עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות המענקים AR055686 וAR060836 ומלגה הבתר לספירה על ידי צרפתים ניוון שרירים אגודה (AFM). מתקן ההדמיה הסלולרית מנוצל במחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי HD040677.

1. תיקון קרום תא הדמיה באמצעות גורף (חרוז זכוכית) פציעה פרוטוקול זה מאפשר בנפרד סימון התאים נפצעו ואלה שלא מצליחים לרפא. כימות אוכלוסיות של תאים אלה מחייב שימוש בשלושה תנאים: 1. מבחן (C1) - תאים רשאים לתקן בנוכחות של Ca 2 +, 2. בקרת 1 (אין C2 פציעה) - תאים מודגרת בנוכחות של Ca 2 +, אך לא נפגעו, ו 3. בקרה 2 (אין C3 תיקון) - תאים רשאים לתקן בהעדר Ca 2 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדל תאים ל&gt; מפגש 50% בשלושה coverslips סטרילית ולשטוף C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס וcoverslips העברה על O-טבעות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של פתרון prewarmed FITC dextran בCIM על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 על ידי בעדינות מגלגל 40 חרוזי זכוכית מ&quot;ג על coverslip בטמפרטורת חדר על ידי coverslips הטיה באופן ידני חזרה ושוב 6-8 פעמים בזווית של ° 30. הערה: לפציעה קלה, להבטיח את חרוזי הזכוכית מפוזרים באופן אחיד, ובכך למזער את הפציעות חוזרות. כדי לשפר את שחזור של פגיעה בין דגימות, בו זמנית לבצע את פציעת חרוז זכוכית של דגימות השונות כדי להשוות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO 2 הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלי לתת חרוזים להתגלגל, להסיר את חרוזי הזכוכית וdextran FITC על ידי שטיפה עם CIM (C1 ו-C2) או PBS (C3) ב37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslips חזרה על טבעת O ולהוסיף לפתרון prewarmed יזין ניתן לתקן dextran TRITC בCIM 100 μl על C1 ו-C2 או ב-PBS על C3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בסביבת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips פעמיים עם CIM prewarmed ולתקן עם PFA 4% ל10 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בצבע Hoechst. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף samples פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת הרכבה ותאי תמונה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתאים מC2 כדי לקבוע את עוצמת כתמים האדומה וירוקה ברקע ולהשתמש בערך הזה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון מספר כולל של תאים ש) ירוק (נפצע ומתוקן) ו ב) אדומים או שניהם אדומים וירוק (נפצע, אך לא הצליחו לתקן) בדגימות C1 ו-C3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי ספירה&gt; 100 הירוקים לכל מצב ולהביע את החלק היחסי של תאים שלא הצליחו לתקן כאחוז מכל נפגעו התאים (הירוק ואדום). </li></ol> 2. הדמיה חיה של קינטיקה של תיקון קרום תא בעקבות פגיעה הלייזר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם CIM prewarmed ולאחר מכן לשים את coverslip בCIM עם צבע FM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip בבעל בחממה העליונה שלב נשמרה על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר אזור 1-2 מ&quot;מ 2 של קרום התא, ולהקרין ל&lt;; 10 אלפיות שני עם לייזר הפעם. להחליש את כוח הלייזר דרך התוכנה כדי 40-50% מהחשמל בשעתי השיא. כוח אופטימלי מאפשר פגיעה עקבית, אך לא קטלנית וזה צריך להיקבע על ידי ניסוי וטעייה עבור קו מכשיר והתא בודדים כל אחד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על תיקון, תמונה כל 10 שניות בepifluorescence וbrightfield, החל לפני פציעה ולהמשיך ל3-5 דקות בעקבות פציעה. הערה: אין שליטת תיקון, חזור על שלבים 2.1-2.4 עם התאים נפצעו בPBS המכילים צבע FM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת את קינטיקה של תיקון, למדוד הקרינה לצבוע FM הסלולרי, ותתאר את השינוי בעוצמת (ΔF/F0) במהלך ההדמיה. נתונים אלו צריכים להיות בממוצע במשך 10 תאים בכל תנאי וזממו כממוצע או הערך של התא בודד, לפי צורך. </li></ol> 3. גורף הדמיה (חרוז זכוכית) פגיעה הנגרם על lysosomal exocytosis דוגמאות כוללות תאים הבאים גדלו&gt; 50%נקודת המפגש: 1. מבחן (C1) - תאים אפשרו לתקן בנוכחות של Ca 2 +, 2. בקרת 1 (C2; אין פגיעה) - תאים לא נפגעו ולא הודגרו עם נוגדן ראשוני, ו 3. בקרה 2 (C3; לא תיקון) - תאים אפשרו לתקן בהעדר Ca 2 +. