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא כוס או צלחת פטרי (7-15 ס&quot;מ קוטר) באמצע הדרך עם 20 מ&quot;מ פתרון K-2 EDTA. אם איסוף דגימות מטיפולים שונים (ללשעברשליטה בשפע וצמחי מלח לחוץ או גנוטיפים שונים), להכין מנות נפרדות לכל טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מספר רצוי של 1.7 צינורות תגובת מ&quot;ל עם 1.4 מ&quot;ל של 20 מ&quot;מ פתרון K-2 EDTA. מלאו מספר שווה של צינורות תגובה עם 1.4 מיליליטר מים מזוקק או autoclaved Millipore. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מגבות נייר על הספסל להגדיר צמחים ב; לקבל סכין גילוח חדש אחד ולשים את כפפות. </li></ol> 3. אוסף של השיפה exudates (מתואר בתרשים זרימה באיור 1) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שושנת קציר משאירה משישה עד שמונה צמחי בני שבוע על ידי חיתוכם עם סכין הגילוח בבסיס הקרוב לפטוטרת מרכז שושנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקם את העלים במאכלים המכילים 20 מ&quot;מ K-2 EDTA. ודא שקצה החתך של הפטוטרת הוא שקוע בפתרון (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 15 עלים כבר נאספו (צמחי 03:57 בקירוב), בעדינות לערום עלים זה על גבי זה לא כזה אחרפטוטרות חתוכות כובע מיושרות אחד עם השני. חתך מחדש את הבסיס של הפטוטרות (1 מ&quot;מ בקירוב) ולהעביר באופן מיידי את עלים לאחד מצינורות התגובה עם 20 מ&quot;מ פתרון K-2 EDTA. את העלים שיתאימו הקלים ביותר אם הם הפשילו מעט. הימנע לסחוט את העלים שבכן זה עלול לגרום לפגיעה בתאים, ובכך, מוביל לאוסף של תוכן תא עלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יש צורך בחומר, בעדינות לכסות את הדגימות עם מגבת נייר רטובה. השתמש בסט חדש של כלים אם לאיסוף דגימות מטיפולים שונים וגנוטיפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל הדגימות ממוקמות בצינורות תגובה, לאסוף את הפליטות גם בחושך או באור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוסף בחושך, קו רצפת צלחת שטוחה גדולה עם מגבות נייר רטובות. הנח את המדף עם צינורות תגובה המלאים עלים בצלחת וגם מכסה במגבות נייר רטובות או להכניס חזרה פלסטיק שחור עם חריצים לאוורור. הנח את כל ההתקנה בארון או בחדר חשוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאוסף באור, בשורה התחתונה של המכל פרספקס שקוף עם מגבות נייר רטובות. הנח את המדף עם צינורות תגובה מלא עלים במכל ולסגור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה 1, להסיר עלים בעדינות מיכל וצינורות התגובה ולשטוף ביסודיות עם מים מזוקקים, deionized או Millipore כדי להסיר את כל EDTA. צעד זה משרת שלוש מטרות: (1) הוא מסיר EDTA כדי למזער נזק לתאים, (2) שהוא מבטל את ההפרעה של EDTA עם-SDS וכרומטוגרפיה, ו (3) מסיר את כל תרכובות שהצטברו מחתך / פגומה תאים. מייד להעביר לתוך צינורות התגובה המוכנים המכילים מים autoclaved ולחזור למכלי האיסוף humidified לאוסף של פליטות. בשלב זה, להוסיף מעכב RNase אם exudate צריך לשמש להפקת RNA. אופציונלי: ניתן להוסיף מעכב proteinase אם ניתוח של חלבון הוא רצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן האוסף המיועד, לשלוף וdiscaRd העלים ולהקפיא את הפליטות השיפה בנוזל N 2 לשימוש נוסף. אם יש צורך באחסון ממושך, Lyophilize הדגימות ולאחסן ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של ארבידופסיס, יכולים כבר להתגלות מטבוליטים אחרי האוסף של פליטות במשך שעה 1. עם זאת, אוסף עבור 5-8 שעות מומלץ אם הניתוח של רכיבים פחות שפע מתוכנן. לצמחים גדולים כמו perilla, זמני איסוף ארוכים יותר (8 שעות) מומלצים. Exudate נאסף 15 עלים הוא בדרך כלל מספיק לנתיב אחד על ג&#39;ל SDS-PAGE (חלבונים), להפקת ה-mRNA, GC-MS (סוכרים ומטבוליטים). לניתוח שומנים איגום של 2-3 דגימות (exudate 30-45 עלים) מומלץ ומוביל לתוצאות ברורות יותר. </li></ol> 4. ניתוח שלאחר מכן (לוידאו אנו הצג 4.4 בלבד) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח חלבונים, מדגם resuspend ב 15 מים μl ו30 חיץ Lämmli μl, חום עד 95 צלזיוס למשך 5 דקות, לסובב במהירות במורד מעלות כל precipitates ולטעון מדגם כולו על גבי ג&#39;ל SDS-PAGE (45 כיסי טעינת μl). דוגמאות יש מוכתמות בכתמי Coomassie קולואיד או רגישים אחרים שכן שפע חלבון הוא נמוך מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסוכר וניתוח המטבוליט קטן, להוסיף derivatizing סוכנים למדגם המיובש כפי שמתואר בספרות 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן לנתח mRNA באמצעות RT-PCR, microarray או ניתוח RNA-Seq. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח שומנים בדם באופן מיידי בריכת 2:58 דגימות ומחיצה נגד כלורופורם: מתנול (1:1) במנדף כדלקמן: להוסיף כמות שווה של כלורופורם: מתנול לכל דגימה, מערבולת למשך כמה שניות, וצנטריפוגות במשך 4 דקות ב 400 x גרם. לאסוף תחתית השלב (אורגני) בשפופרת זכוכית עם פקק טפלון וחזור על פעולה עם מחיצת השלב העליון שלוש פעמים נוספות. ייבש את השלבים האורגניים המשולבים תחת זרם של N 2 ולהגיש לניתוח נוסף (Thin-שכבת כרומטוגרפיה: 14 TLC, 37; כרומטוגרפיה נוזלית-Mass: LC-MS 14). </li></ol>

יש לנו מה למסור.

