ג&#39;וזף וו Ndieyira נתמכה על ידי הנדסת מדעים הפיזיקליים מועצה למחקר (EPRSC), מרכז למחקר רב תחומי בננוטכנולוגיה (IRC), חברה המלכותית (RS) וייעוץ ביאנו (BNC). אנו מודים, אלחנדרה Donoso Barrera, Dejian ג&#39;ואו, מנואל Vögtli, מתיו באצ&#39;לור, מתיו א קופר, טורסטן Strunz, טרבור Rayment וגבריאל Aeppli לדיונים מועילים.

1. הכנת cantilevers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפלון פינצטה לטבול מספר הנבחר של שבבי שלוחה (כל שלוחה מדידה 500 מיקרומטר הארוך, 100 מיקרומטר רחב ו0.9 מיקרומטר עבה) לפתרון Piranha טרי (ב 1:1 H 2 SO 4 ו-H 2 O 2) במשך 20 דקות . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כ 20 דקות להסיר את שבבי שלוחה מפתרון Piranha ולשטוף אותם ביסודיות עם מים deionized ולהעביר באופן מיידי לפתרון Piranha מוכן טרי. חזור על שלב 1.1 לעיל, אם את השבבים מכילים כתמי לכלוך אחר, המשיכו לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ניקוי יסודי במי deionized, לשטוף עם אתנול טהור ולייבש את שבבי שלוחה על פלטה חמה על 75 ° C כדי להסיר כל עקבות של מים. לבדוק אותם באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר הניקיון שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את שבבי שלוחה ניקו לתא אידוי ולשאוב למטה, כדי להשיג מיקוד ואקוםלחץ של 10 -7 mbar. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שלחץ הוואקום הנדרש יושג, צד אחד מעיל של כל מערך שלוחה עם טיטניום 2 ננומטר ראשון שפועל כשכבת הדבקה לפני שכבה נוספת של 20 ננומטר זהב עבה. כדי לאשר את העובי שלהם, להשתמש בצג גביש קוורץ ממוקם ישירות מעל למקור היעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר שבבי חיישן שלוחה מצופים זהב בתא עבור 1-2 שעות להתקרר תחת ואקום לפני הפתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את השבבים טריים התאדו לכלי אחסון ואקום מלאים בארגון, כדי למנוע כל סוג של זיהומים. </li></ol> 2. Functionalization צ&#39;יפ שלוחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , ראשית לארגן צינורות מייקר הנימים על במה functionalization 2 בהתאם לגודל המגרש שלוחה של 250 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן 2 מ&quot;מ פתרונות האתנולית תיאול של מולקולות מטרת משטח, mucopeptides חיידקי IE (D-עלא ו-D-Lac) להזריק, וINER &#39;alkanethiol &#39;לא מסתיים בגליקול triethylene (PEG) ידועה להתנגד biomolecular ספיחה. 16 כל אחד מtubings הנימים צריך להכיל מולקולות ללכוד שטח שונים שנקבעו באופן אקראי, כדי למנוע הטיה משתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הבאה במשך 20 דקות את cantilevers בmicrocapillaries מלאה בפתרונות המכילים מולקולות תיאול לכידת פני שטח. להבטיח כי פתרונות של המולקולות ללכוד משטח מוגבלים על כל חיישן שלוחה אדם, כדי למנוע או למזער זיהומים צולבים. אם תהליך זה הוא מועסק בצורה נכונה, הוא צריך לשנות את אופן שיטתי cantilevers מצופה הזהב שהוכן זה עתה לחיישנים כימיים פעילים שהוקמו על ידי המאפשר לטילים נ&quot;מ של מטרות mucopeptide חיידקים להיווצר על משטחי זהב מצופים כמו קולטנים. </li></ol> 3. הכנות פתרון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.1 מלחי פוספט נתרן מונו ודי בסיסיים-M במי ultrapure (18.2 MΩ · ס&quot;מ התנגדות) ולא לערבבo להניב ערך ה-pH של 7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.002% מPS80 לפתרונות שנאגרו כדי למזער את ההשפעות שנגרמו על ידי צבירת אינטראקציות ספציפיות של מולקולות תרופה לכלי הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל תרופות עם פתרונות טריים שנאגרו לריכוזים השונים הרצויים שיאפשר חישוב של K ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את פתרונות סמים המוכנים טרי באמצעות מסנני 0.2 מיקרומטר וsonicate במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר לפני הקאה עם ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור על התהליך עם תרופה בסרום שנאגרו באמצעות כל סרום. מערבולת בעדינות במשך 15 דקות עם 5 דקות נוספות על מנת להבטיח מסיסות מלאה. </li></ol> 4. איתור מתח פני השטח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען שבב חיישן שלוחה פונקציונליות לתוך תא תא זרימת נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את נקודת לייזר על גבי קצה החופשי של כל חיישן ולאשר את היישור על ידי חימום חדר הנוזל ל1 ° C. כל שמונה מערכי חיישן שלוחה המצופים הזהב צריכים לעבור compressive כלפי מטה כיפוף בגלל השפעת bimetallic נגרמת על ידי ההבדלים בשיעורי התרחבות של סיליקון וזהב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חימום לכ -10 דקות, לאפשר לcantilevers להתקרר במשך 10 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הווריאציה כיפוף באותות כיפוף המקסימאליים בין חיישני שלוחה בודדים ואם סטיית התקן היחסית של אותות כיפוף היא ≤ 5% לאחר מכן לקבל את היישור כרצוי אחרת לחזור על התהליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, למדוד את תדרי התהודה של כל שמונה cantilevers לחשב קבועי האביב שלהם. אם הווריאציה של המעיין המתמיד בין כל חיישן שלוחה בתוך שבב היא ≤ 1% אז