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף coverslips C1 ו-C2 פעמיים עם CIM על 37 מעלות צלזיוס וC3 עם PBS על 37 מעלות צלזיוס ולהעביר אותם על O-טבעות סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספה של דקסטראן prewarmed יזין ניתן לתקן TRITC בCIM על C1 ו-C2 ובPBS על C3 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגוע בקרום פלזמה על C1 ו-C3 כמו בשלב 1.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנעות גלגול נוסף של חרוזים, להעביר את כל coverslips לחממת 37 ° C ב-CO 2 הסביבה ולאפשר תיקון כדי להמשיך למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את חרוזי הזכוכית וdextran TRITC ידי שטיפת coverslips במדיום גידול קר, שוב הבטחה אין מתגלגל של חרוזי זכוכית על התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips פעמיים עם מדיום גידול קר ולהעביר לטבעות האטימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לC1 ו-C3, להוסיף נוגדן LAMP1 עכברוש אנטי עכבר 100 μl בתקשורת צמיחה מלאה קרה ולהוסיף את תקשורת הצמיחה הקרה, המלאה לC2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאפשר לנוגדנים מחייבים coverslips דגירה למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את coverslips שלוש פעמים עם CIM הקר ולתקן את כל coverslips עם PFA 4% ל10 דקות ב RT ולאחר מכן לשטוף 3x עם CIM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל coverslips בחסימת פתרון ל15 דקות ב RT 100 μl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל coverslips ב100 μl אלקסה פלואוריד 488 נוגדן אנטי עכברוש ל15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פעמיים עם PBS ו דגירה למשך 2 דקות ב RT בHoechst. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים פעמיים עם PBS, הר בשקופית באמצעות תקשורת ותדמית הרכבה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתמונות של תאי C2, לקבוע את מכתים ספציפי רקע באדום (dextran TRITC) וירוק ערוצים (נוגדן אלקסה פלואוריד 488) ולהשתמש בערכי מכתים רקע אלה לסף הערוצים האדומים וירוקים לכל הדגימות (C1-C3). &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב&gt; 100 התאים האדומים שכותרתו מC1 ו-C3 כדי למדוד את עוצמת כתמי LAMP1 (ירוק) בתאים פגועים. לניסוי מוצלח מכתים LAMP1 בתאים מC3 יהיה נמוך יותר באופן משמעותי מאשר בתאים מC1. </li></ol> 4. הדמיה חיה של קרום תא פגיעה מופעלת על סחר subcellular <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluorescently לתייג תא של עניין על ידי transfecting כתב מתאים (למשל CD63-GFP לlysosomes 8) או על ידי שימוש בצבעי ניאון 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לlysosomes תיוג עם צבע פלואורסצנטי, דגירה תאים המבוגרים כדי מפגש 50% בתקשורת צמיחה המכילה FITC-dextran </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר dextran להיות endocytosed עבור שעה 2 (או יותר בהתאם לצורך תיוג מספיק endosomal עם dextran ידי שורת התאים של עניין) בחממת CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים עם תקשורת צמיחת prewarmed דגירה בזה במשך שעה 2 בחממה CO 2 כדי לאפשר לכלendocytosed dextran להצטבר בליזוזום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההדמיה, יש לשטוף את coverslip בCIM prewarmed ולעלות בבעל coverslip על החממה העליונה שלב ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע widefield (לתנועה ברחבי התא) או TIRF (תנועה על פני התא וexocytosis) הדמיה - תאים שאין להם צפופים dextran FITC lysosomes שכותרתו הם אידיאליים עבור ההדמיה התנועה וexocytosis של lysosomes הבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישור לייזרי TIRF למיקרוסקופ הדמיה: השימוש 60x או אובייקטיבי 100X עם&gt; 1.45 NA. להגדיר את הזווית לאירוע קרן לייזר TIRF שימוש בגישה של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפצוע את קרום התא על ידי הקרנת אזור קטן (1-2 מ&quot;מ 2) ל&lt; 100 אלפית שניים, עם לייזר הפעם בהנחתת 40-50%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על התגובה של הליזוזום לתא פציעה, תאי תמונה ב4-6 מסגרות / השני לפחות 2 דקות או יותר בהתאם לדינמיקה של exocytosis בתאים של עניין. </li></ol>