אוסף EDTA-הנחייתם של השיפה פליטות הוא פשוט מאוד, זקוק לציוד מינימאלי, והיא חלה על רוב הצמחים. בסך הכל, בשיטה זו מרחיבה את היכולת לנתח ופליטות מהשיפה יותר מינים. למרות exudate הוא מדולל, זה קל לאסוף דגימות רבות ושונות או מתחנות רבות בהיקף של עד לכמות גדולה של חומר. אז זה מאפשר לזיהוי של תרכובות רומן שנמצאות בשפע נמוך מאוד והיו מעלימים בדרך אחרת. שיטה זו יכולה לשמש למספר רבים של מיני צמחים ועובדת כפי שתוארה עבור אלה המפורטים בכתב היד הזה. אם מינים חדשים הם בחנו שני ההיבטים העשויים לדרוש שינוי הם במספר העלים המשמשים את הזמן של דיות. ברוב המקרים, 07:55 דיות שעה צריכה להיות מתאימות. כדי לאשר את השימוש בשיטה זו עבור מיני צמחים חדשים, exudate צריך להיות שנאסף ואחד או יותר מהניתוח שלאחר מכן, כמתואר בפרוטוקול חלק 4 needs שיש לבצע. בהתאם לעוצמת האות ציינה, היקף הגבייה ייתכן שיהיה הצורך לשנותם. באופן כללי, שומנים בדם וניתוח חלבון ידרשו יותר חומר מאשר סוכר והמטבוליט ניתוח שכן לשעבר, הנן פחות נפוצים בפליטות השיפה. בגלל אוסף exudate EDTA-הקל כרוך משטחים לחתוך, כמו גם השפעה שעלול להזיק של EDTA, כמה נקודות יש לקחת בחשבון: (1) לאחר הדגירה שעה אחת עם EDTA, הפטוטרות צריכים לשטוף ביסודיות. זו מסירה את כל תרכובות המתקבלות מהתאים פצועים, כמו גם את EDTA עצמו, אשר יכול לגרום נזק לתאים או להפריע לחילוץ. (2) בקרות חיוביות ושליליות צריכים להיות כלולות כדי להבטיח נתונים המתקבלים נגזרים מהשיפה SAP ולא מהתאים פגועים (ראה שלבים קריטיים בהמשך). (3) השיפה SAP עושה מכיל אנזימים שונים, אשר יכול להיות פעיל במהלך איסוף exudate. לפיכך, במקרים מסוימים זה יכול להיות שימושי כדי לאסוף עבורסכומים שונים r של זמן. (4) מאחר שהשיטה מעורבת דיות למים, כימות של התרכובות מוחלטת אינה אפשרית. שלבים קריטיים: המפתח לשימוש המוצלח של שיטה זו הוא השימוש בזהירות בעת טיפול במדגם לא לפגוע בכל תאים, כמו גם את השימוש בבקרות מתאימות (ראה נ&quot;צ 14.). שליטה אחת מתאימה היא האוסף של פליטות השיפה ללא טיפול מוקדם עם EDTA. במקרה זה תהיה השיפה לאטום את עצמו ויכול להיות שנאסף לא exudate. כל תרכובות מזהמות המגיעות מהתאים הפצועים תזוהה כאן. שליטה שנייה תהיה הניתוח של סוכרים בexudate. בארבידופסיס, סוכרוז צריך להיות המטבוליט העיקרי בתוך מוהל השיפה, עם פרוקטוז לסוכרוז יחס של 1:04-01:08 (נ&quot;צ 8, 14). להפקת RNA השימוש במעכבי RNAse הוא הכרחי. בנוסף, שליטה חיובית של describ העברmRNA השיפה-מקומי אד (UBC9: אנזים יוביקוויטין conjugating 9, At4g27960; 8, 14) ובקרה שלילית של למשל mRNA הכלורופלסט (RuBisCO LSU) הם מומלץ. בגלל exudate מכיל אנזימים פעילים, כמובן זמן מומלץ לבצע שינויים בטוחים בפרופיל השיפה הן לא פשוט עקב שינויים בזמן האיסוף. במקרים מסוימים, זה עשוי להיות מועיל להשתמש במעכבי proteinase. עם זאת, החוקרים צריכים לזכור, שנאסף exudate יהיה מרוכז ושכל תרכובות נוספות תהיה מרוכזות במידה רבה. שלב קריטי שני בתוך הפרוטוקול הוא recutting של הפטוטרת תחת EDTA. צעד זה משרת מטרה כפולה: ראשית, הוא מסיר את כל צלחות מסננת אטומות תוך מניעת היווצרות של הפקקים חדשים ובכך מאפשר זרימה החופשית של SAP השיפה. שנית, זה מסיר את בועת הבקעות בעצה שנוצרה בעת חיתוך ובכך מאפשר לתחבורת עצה. גודלו של הקיצוץ השני תלויים על הצמחים בשימוש. בצמחים עם פטוטרות גדולות יותר שהוא צריך להיות כמה מילימטרים (עד 1 ס&quot;מ) מעל החתך הראשון, בצמחים כמו ארבידופסיס, 1-2 מ&quot;מ מספיקים. השימוש בשיטה זו יכולה להוביל לגילוי של תרכובות רומן בפליטות השיפה שהיה יכולים להיות איתות, השלכות התפתחותיות או ביו. זה גרם ליותר במבט מעמיק באיתות שומנים למרחקים ארוכים, מה שהייתה שדה קטן בתוך-למד מדעי צמח בשל היעדר הגישה לשיפה.