יקבלו את השבב כבעל תכונות מכאניות עקביות אחרת להחליף את חיישן שבב שלוחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, להשתמש במערכת fluidic (דגם Genie פלוס) דרך שסתום שש דרך להשיג תמורת הנוזל בתוך תא הזרימה בזמן צריכה להיות מושגת באמצעות רכישת נתונים LabVIEW אוטומטי כךftware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לפקח על שלוחה כיפוף נתונים, להשתמש בפרוטוקולי המדידה הבאים: I) להזריק או פתרון חיץ או בסרום ללא תרופה למדידת טווח לשליטת 5-30 דקות להקים בסיס; II) להזריק פתרון תרופה במשך 30-60 דקות, III) להזריק 10 מ&quot;מ HCl לשטוף עבור 10-60 דקות כדי לנתק מורכב תרופה חייבת; IV) סוף סוף להזריק צעד שטיפה נוסף באמצעות פתרון חיץ לדקות 5-30 אחרת להתחדש פפטידים על פני השטח ולשחזר את אות קו הבסיס. תמיד להבטיח כי כל אותותיו נרכשים תחת קצב זרימת נוזל מתמיד של 30-180 μl / דקות ובטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס בקבינט בטמפרטורה מבוקרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את אותות כיפוף המוחלטים של כל שמונה cantilevers צריכים להיות במעקב באמצעות זמן סדרת multiplexed שיטת אלומה אופטית עם גלאי רגיש עמדה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את אותות כיפוף מכל ריכוז של תרופה, את כפיפות דיפרנציאלי כתוצאה מכך הם הפכו לstres דיפרנציאליותים בין הצדדים העליונים והתחתונים של שלוחה באמצעות המשוואה של Stoney. </li></ol>

<ol>
	<li>Ndieyira, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanical+detection+of+antibiotic-mucopeptide+binding+in+a+model+for+superbug+drug+resistance.">Nanomechanical detection of antibiotic-mucopeptide binding in a model for superbug drug resistance.</a> Nat. Nanotech. 3, 691-696 (2008).</li><li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+label-free+nanomechanical+detection+of+biomarker+transcripts+in+human+RNA.">Rapid and label-free nanomechanical detection of biomarker transcripts in human RNA.</a> Nat. Nanotech. 1, 214-220 (2006).</li><li>McKendry, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+label-free+biodetection+and+quantitative+DNA-binding+assays+on+a+nanomechanical+cantilever+array.">Multiple label-free biodetection and quantitative DNA-binding assays on a nanomechanical cantilever array.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 9783-9788 (2002).</li><li>Wu, G., Datar, R. H., Hansen, K. M., Thundat, T., Cote, R. J., Majumdar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioassay+of+prostate-specific+antigen+(PSA)+using+microcantilevers.">Bioassay of prostate-specific antigen (PSA) using microcantilevers.</a> Nat. Biotech. 19, 856-860 (2001).</li><li>Fritz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+biomolecular+recognition+into+nanomechanics.">Translating biomolecular recognition into nanomechanics.</a> Science. 288, 316-318 (2000).</li><li>Dwyer, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-induced+bacterial+cell+death+exhibits+physiological+and+biochemical+hallmarks+of+apoptosis.">Antibiotic-induced bacterial cell death exhibits physiological and biochemical hallmarks of apoptosis.</a> Mol. Cell. 46, 561-572 (2012).</li><li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Wierzbowski, J., Cottarel, G., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mistranslation+of+membrane+proteins+and+two-component+system+activation+trigger+antibiotic-mediated+cell+death.">Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death.</a> Cell. 135, 679-690 (2008).</li><li>Kahne, D., Leimkuhler, C., Wei, L., Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycopeptide+and+lipoglycopeptide+antibiotics.">Glycopeptide and lipoglycopeptide antibiotics.</a> Chem. Revs. 105, 425-448 (2005).</li><li>Williams, D. H., Maguire, A. J., Tsuzuki, W., Westwell, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+analysis+of+the+origins+of+a+cooperative+binding+energy+of+dimerization.">An analysis of the origins of a cooperative binding energy of dimerization.</a> Science. 280, 711-714 (1998).</li><li>Bugg, T. D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular-basis+for+vancomycin+resistance+in+enterococcus+faecium+BM4147-+biosynthesis+of+a+depsipeptide+peptidoglycan+precursor+by+vancomycin+resistance+proteins+VanH+and+VanA.">Molecular-basis for vancomycin resistance in enterococcus faecium BM4147- biosynthesis of a depsipeptide peptidoglycan precursor by vancomycin resistance proteins VanH and VanA.</a> Biochem. 30, 10408-10415 (1991).</li><li>Neu, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crisis+in+antibiotic+resistance.">The crisis in antibiotic resistance.</a> Science. 257, 1064-1073 (1992).