<ol>
	<li>Bi, G. Q., Alderton, J. M., Steinhardt, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-regulated+exocytosis+is+required+for+cell+membrane+resealing.">Calcium-regulated exocytosis is required for cell membrane resealing.</a> Cell Biol. 131, 1747-1758 (1995).</li><li>Togo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+the+plasma+membrane+stimulates+rearrangement+of+microtubules+and+lipid+traffic+toward+the+wound+site.">Disruption of the plasma membrane stimulates rearrangement of microtubules and lipid traffic toward the wound site.</a> Cell Sci. 119, 2780-2786 (2006).</li><li>Miyake, K., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+accumulation+and+exocytosis+at+sites+of+plasma+membrane+disruption.">Vesicle accumulation and exocytosis at sites of plasma membrane disruption.</a> Cell Biol. 131, 1737-1745 (1995).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca2+-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca2+-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106, 157-169 (2001).</li><li>Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbing+confers+resistance+against+cell+lysis.">Blebbing confers resistance against cell lysis.</a> Death Differ. 18, 80-89 .</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423, 168-172 (2003).</li><li>Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+repair+in+Drosophila+occurs+through+three+distinct+phases+of+membrane+and+cytoskeletal+remodeling.">Cell wound repair in Drosophila occurs through three distinct phases of membrane and cytoskeletal remodeling.</a> Cell Biol. 193, 455-464 (2011).</li><li>Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptotagmin+VII+restricts+fusion+pore+expansion+during+lysosomal+exocytosis.">Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis.</a> PLoS Biol. 2, 1224-1232 (2004).</li><li>McNeil, P. L., Clarke, M. F., Miyake, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wound+assays.">Cell wound assays.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 12, (2001).</li><li>McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+introduction+of+molecules+into+cells.">Direct introduction of molecules into cells.</a> Protoc. Cell Biol. Chapter 20, (2001).</li><li>Knight, M. M., Roberts, S. R., Lee, D. A., Bader, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+using+confocal+microscopy+induces+intracellular+calcium+transients+and+cell+death.">Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death.</a> J. Physiol. Cell Physiol. 284, C1083-C1089 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4592-4597 (2003).</li><li>Benink, H. A., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentric+zones+of+active+RhoA+and+Cdc42+around+single+cell+wounds.">Concentric zones of active RhoA and Cdc42 around single cell wounds.</a> Cell Biol. 168, 429-439 (2005).</li><li>Schmoranzer, J., Goulian, M., Axelrod, D., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+constitutive+exocytosis+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Imaging constitutive exocytosis with total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Cell Biol. 149, 23-32 (2000).</li><li>Steyer, J. A., Horstmann, H., Transport Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=docking+and+exocytosis+of+single+secretory+granules+in+live+chromaffin+cells.">docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells.</a> 388, 474-478 (1997).</li><li>Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proximal+lysosomes+are+the+major+vesicles+responsible+for+calcium-dependent+exocytosis+in+nonsecretory+cells.">Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells.</a> Cell Biol. 159, 625-635 (2002).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.12.">Ch. 4.12.</a> Current Protocols in Cell Biology. , 4.12.1-4.12.15 (2003).</li><li>Johnson, D. S., Jaiswal, J. K., Simon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+illuminator+for+improved+imaging+of+cell+surface+events.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy illuminator for improved imaging of cell surface events.</a> Protoc. Cytom. Chapter 12, (2012).</li><li>Jaiswal, J. K., Simon, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+single+events+at+the+cell+membrane.">Imaging single events at the cell membrane.</a> Chem. Biol. 3, 92-98 (2007).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