צמחים לא יכולים לזוז להימלט תנאים קשים. כתוצאה מכך, הם היו צריכים לפתח מנגנונים כדי לזהות לחצים סביבתיים, לעורר ולשדר אותות הקשורים בכל המפעל, ולהתאים פיתוח בהתאם. שתי מערכות תחבורה קיימות לחלוקת מים, חומרים מזינים וחומרים אחרים (איתות). העצה הראשונה הוא, אשר בדרך כלל מעביר מים ונלקחו על ידי השורשים ברחבי מפעל מינרלים. השני היא השיפה. התצוגה של השיפה השתנתה ממערכת תחבורה להטמיע פשוט צינור לרנ&quot;א, חלבון, וירוסים, שומנים ומולקולות קטנות אחרות. זה ממלא תפקיד חשוב בהטמעה והובלת חומרי מזון, בתגובה ללחץ יוטיים ואביוטי, כמו גם בגידול צמחים ופיתוח. עכשיו זה נקרא &quot;אוטוסטרדת המידע&quot; של הצמח 18. השיפה מורכבת מכמה סוגי תאים: השיפה parenchyma, כמו גם לוויה מיוחדת לספירהlls ואלמנטים מסננות. האלמנט המסננת הוא האתר של תנועה למרחקים ארוכים. כדי לאפשר זרימת אורך בלא הפרעה, אלמנטים מסננות חסרים רוב האברונים כמו גם גרעינים והם חשבו להכיל במקרה טוב מכונות translational מוגבלות 21, 33. הוא האמין כי תאים נלווים לסנתז חלבונים ותרכובות אחרות, הנע בזרם השיפה. תרכובות אלו מועברים לאחר מכן לאלמנט דרך מסננת plasmodesmata ויכולות לתפקד כאותות למרחקים ארוכים 4,16. מספר קבוצות של תרכובות ניתן למצוא בפליטות השיפה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוכרים הם לרוב מוצרים של פוטוסינתזה ומועברים כמולקולות נושאות &quot;אנרגיה&quot; לחלקים אחרים של הצמח לאחסון או כאבני בניין. עם זאת, הם יכולים גם לתפקד כנוזל לרדיאטור או כאיתות תרכובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתן למצוא גם חלבונים בפליטות השיפה. הם כוללים אנזימים מטבוליים אך גם איתות לתפקד. examp אחדLe של חלבון המשמש כאות התפתחותית הוא חלבון T מוקד הפריחה, מה שמסמן את האינדוקציה של פריחה, כמו גם כריתה עלה עונתית בצמחים. 6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצות גרעין נמצאות בפליטות השיפה בצורה של mRNA, RNA הקטן ומיקרו, וRNAs הנגיפי. הם מופיעים להיות מעורבים במידה רבה באיתות 27, 28, 39. במקביל, rRNA וtRNAs עבור כמעט כל חומצות אמינו כבר נצפו בSAP השיפה של cucurbits 42. הם מופיעים שיועברו באופן סלקטיבי למערכת הצינור המסננת. את tRNAs להראות שינויים הדרושים ליכולת להעביר חומצות אמינו למנגנון translational. עם זאת, במקום להשתתף בתרגום, הם מופיעים כדי לעכב את התהליך הזה. לחלופין, הם יכולים לשמש כמקור לציטוקינין או לאותת מצב מטבולי של המפעל 42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצות שומן, oxylipins, ושומנים אחרים יש גם נמצאים בהשיפה 3 פליטות, 13, 14, 23. JasmoNIC חומצה, כ מהלכי oxylipin דרך השיפה כחלק מהתגובה לזיהום הפתוגן 22, 29, 31, 32. אמנם התפקיד של רוב השומנים השיפה עדיין לא ברור, חלקם עשוי להיות איתות פונקציה 4. </li></ul> האתגר בעבודה עם השיפה צמח טמון ביכולתה לאטום את עצמו על פציעה. ישנן ארבע שיטות עיקריות המשמשות לאיסוף פליטות השיפה, ובכל זאת הם עובדים רק במינים נבחרים: 1) בcucurbits זה אפשרי כדי להשיג כמויות סבירות של exudate השיפה דרך חתכים של הפטוטרת. ברגע שהוא הסיר את הירידה הראשונית עם זיהום של תאים פגועים, זה אפשרי כדי להשיג כמויות גדולות למדי של השיפה הטהורה 1 SAP, 15. עם זאת, עם זמן אוסף גדל והולך, exudate מתעבה זה, מה שהופך אותו מתאים יותר לגישות כרומטוגרפיה נוזליות (לא פורסם). הפרסומים אחרונים מראים, שבהתאם למין, השיפה SAP זו נגזר מeither שfascicular (FP) או השיפה extrafascicular (EP), ובזמן שהיא עושה מכילה &quot;ניידת&quot; השיפה SAP מהאלמנטים מסננות (FP), הוא גם נוטה זיהום מסוגים אחרים של תאים, כולל העצה 40, 41 . 2) גישה שנייה היא להשיג השיפה SAP דרך חתכים רדודים או נקבים בגזע או פטוטרת. שיטה זו שימש בהצלחה ב17 תורמוס, 25, 36 cucurbits, וBrassica 12 napus. כאן הזיהום מהתאים פגועים הוא מינימאלי והפליטות מאוד טהור. עם זאת, צמחים צריכים להיות בריא ומושקה היטב שכן הוא מאוד מאתגר באופן סלקטיבי רק את האלמנטים לנקב המסננת. אם צינורות העצה הם חתוכות, כל exudate נשאב לתוך זרם העצה. זה הופך את השיטה אינה מתאימה לצמחים עם פטוטרות או גבעולים מאוד שבירים או lignified מאוד. 3) stylectomy הכנימה מאפשר כנימות להכניס stylet לאלמנטים מסננותn הסרת הכנימה עם לייזר. השיפה SAP הוא הקרין דרך 2 stylet הנותר, 9, 10, 35, 38. בתאוריה, כל צמח שיכול להיות נגוע על ידי כנימות יכול לשמש לגישה זו. עם זאת, רוב מנהלי חממה או חדר צמיחה לא יתמכו בשימוש במחולל מחלה. בנוסף, כנימות להציג כמה חלבונים לתוך השיפה עם הרוק שלהם 19, 33. זה מוביל למוגבל תעתיק תכנות מחדש 30 ויש לו את הפוטנציאל לשנות את הרכב השיפה 26. 4) השיטה שתוארה כאן היא דיות EDTA-הנחייתם של השיפה SAP. שיטה זו מעסיקה EDTA כדי למנוע אטימה של השיפה 20. EDTA chelates Ca 2 + יונים שאחרת משתתפים בתהליכים האוטמים השיפה. בעוד EDTA יכול להוביל לתא נזק 30, מספר קבוצות השתמשו בשיטה זו וציינו אין השפעה שלילית של ריכוזי EDTA מ -10 מ&quot;מ ועד 20 מ&quot;מ בתא או על ultrastructure phloeמ &#39;טוען והובלה 5, 24. כדי להפחית את השפעה מזיקה כלשהי, כמו גם התערבות של EDTA עם כרומטוגרפיה וג&#39;ל אלקטרופורזה, צמחים עברו למים לאחר שעות 1 ורק חלק מאוחר יותר של exudate משמש 14. כך, במקום דיות לEDTA, השיפה היא exudated לתוך מים (EDTA-הקל דיות). זוהי עלות ישר קדימה, נמוכה ונמוך טק שיטה לאיסוף פליטות השיפה. השיפה SAP הושג בדרך זו ניתן להשתמש בו כדי לנתח את החלבונים, מולקולות קטנות, שומנים, וRNAs ושמש בהצלחה בצמחים רבים. אמנם כמות מוגבלת של ניסויים שבוצעה בmonocots 11, השיטה שנראה מתאים יותר לdicots (17 perilla, 20, ארבידופסיס 8, 13, 14, צפצפה 7). אוסף של פליטות צריך להתרחש בסביבה לחה כדי למנוע אובדן של פליטות באמצעות דיות. בהתאם לצמח, בדגירת EDTA לשעה עד שעות היאמספיק כדי למנוע איטום של האלמנטים השיפה / מסננת. לאחר מכן האוסף יכול להתרחש במים. זו יש את היתרון של מניעת ההשפעה השלילית יש EDTA על מבנה תא ויציבות. זה גם מבטל את ההפרעה של EDTA עם שיטות כמו HPLC או-SDS. הוא הראה שהוא חל על ארבידופסיס. לצמחים גדולים יותר, יש דגירה באוספי EDTA וexudate כדי להיות מדורגת ומתבצעת בכוסות ולא בצינורות תגובת 1.7 מ&quot;ל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="638">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">K2-EDTA</td>
			<td style="width:152px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:111px;">ED2P-500G</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Shallow Glass or plastic Petri Dish (7-15 cm)</td>
			<td>PYREX or Corning</td>
			<td></td>
			<td>Any clean, shallow dish will work</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>EMD</td>
			<td>CX1054-1</td>
			<td style="width:223px;">Only open containers in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methanol</td>
			<td style="width:152px;">J.T.Baker</td>
			<td style="width:111px;">9070-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">VWR International</td>
			<td style="width:111px;">53283-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Screw cap tubes</td>
			<td style="width:152px;">Sun Sri</td>
			<td style="width:111px;">13-425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Eppendorf tubes</td>
			<td style="width:152px;">Denville</td>
			<td style="width:111px;">C2170</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection and analysis of arabidopsis phloem exudates using the edta-facilitated method

השיפה המפעל חיונית להובלה למרחקים ארוכים של (צילום) מטמיע כמו גם שינוע של אותות מתח יוטיים או אביוטי. הוא מכיל סוכרים, חומצות אמינו, חלבונים, RNA, שומנים ומטבוליטים אחרים. אמנם יש לו עניין גדול בהבנה את ההרכב והתפקוד של השיפה, התפקיד של רב מהמולקולות האלה וכך, חשיבותם בהתפתחות מפעל ואת לחץ תגובה טרם נקבעה. מכשול אחד לניתוח השיפה טמון בעובדה שאת החותמות השיפה עצמו על פצע. כתוצאה מכך, מספר הצמחים שממנו ניתן להשיג השיפה SAP הוא מוגבל. שיטה אחת המאפשרת לאוסף של פליטות השיפה ממספר מיני צמחים ללא צורך בציוד נוסף היא אוסף EDTA-הקל השיפה exudate שתואר כאן. אמנם קל לשימוש, היא עושה להוביל לפציעתם של תאים ויש לו טיפול שיש לנקוט כדי להסיר את התוכן של תאים פגועים. בנוסף, מספר פקדים להוכיח טוהר exudateהם הכרחיים. בגלל זה הוא דיות ולא כאוסף ישיר של SAP השיפה (לא אפשרי במינים רבים) כימות יחסי היחיד של התוכן שלה יכול להתרחש. היתרון של שיטה זו על פני אחרים הוא שניתן להשתמש בו בעשבוני רבים או מיני צמחים עציים (perilla, ארבידופסיס, צפצפה, וכו &#39;) ודורש ציוד והכשרה מינימאלי. זה מוביל לכמויות גדולות למדי של פליטות שיכולים לשמש לניתוח שלאחר מכן של חלבונים, סוכרים, שומנים, רנ&quot;א, וירוסים ומטבוליטים. זה די פשוט, כי זה יכול להיות בשימוש גם במחקר וגם בהוראה במעבדה.