פציעת קרום תא in vivo מתרחשת עקב מגוון של גורמי לחץ פיסיולוגיים וכמה גישות ניסיוניות פותחו לחקות אלה. אלה כוללים פצעו קרום תא של תאים חסיד על ידי גירוד אותם מהצלחת או על ידי passaging דרך 9,10 מזרק שעמם צר. בעקבות פציעות כגון התאים לרפא בהשעיה ולא פעל בהתאם למטריצה ​​תאית כפי שהם עושים בדרך כלל ברקמות. כגון שימוש ברעלים נקבוביות ויוצר, ואילו אחרים כימיים לשנות קרום תא על ידי שומני חילוץ כגון כולסטרול, ולכן לא מחקה בפגיעות מכאניות vivo 5. לפיכך, שיטה המשמשת לפגיעה בתא יכולה להשפיע על מה שניתן ללמוד על התגובה לתיקון. זה מחייב נזהר שלא רק בבחירה של assay פגיעה בתא, אלא גם בחירת גישות שיותר טובים לחקות את הפגיעות מכאניות in vivo. גישות אלה כוללות פגיעת שריטה (שבי monolayer של תאים נפגעועל ידי פגיעה באזמל או מחט) וחרוזי זכוכית (שבו ניזק נגרם על ידי חרוזי זכוכית התהפכות תאים דבקים). גישות אלו מתאימות גם לפציעתם של תאים בהמוניהם, אבל הם לא ניתנים להדמיה בזמן אמת של תהליך תיקון קרום תא. שימוש בmicroneedles ולייזרים פעמו ליצור פציעות מקומיות ומבוקרות היטב בנקודת הפגיעה לחקות את הפגיעה מכאנית וטראומטית in vivo ונוחות להדמיה בזמן אמת של תגובת התיקון, אבל מציעה תובנה התיקון של תא אחד בכל פעם. ראוי לציין כי גישת פציעת לייזר פעם שונה מהשימוש בקרינה ממושכת של קרום תא עם לייזרי nonpulsed בי פציעת הממברנה נגרמת על ידי חימום מקומי, אשר ידוע לגרום השפעות nonphysiological כגון נזק photoxidative וphotothermal קרום שומנים ורכיבי cytosolic 11. הפרוטוקולים המתוארים כאן מאפשרים לרתום את הפוטנציאל של אחד of בהמוניהם גישת פציעה, אשר מסתמכת על השימוש בחרוזי זכוכית ואחד גישת פציעה המקומית (לייזר פעמו) לניטור היכולת, קינטיקה וסחר subcellular המעורב בתיקון של קרום תא בעקבות פציעת גודל מיקרומטר. גישות אלו הן הדדית חינם - פגיעה בתפזורת מאפשרת שימוש באוכלוסייה של תאים לזהות גירעון ביכולת התיקון וסחר subcellular הקשורים אליו. כך שהיא מאפשרת הדמיה בזמן אמת של תיקון בתאים בודדים, גישת פציעת לייזר מאפשרת זיהוי מה שלב של תיקון קרום תא ומה subcellular אירועים הקשורים לגירעון בתיקון. גישה זו כבר בשימוש לניטור תיקון קרום תא באורגניזמים יונקים וחסרי חוליות 7,12,13. בהתבסס על הצרכים של הניסוי באחת משתי גישות אלה יכולים להיות בשימוש על ידי עצמו. עם זאת, כאשר האופי של תיקון גירעון אינו ידוע או מנגנון subcellular מעורב בtהתהליך שלו לא ידוע, באמצעות שילוב של גישות אלה הוא שימושי. בשל השונות הגלומות במספר התאים נפצעו בין הדגימות בנקודת סיום מבוססות מבחני פגיעה בתא יש צורך לזהות באופן עצמאי את כל התאים שנפגעו, שהצליח לתקן ואלו שלא הצליחו לתקן. גישת פציעת חרוז הזכוכית שתארנו כאן מאפשרת זיהוי תאים אלה. בעת ביצוע חרוז הזכוכית ופצע אותו חשוב כי בעת ביצוע מאמץ על מנת למקסם את מספר התאים נפצע הפציעות עצמם הם קלים כל כך תאים לא מקבלים כניסות מרובות. זה חשוב מאז פציעה החוזרת ונשנית תגרום לתאים (באופן סלקטיבי אותם כי הם עניים בתיקון) למות ולהתנתק מcoverslip במהלך ההליך. זה היה התוצאה של הערכה נמוכה מדי של תאים שלא הצליחו לתקן. כמו כן, חשוב להימנע מכל גלגול של חרוזי הזכוכית במהלך טיפול ושטיפת coverslips כדי למנוע כל פגיעה חדשה היגרום לכתמים אדומים (תאים חיוביים כוזבים). גישה זו לפגיעה גם מאפשרת ניטור אוכלוסייה של תאים לטרנסלוקציה של חלבון של עניין תא שטח, כפי שהודגם כאן לקבלת חלבון קרום הליזוזום קשור 1 (LAMP1). כאשר הניטור רק חלבונים מקומיים תא שטח על ידי immunofluorescence דרישת מפתח היא להשתמש בנוגדנים שקושרים תחום תאי של החלבון בתאי ריבית וimmunolabel לפני הקיבעון. זה מאפשר השוואה של רמת LAMP1 בקרום התא בתאים נפצעו עם תאים ללא כל פגע, או בין אוכלוסיות השונות של תאים. בעוד פרוטוקול זה כבר מאויר באמצעות LAMP1, זה יכול להיות מיושם על כל חלבון אחר לבחירה שבגינו קיימים נוגדנים ספציפיים לתחום תאי של החלבון. כאשר exocytosis lysosomal פציעה מופעלת צריך להיות בהשוואה בין שתי שורות תאים שלא הוקמו יש שיעור דומה בסיסי (לא מופעל על ידי פציעה) של exocytosis lysosomal, מכתים LAMP1 פני תא בתאים ללא כל פגע צריך גם להימדד. לכך נוסף מדגם מטופל בדיוק כמו C2 מדגם פרט לכך בשלב 9 יש מודגרות התאים עם הנוגדן הראשוני. זה יספק מידה של השיעור הבסיסי של exocytosis lysosomal. לפרוטוקול פציעת לייזר קרום התא נפגע על ידי לייזר בעוצמה גבוהה יחיד פוטון NSEC פעם. פצע מתבצע בנוכחות של צבע impermeant תא הקרינה שעולה על endomembrane המחייב (למשל 1-43 FM). כך בעקבות הקרינה הצבע קשורה התא מספק מדד לזמן שנדרש על ידי התא לרפא 3. פגיעת לייזר גורמת לצבע FM להיכנס לתא ולהיקשר endomembranes, וכתוצאה מכך העלייה בקרינת צבע FM. תיקון של קרום התא הפגום מעכב כניסה לצבוע יותר לתוך התא. לפיכך, לתא שתיקונים, הקרינה של הצבע מגיעה לרמה, ואילו לתא שלא מצליחה לתקן צבעהקרינה מגבירה ללא הרף. הדמיה תא חי של אירועי subcellular בודדים המעורבים בתיקון קרום תא דורשת ניטור קרום התא בגבוה יחס אות לרעש. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות פנימית סה&quot;כ (TIRF) הוא גישה מתאימה גם לאירועי שטח פני תא הדמיה באות גבוהה ל14-16 יחס רעש. ישנן מספר מערכות TIRF הזמינות מסחרי וכל המערכות הללו תואמים הדמיה תא חי יכול לשמש. בנוסף, יש לנו תיארתי גישות להגדרת מיקרוסקופים TIRF תוצרת בית במקומות אחרים 17,18. מבקר של התקנת TIRF יש צורך להקים גישות המאפשרות ניטור גורלות שונים של שלפוחית ​​subcellular לפני ואחרי פציעה. במקומות אחרים שאנו מספקים לדון בגישות באופן שתאפשרנה לטבע ניטור, משך זמן, ותואר של היתוך של כל 19 הליזוזום. כדי לפקח על פגיעה מופעל exocytosis של FITC-dextran שכותרת lysosomes תואר בפרוטוקול 4 תכונת המפתח להתבונן הם ההבזקים. הבזק כרוך בשחרורו של dextran FITC הכלול בליזוזום הבודד בשלב אחד וכתוצאה מכך התפשט לרוחב של הקרינה. למרות שכל פלאש בדרך כלל מצביע על היתוך exocytic של הליזוזום אחת, חשוב לבסס זאת על ידי ניטור כמה lysosomes רבים נמצאים באתר ההיתוך לפני ואחרי הבזק.