זה הפך להיות ברור בשנים האחרונות כי המורכבות של SAP השיפה עשויות להיות התשובה לשאלה כיצד צמחים שונים לשלוח אותות התפתחותיים ומתח לתשובה אופטימלית. באמצעות EDTA-הקלו דיות השיפה עשויה לספק ההזדמנות לנתח פליטות השיפה מצמחים כי הם אינם מתאימים לגישות אחרות, אך עשוי להיות עניין כלכלי או פיסיולוגי. שיטה זו מאפשרת לקציר של השיפה exudates מספיק כדי לזהות חלבוני השיפה-מקומיים ולזהות שינויים ברמה שלהם בתגובה לפיתוח או מתח (איור 3). כפי שעולה מהדמות, הם בשפע חלבונים נמוך מאוד, ובכל זאת, רמתם גבוהה מספיק לניסויי proteomics שלאחר מכן באמצעות LC-MS/MS או לניתוח כתם מערבי. ממצאים מראים כי בcucurbits החיתוך של הגזע מוביל להפרת איזון פוטנציאל המים וזרם של מים ולאחר מכןמזהמים אפשריים מapoplast 41. עם זאת, אוסף לפעמים בטווח של אחת לשמונה שעות אינו משפיע על פרופיל השיפה החלבון / הרכב בארבידופסיס (. רק הסכום המוחלט משתנה Guelette ואח&#39;), את כמות החלבון שנאסף ואת התבנית של חלבונים הנמצאים משתנה בין מינים (ארבידופסיס: ב; perilla, ליין אני וNI) וטיפולים (perilla גדל באורכי יום שונים, נתיב ואני NI). כאותות חלבוניים תוצאה יכולים להיות דמיינו שנוצר, ואחריו. יכול גם להיות מזוהה RNAs mRNA ומיקרו ובפליטות השיפה בשיטה זו. עם זאת, טיפול במעכבי RNAse נחוץ כדי למנוע השפלה של mRNA בזמן הדיות המורחב. מאז האלמנטים מסננות אינם מכילים כלורופלסטים פונקציונליים, מקטע קטן או גדול RuBisCO (RBCs או RbcL, בהתאמה) יכול לשמש כmRNAs בקרות שליליות, בעוד ידוע השיפההמקומי-mRNA כמו אנזים יוביקוויטין-conjugating עשוי לשמש כביקורת חיובית (איור 4). באופן דומה, ניתן לנתח סוכרים או מטבוליטים קטנים או באמצעות GC-MS או LC-MS. כאן ראוי לציין, כי הפליטות השיפה מכילות מספר גדול של אנזימים פונקציונליים, כולל כמעט כל מסלול 12 glycolytic. לפיכך, שימוש במספר נקודות זמן עשויה לחשוף תהליכי חילוף חומרים באוסף exudate. דוגמה לכך היא שמוצגת באיור 5: בכל הפליטות, סוכרוז הוא מטבוליט הנפוץ ביותר, זה ברור ביותר לאחר אוסף במשך שעה 1. עם זאת, לאחר חמש שעות סוכרוז יחס פרוקטוז מצטמצם מעט. אם אותו exudate נאסף במשך שעה אחת והשאיר על הספסל במשך ארבע שעות הבאות, סוכרוז לפרוקטוז יחס מצטמצם במידה ניכרת, מה שמרמז כי אנזימים פעילים בהשיפה exudates להוביל לפירוק של סוכרוז בחדר TEMperature (לעוד פרשנויות שיא לראות 14). זה עולה בקנה האחד עם ממצאים שטעינה והובלה של מולקולות מתאי נלווים לאלמנטים מסננות השיפה עשויה להימשך בדיות עד שהמערכת מאבדת את החיוניות שלו 34. שומנים בפליטות השיפה, ובהרחבה, שומני איתות למרחקים ארוכים הם תחום חדש יחסית של עניין במדע במפעל. בשל טבע השומנים הידרופובי נמצאים רק בריכוזים נמוכים ועשויים להיות מחויב למולקולות אחרות לsolubilization. ובכל זאת, דיות EDTA-הקל מאפשרת האיסוף של חומר מספיק כדי להמחיש (TLC; איור 6) ולזהות (LC-MS; איור 7) שומנים השיפה מכמה מיני צמחים. כדמות מראה את זה ניתן לזהות ולהפריד בין כמה מיני שומנים בדם. LC-MS מאפשר לזהות מיני שומנים שונים ולעקוב אחר שינויים במסגרת פרופיל השומנים של differeגנוטיפים NT או טיפולים. זה מאפשר ללימוד התפקיד של שומנים בהתפתחות צמח ותגובה ללחץ. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. תרשים זרימה של האוסף של פליטות השיפה של ארבידופסיס או perilla. מסלולים שונים יובילו למוצרי קצה שונים, שמסומנים בכחול. להכנה של רנ&quot;א, RNAse מעכב (100 U / מ&quot;ל, רוש) הוא הוסיף למים שלתוכו exudate השיפה נאסף. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig1highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. התקנה של חומרים לexudate השיפה לאסוףיון. ההתקנה מציגה את כל החומרים הדרושים לפרוטוקול צעדים 3.1-3.4. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig3.jpg" width="600px" /> . חלבונים איור 3 נמצאו בהשיפה פליטות של שני מינים שונים, צמח ארבידופסיס (AT) וperilla (אני וNI; אורכי יום שונים); MW: סמן משקל מולקולרי (מסלול 2). חלבונים הופרדו באמצעות שיפוע 10-20%-SDS. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig4.jpg" width="600px" /> איור 4. ניתוחלנוכחות של mRNA למקטע קטן וגדול RuBisCO (RBCs וRbcL, בהתאמה) ואנזים היוביקוויטין-conjugating (UBC). mRNA נאסף מעלי ארבידופסיס (L), פטוטרות (P), ולפליטות השיפה (pH), להפוך תמלילים עיבד וספציפיים דמיינו באמצעות PCR. הדמות שונה מGuelette et al. 14. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig4highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig5.jpg" width="600px" /> פרופיל GC-MS 5. דמותו של השיפה exudates נאסף לכמות פעמים שונה. שים לב איך את הכמות היחסית של שינויי סוכרוז מאוסף 1 שעה () עד 5 שעות של זמן אוסף (ב &#39;). Exudate פרופיל לאחר איסוף במשך שעה 1 ואחריו &quot;דגירה&quot; בחדר<html> טמפרטורה (RT) במשך ארבע שעות (C). פרופיל המטבוליט ליף (ד &#39;). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig5highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig6.jpg" width="600px" /> איור 6. דק שכבת הכרומתוגרמה השוואת שומנים מperilla (משמאל) ועלים (מימין) וארבידופסיס exudates השיפה. כוכביות מצביעות שומנים ספציפיים לפליטות השיפה. DGDG: digalactosyldiacylglycerol; PG: phosphatidylglycerol; MGDG: monogalactosyldiacyglycerol; חלק מהצגת דמות שומני ארבידופסיס שונה מGuelette ואח&#39; 14.. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig6highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> NT &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51111/51111fig7.jpg" width="600px" /> איור 7. פרופיל שומנים של פליטות השיפה של ארבידופסיס (כלורופורם שלב) באמצעות מצב יון שלילי LC-MS /. גרפים בחלק העליון (מוטציה,) ותחתונה (wild-type, ב &#39;) מראים את ההבדלים בפרופיל השומנים בין שני גנוטיפים שונים (מסומן בחצים). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51111/51111fig7highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method at JoVE.com

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

collection-analysis-arabidopsis-phloem-exudates-using-edta

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Complexometric Titration, Precipitation Titration, and Gravimetry

SCIENTISTS IN ACTION

24.3K Views.  Michigan State Universtiy.  ידע של ההרכב של SAP השיפה כמו גם את המנגנון של התחבורה והטעינה למרחקים ארוכים שלה הוא חיוני להבנה של איתות למרחקים ארוכים בפיתוח ומתח / תגובת פתוגן צמח ולהטמיע תחבורה. כתב יד זה מתאר את האוסף של פליטות השיפה בשיטה EDTA-הקל. 

Video: Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of plant leaves or vertebrate lungs further difficulties arise from multiple transitions in refractive index between cellular components, between cells and airspaces and between the biological tissue and the rest of the optical system. Moreover, refractive index mismatches lead to attenuation of fluorophore excitation and signal emission in fluorescence microscopy. We describe here the application of the perfluorocarbon, perfluorodecalin (PFD), as an infiltrative imaging medium which optically improves laser scanning confocal microscopy (LSCM) sample imaging at depth, without resorting to damaging increases in laser power and has minimal physiological impact2. We describe the protocol for use of PFD with Arabidopsis thaliana leaf tissue, which is optically complex as a result of its structure (Figure 1). PFD has a number of attributes that make it suitable for this use3. The refractive index of PFD (1.313) is comparable with that of water (1.333) and is closer to that of cytosol (approx. 1.4) than air (1.000). In addition, PFD is readily available, non-fluorescent and is non-toxic. The low surface tension of PFD (19 dynes cm-1) is lower than that of water (72 dynes cm-1) and also below the limit (25 - 30 dyne cm-1) for stomatal penetration4, which allows it to flood the spongy mesophyll airspaces without the application of a potentially destructive vacuum or surfactant. Finally and crucially, PFD has a great capacity for dissolving CO2 and O2, which allows gas exchange to be maintained in the flooded tissue, thus minimizing the physiological impact on the sample. These properties have been used in various applications which include partial liquid breathing and lung inflation5,6, surgery7, artificial blood8, oxygenation of growth media9, and studies of ice crystal formation in plants10. Currently, it is common to mount tissue in water or aqueous buffer for live confocal imaging. We consider that the use of PFD as a mounting medium represents an improvement on existing practice and allows the simple preparation of live whole leaf samples for imaging.

A Simple Method for Imaging Arabidopsis Leaves Using Perfluorodecalin as an Infiltrative Imaging Medium

We describe the use of perfluorodecalin as an infiltrative mounting medium. This is a simple method for improving depth of imaging in Arabidopsis thaliana leaf tissue with minimal physiological impact.

שיטה פשוטה הדמיה ארבידופסיס מותיר שימוש Perfluorodecalin כנושאת הדמיה Infiltrative

The problem of acquiring high-resolution images deep into biological samples is widely acknowledged1. In air-filled tissue such as the spongy mesophyll of ...