קרום תא שומר על שלמותם של תאים על ידי מתן חיץ בין התא לבין סביבת החוץ תאית. גירוי כימי, חשמלי או מכאני שעולה על הסף הפיזיולוגי הנורמלי, כמו גם נוכחותם של פולשים גורמי מחלה יכול כל תוצאה בפגיעה בקרום התא ולגרום לתגובה תאית לאחר לתקן פגיעה זו. כדי לשרוד פציעות אלה לממברנת התא, תאים בעלי מנגנון יעיל לתיקון. מנגנון זה הוא סידן תלוי וכרוך בסחר תאית של חלבונים כגון annexins וMG53 בין יתר, כמו גם תאי subcellular כגון endosomes, lysosomes, שלפוחית ​​Golgi נגזרת ומיטוכונדריה לקרום התא נפגע 1-7. עם זאת, את פרטיו של הרצף של אירועים מולקולריים וsubcellular המעורבים בתיקון קרום תא פגוע נשאר הבינו היטב. התגובה לתיקון של התא יכולה להיות מופרדת לתוך אוזןly ותגובות מאוחרות. תגובות הראשונות, אשר מתרחשות תוך שניות לזמן בקנה מידה דקות, הן חשובות מאוד בקביעת מהותן של תגובות מאוחרות שהובילו לתיקון תאים מוצלח או מוות של תאים. מבחני נקודת סיום מבוססים על אנליזה ביוכימית והתאית בתפזורת סייעו להקים את מעורבותם של תהליכים מולקולריים ותאיים בתיקון. אבל, בשל ההטרוגניות והמהירות של תגובת תיקון הסלולרי, מבחני נקודת סיום אינם מספקים פרטים הקינטית ומרחבים של הרצף של אירועים שהובילו לתיקון. גישות המאפשרות לפציעה מבוקרת של קרום תא ומאפשרים ניטור ותיקון קרום תא ותגובות subcellular קשורים במרחב ובזמן ברזולוציה גבוהה מתאימות בצורה אידיאלית ללימודים כאלה. הנה, גישות כאלה כבר הוצגו. שניים מפרוטוקולי תיאור גישות לפקח קינטיקה בזמן אמת של תיקון קרום תא ותגובות subcellular הקשורים בתהליך התיקון בתאים חיים הבאות inj הלייזרלסר אורי. כהשלמה למבחנים מבוססי הדמיה תא החי אלה, מבחני נקודת סיום יש גם תוארו המספקים מדד המבוסס אוכלוסייה לתיקון ניטור של תאים בודדים ותגובות subcellular הקשורות. כדי להדגים השירות שלהם גישות אלה היו בשימוש כדי לפקח על סחר וexocytosis של lysosomes בתגובה לפציעת קרום תא.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="814" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H1387</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP410</td>
			<td>Used to prepare CIM (HBSS/10 mM Hepes/2 mM Ca2+ pH 7.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1820</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRITC dextran (Lysine fixable)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1818</td>
			<td>2 mg/ml in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA 16%</td>
			<td>EMS</td>
			<td>15710</td>
			<td>4% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>1/10 000 in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FM dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T3163</td>
			<td>1 &#181;g/&#181;l in CIM or PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC dextran</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>FD40S</td>
			<td>2 mg/ml in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAMP1&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-19992</td>
			<td>1/300 in growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 chicken anti-rat IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21470</td>
			<td>1/500 in blocking solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting media</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12-545-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom petridish</td>
			<td>MatTek corporation</td>
			<td>P35G-1.0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone O ring</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-33315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip holder</td>
			<td>Bellco</td>
			<td>1943-11111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MP1400-500H</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Sreptomycin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-350</td>
			<td>Used for growth medium: 10% FBS, 1% P/S in DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5405</td>
			<td>5% chicken serum in CIM is used for blocking solution during immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Ca2+ and Mg2+ free)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12001-664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TIRF illuminator&#160;</td>
			<td>Olympus America, PA</td>
			<td>Cell^TIRF (IEC60825-1:2007)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence illuminator</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato CA</td>
			<td>Lambda DG-4 (DG-4 30)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td>Evolve 512 EMCCD&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image acquisition and anaysis software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Slidebook 5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed laser</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Inc. Denver, CO</td>
			<td>Ablate (3iL13)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage top incubator</td>
			<td>Tokaihit, Japan</td>
			<td>INUBG2ASFP-ZILCS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cell membrane injury and subcellular processes involved in repair

היכולת של תאים נפצעו לרפא היא תהליך תאי בסיסי, אך מנגנונים תאיים ומולקולריים המעורבים בתאי ריפוי פצוע הם הבינו היטב. הנה מבחני מתוארים כדי לפקח על היכולת וקינטיקה של ריפוי של תאים בתרבית בעקבות פציעה מקומית. הפרוטוקול הראשון מתאר גישה מבוססת נקודת סיום כדי להעריך את יכולת תיקון קרום תא של מאות תאים בו זמנית. הפרוטוקול השני מתאר גישת הדמיה בזמן אמת כדי לפקח על קינטיקה של תיקון קרום תא בתאים בודדים בעקבות פציעה מקומית עם לייזר פעם. ככל שתאי ריפוי נפצע כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעה, הפרוטוקול השלישי מתאר את השימוש בגישה מבוססת נקודת סיום לעיל כדי להעריך אירוע אחד כזה סחר (exocytosis lysosomal) במאות תאים נפצעו בו זמנית והפרוטוקול האחרון מתאר את השימוש של פגיעת לייזר פעם יחד עם מיקרו TIRFעותק כדי לפקח על הדינמיקה של תאי subcellular בודדים בתאים שנפגעו ברזולוציה מרחבית ובזמן גבוה. בעוד הפרוטוקולים כאן מתארים את השימוש בגישות אלה כדי לחקור את הקשר בין תיקון קרום התא וexocytosis lysosomal בתאי שריר בתרבית, הם יכולים להיות מיושמים כאמורים לכל תא אחר חסיד תרבותי ותא subcellular של בחירה.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair at JoVE.com

Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה.