Blood Collection for Biochemical Analysis in Adult Zebrafish

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of molecular events and therapeutic strategies as well as for evaluating the physiological mechanisms of some pathologies1. 
There are relatively few publications related to adult zebrafish physiology of organs and systems2, which may lead researchers to infer that the basic techniques needed to allow the exploration of zebrafish systems are lacking3. Hematologic biochemical values of zebrafish were first reported in 2003 by Murtha and colleagues4 who employed a blood collection technique first described by Jagadeeswaran and colleagues in 1999. Briefly, blood was collected via a micropipette tip through a lateral incision, approximately 0.3 cm in length, in the region of the dorsal aorta5. Because of the minute dimensions involved, this is a high-precision technique requiring a highly skilled practitioner. The same technique was used by the same group in another publication in that same year6. In 2010, Eames and colleagues assessed whole blood glucose levels in zebrafish7. They gained access to the blood by performing decapitations with scissors and then inserting a heparinized microcapillary collection tube into the pectoral articulation. They mention difficulties with hemolysis that were solved with an appropriate storage temperature based on the work Kilpatrick et al.8. When attempting to use Jagadeeswaran's technique in our laboratory, we found that it was difficult to make the incision in precisely the right place as not to allow a significant amount of blood to be lost before collection could be started. 
Recently, Gupta et al.9 described how to dissect adult zebrafish organs, Kinkle et al.10 described how to perform intraperitoneal injections, and Pugach et al.11 described how to perform retro-orbital injections. However, more work is needed to more fully explore basic techniques for research in zebrafish.
The small size of zebrafish presents challenges for researchers using it as an experimental model. Furthermore, given this smallness of scale, it is important that simple techniques are developed to enable researchers to explore the advantages of the zebrafish model.

This paper presents a technique for collection of blood from the dorsal aorta of Zebrafish. It also provides instructions for obtaining serum for use in biochemical analyses, such as tests for determining cholesterol and triglyceride levels.

הדם אוסף של ניתוח ביוכימי דג הזברה למבוגרים בלבד

The zebrafish has been used as an animal model for studies of several human diseases. It can serve as a powerful preclinical platform for studies of ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Collection, Isolation and Enrichment of Naturally Occurring Magnetotactic Bacteria from the Environment

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of Massachusetts (USA). Since then MTB have been discovered in stratified water- and sediment-columns from all over the world2. One feature common to all MTB is that they contain magnetosomes, which are intracellular, membrane-bound magnetic nanocrystals of magnetite (Fe3O4) and/or greigite (Fe3S4) or both3, 4. In the Northern hemisphere, MTB are typically attracted to the south end of a bar magnet, while in the Southern hemisphere they are usually attracted to the north end of a magnet3,5. This property can be exploited when trying to isolate MTB from environmental samples.
One of the most common ways to enrich MTB is to use a clear plastic container to collect sediment and water from a natural source, such as a freshwater pond. In the Northern hemisphere, the south end of a bar magnet is placed against the outside of the container just above the sediment at the sediment-water interface. After some time, the bacteria can be removed from the inside of the container near the magnet with a pipette and then enriched further by using a capillary racetrack6 and a magnet. Once enriched, the bacteria can be placed on a microscope slide using a hanging drop method and observed in a light microscope or deposited onto a copper grid and observed using transmission electron microscopy (TEM).
Using this method, isolated MTB may be studied microscopically to determine characteristics such as swimming behavior, type and number of flagella, cell morphology of the cells, shape of the magnetic crystals, number of magnetosomes, number of magnetosome chains in each cell, composition of the nanomineral crystals, and presence of intracellular vacuoles.

We demonstrate a method to collect magnetotactic bacteria (MTB) that can be applied to natural waters. MTB can be isolated and enriched from sediment samples using a relatively simple setup that takes advantage of the bacteria's natural magnetism. Isolated MTB can then be examined in detail using both light and electron microscopy.

אוסף, בידוד והעשרה של חיידקים המתרחשים באופן טבעי מMagnetotactic הסביבה

Magnetotactic bacteria (MTB) are aquatic microorganisms that were first notably described in 19751 from sediment samples collected in salt marshes of ...

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the adult plant. The female SMC (megaspore mother cell, MMC) differentiates in the ovule primordium and undergoes meiosis. The selected haploid megaspore then undergoes mitosis to form the multicellular female gametophyte, which will give rise to the gametes, the egg cell and central cell, together with accessory cells. The limited accessibility of the MMC, meiocyte and female gametophyte inside the ovule is technically challenging for cytological and cytogenetic analyses at single cell level. Particularly, direct or indirect immunodetection of cellular or nuclear epitopes is impaired by poor penetration of the reagents inside the plant cell and single-cell imaging is demised by the lack of optical clarity in whole-mount tissues.
Thus, we developed an efficient method to analyze the nuclear organization and chromatin modification at high resolution of single cell in whole-mount embedded Arabidopsis ovules. It is based on dissection and embedding of fixed ovules in a thin layer of acrylamide gel on a microscopic slide. The embedded ovules are subjected to chemical and enzymatic treatments aiming at improving tissue clarity and permeability to the immunostaining reagents. Those treatments preserve cellular and chromatin organization, DNA and protein epitopes. The samples can be used for different downstream cytological analyses, including chromatin immunostaining, fluorescence in situ hybridization (FISH), and DNA staining for heterochromatin analysis. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) imaging, with high resolution, followed by 3D reconstruction allows for quantitative measurements at single-cell resolution.

An Efficient Method for Quantitative, Single-cell Analysis of Chromatin Modification and Nuclear Architecture in Whole-mount Ovules in Arabidopsis

We provide here an efficient and reliable protocol for immunostaining, Fluorescence in&#160;situ Hybridization, DNA staining followed by quantitative, high-resolution imaging in whole-mount Arabidopsis thaliana ovules. This method was successfully used to analyze chromatin modifications and nuclear architecture.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

In flowering plants, the somatic-to-reproductive cell fate transition is marked by the specification of spore mother cells (SMCs) in floral organs of the ...