תא ההדמיה ממברנה פגיעה ותהליכי subcellular המעורבים בתיקון

The ability of injured cells to heal is a fundamental cellular process, but cellular and molecular mechanisms involved in healing injured cells are poorly ...

imaging-cell-membrane-injury-subcellular-processes-involved

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

15.0K Views.  Children's National Medical Center.  התהליך של ריפוי תאים נפצעו כרוך בסחר של חלבונים מסוימים ותאי subcellular לאתר של פציעת קרום תא. פרוטוקול זה מתאר מבחני כדי לפקח על תהליכים אלה. 

Video: Imaging Cell Membrane Injury and Subcellular Processes Involved in Repair

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution of existing proteins, and the assembly of new protein complexes can be stimulated by a variety of DNA lesions and mismatched DNA base pairs. Fluorescence microscopy has been used as a powerful experimental tool for visualizing and quantifying these and other responses to DNA lesions and to monitor DNA replication status within the complex subcellular architecture of a living cell. Translational fusions between fluorescent reporter proteins and components of the DNA replication and repair machinery have been used to determine the cues that target DNA repair proteins to their cognate lesions in vivo and to understand how these proteins are organized within bacterial cells. In addition, transcriptional and translational fusions linked to DNA damage inducible promoters have revealed which cells within a population have activated genotoxic stress responses. In this review, we provide a detailed protocol for using fluorescence microscopy to image the assembly of DNA repair and DNA replication complexes in single bacterial cells. In particular, this work focuses on imaging mismatch repair proteins, homologous recombination, DNA replication and an SOS-inducible protein in Bacillus subtilis. All of the procedures described here are easily amenable for imaging protein complexes in a variety of bacterial species.

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

A detailed protocol is described for imaging the real time formation of DNA repair complexes in Bacillus subtilis cells.

הדמיה תיקון Mismatch ותגובות נייד נזק לדנ&quot;א Bacillus subtilis</em

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many degenerative human diseases. The recent discovery of MG53 as a key component of the membrane resealing machinery allows for a better molecular understanding of the basic biology of tissue repair, as well as for potential translational applications in regenerative medicine. Here we detail the experimental protocols for exploring the in vivo function of MG53 in repair of muscle injury using treadmill exercise protocols on mouse models, for testing the ex vivo membrane repair capacity by measuring dye entry into isolated muscle fibers, and for monitoring the dynamic process of MG53-mediated vesicle trafficking and cell membrane repair in cultured cells using live cell confocal microscopy.

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Described here are protocols used to visualize the dynamic process of MG53-mediated cell membrane repair in whole animals and at the cellular level. These methods can be applied to investigate the cell biology of plasma membrane resealing and regenerative medicine.

ויזואליזציה של תיקון MG53 בתיווך קרום התא באמצעות In vivo ו במבחנה מערכות

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event that triggers the repair of mechanical wounds on the plasma membrane within ~30 sec. Recent studies revealed that mammalian cells also reseal their plasma membrane after permeabilization with pore forming toxins in a Ca2+-dependent process that involves exocytosis of the lysosomal enzyme acid sphingomyelinase followed by pore endocytosis. Here, we describe the methodology used to demonstrate that the resealing of cells permeabilized by the toxin streptolysin O is also rapid and dependent on Ca2+ influx. The assay design allows synchronization of the injury event and a precise kinetic measurement of the ability of cells to restore plasma membrane integrity by imaging and quantifying the extent by which the liphophilic dye FM1-43 reaches intracellular membranes. This live assay also allows a sensitive assessment of the ability of exogenously added soluble factors such as sphingomyelinase to inhibit FM1-43 influx, reflecting the ability of cells to repair their plasma membrane. This assay allowed us to show for the first time that sphingomyelinase acts downstream of Ca2+-dependent exocytosis, since extracellular addition of the enzyme promotes resealing of cells permeabilized in the absence of Ca2+.

Live Imaging Assay for Assessing the Roles of Ca2+ and Sphingomyelinase in the Repair of Pore-forming Toxin Wounds

Live imaging of cells exposed to the lipophilic dye FM1-43 allows precise determination of the kinetics by which pore-forming toxins are removed from the plasma membrane. This is a sensitive assay that can be used to assess requirements for Ca2+, sphingomyelinase and other factors on plasma membrane repair.

לחיות ההדמיה Assay להערכת התפקידים של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; וSphingomyelinase בתיקון פצעי רעלן נקבובית יוצרי

Plasma membrane injury is a frequent event, and wounds have to be rapidly repaired to ensure cellular survival. Influx of Ca2+ is a key signaling event ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

הדמיה סופר-ברזולוציה המחסור בקרקע בתאים בתרבית

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

יישום של ממברנה וקיר תא צבעי פלורסנט סלקטיבית עבור הדמיה בשידור חי התא של פטריות Filamentous

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

הדמיית תאים חיים ברזולוציה סופר-רזולוציה של מבנים תת-תאיים

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light represents a revolutionary advance for studies of the neural basis of behavior. However, a downside of this development is its tendency to focus investigators on a very small number of &#8220;designer&#8221; organisms (e.g., C. elegans and Drosophila), potentially negatively impacting the pursuit of comparative studies across many species, which is needed for identifying general principles of network function. The present article illustrates how optical recording with voltage-sensitive dyes in the brains of non-transgenic gastropod species can be used to rapidly (i.e., within the time course of single experiments) reveal features of the functional organization of their neural networks with single-cell resolution. We outline in detail the dissection, staining, and recording methods used by our laboratory to obtain action potential traces from dozens to ~150 neurons during behaviorally relevant motor programs in the CNS of multiple gastropod species, including one new to neuroscience &#8211; the nudibranch Berghia stephanieae. Imaging is performed with absorbance voltage-sensitive dyes and a 464-element photodiode array that samples at 1,600 frames/second, fast enough to capture all action potentials generated by the recorded neurons. Multiple several-minute recordings can be obtained per preparation with little to no signal bleaching or phototoxicity. The raw optical data collected through the methods described can subsequently be analyzed through a variety of illustrated methods. Our optical recording approach can be readily used to probe network activity in a variety of non-transgenic species, making it well suited for comparative studies of how brains generate behavior.

This protocol presents a method for imaging neuronal population activity with single-cell resolution in non-transgenic invertebrate species using absorbance voltage-sensitive dyes and a photodiode array. This approach enables a rapid workflow, wherein imaging and analysis can be pursued over the course of a single day.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Isolating and Imaging Live, Intact Pacemaker Regions of Mouse Renal Pelvis by Vibratome Sectioning

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, propulsive contractions. Regular RP contractions rely on pacemaker activity, which originates from the most proximal region of the RP at the pelvis-kidney junction (PKJ). Due to the difficulty in accessing and preserving intact preparations of the PKJ, most investigations on RP pacemaking have focused on single-cell electrophysiology and Ca2+ imaging experiments. Although important revelations on RP pacemaking have emerged from such work, these experiments have several intrinsic limitations, including the inability to accurately determine cellular identity in mixed suspensions and the lack of in situ imaging of RP pacemaker activity. These factors have resulted in a limited understanding of the mechanisms that underlie normal rhythmic RP contractions. In this paper, a protocol is described to prepare intact segments of mouse PKJ using a vibratome sectioning technique. By combining this approach with mice expressing cell-specific reporters and genetically encoded Ca2+ indicators, investigators may be able to more accurately study the specific cell types and mechanisms responsible for peristaltic RP contractions that are vital for normal urine transport.

The goal of this protocol is to isolate intact pacemaker regions of the mouse renal pelvis using vibratome sectioning. These sections can then be used for in situ Ca2+ imaging to elucidate Ca2+ transient properties of pacemaker cells and other interstitial cells in vibratome slices.

בידוד והדמיה חיה, אזורי קוצב לב שלמים של אגן כליות העכבר על ידי חלוקת ויברטום

The renal pelvis (RP) is a funnel-shaped, smooth muscle structure that facilitates normal urine transport from the kidney to the ureter by regular, ...

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the zebrafish cardiovascular tissues have been limiting in studying their electrophysiological properties. Previous methods have been described for dissection of zebrafish hearts and isolation of ventricular cardiac myocytes. However, the isolation of zebrafish atrial and vascular myocytes for electrophysiological characterization was not detailed. This work describes new and modified enzymatic protocols that routinely provide isolated juvenile and adult zebrafish ventricular and atrial cardiomyocytes, as well as vascular smooth muscle (VSM) cells from the bulbous arteriosus, suitable for patch-clamp experiments. There has been no literary evidence of electrophysiological studies on zebrafish cardiovascular tissues isolated at embryonic and larval stages of development. Partial dissociation techniques that allow patch-clamp experiments on individual cells from larval and embryonic hearts are demonstrated.

The present protocol describes the acute isolation of viable cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval, and embryonic zebrafish (Danio rerio), suitable for electrophysiological studies.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...