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently attach a tagged form of dUTP to 3&#8217; ends of double- and single-stranded DNA breaks in cells. It is a reliable and useful method to detect DNA damage and cell death in situ. This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method of semi-automated TUNEL signal quantitation. Inherent normal tissue features and tissue processing conditions affect the ability of the TdT enzyme to efficiently label DNA. Tissue processing may also add undesirable autofluorescence that will interfere with TUNEL signal detection. Therefore, it is important to empirically determine tissue processing and TUNEL labeling methods that will yield the optimal signal-to-noise ratio for subsequent quantitation. The fluorescence-based assay described here provides a way to exclude autofluorescent signal by digital channel subtraction. The TUNEL assay, used with appropriate tissue processing techniques and controls, is a relatively fast, reproducible, quantitative method for detecting apoptosis in tissue. It can be used to confirm DNA damage and apoptosis as pathological mechanisms, to identify affected cell types, and to assess the efficacy of therapeutic treatments in vivo.

Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method

This video describes dissection, tissue processing, sectioning, and fluorescence-based TUNEL labeling of mouse skeletal muscle. It also describes a method for semi-automated analysis of TUNEL labeling.

זיהוי וניתוח של נזק לדנ&quot;א בשרירי שלד עכבר<em&gt; באתר</em&gt; שימוש בשיטת TUNEL

Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) deoxyuridine triphosphate (dUTP) nick end labeling (TUNEL) is the method of using the TdT enzyme to covalently ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of microbial contaminants present on the seed surface. Currently, Arabidopsis seeds are sterilized using two distinct sterilization techniques in conditions that differ slightly between labs and have not been standardized, often resulting in only partially effective sterilization or in excessive seed mortality. Most of these methods are also not easily scalable to a large number of seed lines of diverse genotypes. As technologies for high-throughput analysis of Arabidopsis continue to proliferate, standardized techniques for sterilizing large numbers of seeds of different genotypes are becoming essential for conducting these types of experiments. The response of a number of Arabidopsis lines to two different sterilization techniques was evaluated based on seed germination rate and the level of seed contamination with microbes and other pathogens. The treatments included different concentrations of sterilizing agents and times of exposure, combined to determine optimal conditions for Arabidopsis seed sterilization. Optimized protocols have been developed for two different sterilization methods: bleach (liquid-phase) and chlorine (Cl2) gas (vapor-phase), both resulting in high seed germination rates and minimal microbial contamination. The utility of these protocols was illustrated through the testing of both wild type and mutant seeds with a range of germination potentials. Our results show that seeds can be effectively sterilized using either method without excessive seed mortality, although detrimental effects of sterilization were observed for seeds with lower than optimal germination potential. In addition, an equation was developed to enable researchers to apply the standardized chlorine gas sterilization conditions to airtight containers of different sizes. The protocols described here allow easy, efficient, and inexpensive seed sterilization for a large number of Arabidopsis lines.

The objective of this study was to determine the effects of bleach and chlorine gas sterilization on seed germination of a range of Arabidopsis genotypes grown on sterile media. Optimized sterilization protocols have been developed to prevent the growth of microbial contaminants while providing satisfactory seed survival.

שיטה סטנדרטית עבור תפוקה גבוהה עיקור של תודרנית זרעים

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light conditions, which are preferably variable in quantity and quality so that studies under different setups can be conducted. These requirements are met by climatic chambers featuring light emitting diodes (LED) lights, which can &#8211; in contrast to fluorescent lights &#8211; be set to different wavelengths. LEDs are energy conserving and emit virtually no heat even at light intensities, which often constitutes a problem with other light sources. The presented protocol provides a step-by-step guidance of how to program a climatic chamber equipped with variable LED lights as well as describing several approaches for in depth analysis of growth phenotypes. Depending on the experimental set-up various characteristics of the growing plants can be observed and analyzed. Here we describe how to determine fresh weight, leaf area, photosynthetic activity, and stomatal density. We demonstrate that in order to obtain reliable data and draw valid conclusions it is mandatory to use a sufficient number of individuals for statistical evaluation. Taking too few plants for this kind of analysis results in high statistical errors and consequently in less clear interpretations of the data.

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Here, we present a protocol for studying plant growth behavior and especially phenotypes in a reproducible manner. We show how to provide variable and at the same time stable light conditions. Proper analyses depend on sufficient sample numbers and valid statistical evaluations.

ניתוח התנהגות גדילה תודרנית לבנה באיכויות שונות אור

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is regulated spatially and temporally. The use of a fluorescent gene under the control of an immunity-related promoter in combination with an automated fluorescence microscopy is a simple way to understand spatiotemporal regulation of plant immunity. In contrast to the root tissues that have been used for a number of various intravital fluorescent imaging experiments, there exist few fluorescent live-imaging examples for the leaf tissues that encounter an array of airborne microbial infections. Therefore, we developed a simple method to mount leaves of Arabidopsis thaliana plants for live-cell imaging over an extended period of time. We used transgenic Arabidopsis plants expressing the yellow fluorescent protein (YFP) genefused to the nuclear localization signal (NLS) under the control of the promoter of a defense-related marker gene, Pathogenesis-Related 1 (PR1). We infiltrated a transgenic leaf with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (avrRpt2) strain (Pst_a2) and performed in vivo time-lapse imaging of the YFP signal for a total of 40 h using an automated fluorescence stereomicroscope. This method can be utilized not only for studies on plant immune responses but also for analyses of various developmental events and environmental responses occurring in leaf tissues.

A Versatile Method for Mounting Arabidopsis Leaves for Intravital Time-lapse Imaging

We report a simple and versatile method for performing fluorescent live-imaging of Arabidopsis thaliana leaves over an extended period of time. We use a transgenic Arabidopsis plant expressing a fluorescent reporter gene under the control of an immunity-related promoter as an example for gaining spatiotemporal understanding of plant immune responses.

שיטה רב-תכליתי עבור הרכבה תודרנית יוצא Intravital הדמיה בצילום מואץ

The plant immune response associated with a genome-wide transcriptional reprogramming is initiated at the site of infection. Thus, the immune response is ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.