</li><li>Walsh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+that+confer+antibacterial+drug+resistance.">Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance.</a> Nature. 406, 775-781 (2000).</li><li>Xu, J., Li, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemistry+of+self-assembled+long-chain+alkanethiol+monolayers+on+gold.">The chemistry of self-assembled long-chain alkanethiol monolayers on gold.</a> J. Colloid Interface Sci. 176, 138-149 (1995).</li><li>Wink, T., van Zuilen, S. J., Bult, A., van Bennekom, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+monolayers+for+biosensors.">Self-assembled monolayers for biosensors.</a> Analyst. 122, 43-50 (1997).</li><li>Cho, Y. R., Entress, R. M., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+cell-wall+analogues+of+vancomycin-resistant+enterococci+using+solid+phase+peptide+synthesis.">Synthesis of cell-wall analogues of vancomycin-resistant enterococci using solid phase peptide synthesis.</a> Tetrahedron Lett. 38, 5229-5232 (1997).</li><li>Prime, K. L., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+organic+monolayers+-+model+systems+for+studying+adsorption+of+proteins+at+surfaces.">Self-assembled organic monolayers - model systems for studying adsorption of proteins at surfaces.</a> Science. 252, 1164-1167 (1991).</li><li>Rotschafer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+of+Vancomycin:+Observations+in+28+Patients+and+Dosage+Recommendations.">Pharmacokinetics of Vancomycin: Observations in 28 Patients and Dosage Recommendations.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 22, 391-394 (1982).</li><li>Cooper, M. A., Fiorini, M. T., Abell, C., Williams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+vancomycin+group+antibiotics+to+D-alanine+and+D-lactate+presenting+self-assembled+monolayers.">Binding of vancomycin group antibiotics to D-alanine and D-lactate presenting self-assembled monolayers.</a> Bioorg. Med. Chem. 8, 2609-2616 (2000).</li><li>Rao, J., Yan, L., Xu, B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+surface+plasmon+resonance+to+study+the+binding+of+vancomycin+and+its+dimer+to+self-assembled+monolayers+presenting+D-Ala-D-Ala.">Using surface plasmon resonance to study the binding of vancomycin and its dimer to self-assembled monolayers presenting D-Ala-D-Ala.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 2629-2630 (1999).</li><li>MacBeath, G., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Printing+Proteins+as+Microarrays+for+High-Throughput+Function+Determination.">Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination.</a> Science. 289, 1760-1763 (2000).</li><li>Baller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cantilever+array-based+artificial+nose.">A cantilever array-based artificial nose.</a> Ultramicroscopy. 82, 1-9 (2000).</li><li>Burg, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weighing+of+biomolecules,+single+cells+and+single+nanoparticles+in+fluid.">Weighing of biomolecules, single cells and single nanoparticles in fluid.</a> Nature. 446, 1066-1069 (2007).</li><li>Lahiri, J., Isaacs, L., Tien, J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strategy+for+the+generation+of+surfaces+presenting+ligands+for+studies+of+binding+based+on+an+active+ester+as+a+common+reactive+intermediate:+A+surface+plasmon+resonance+study.">A strategy for the generation of surfaces presenting ligands for studies of binding based on an active ester as a common reactive intermediate: A surface plasmon resonance study.</a> Anal. Chem. 71, 777-790 (1999).</li><li>Nugaeva, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromechanical+cantilever+array+sensors+for+selective+fungal+immobilization+and+fast+growth+detection.">Micromechanical cantilever array sensors for selective fungal immobilization and fast growth detection.</a> Biosens. Bioelectron. 21, 849-856 (2005).</li><li>Von Muhlen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomarker+sensing+in+undiluted+serum+with+suspended+microchannel+resonators.">Label-free biomarker sensing in undiluted serum with suspended microchannel resonators.</a> Anal. Chem. 82, 1905-1910 (2010).</li><li>Godin, M., M, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+buoyant+mass+to+measure+the+growth+of+single+cells.">Using buoyant mass to measure the growth of single cells.</a> Nat. Methods. 7, 387-390 (2010).</li><li>Mertens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gas+trace+of+hydrofluoric+acid+using+microcantilever.">Detection of gas trace of hydrofluoric acid using microcantilever.</a> Sens. Actuators B Chem. 99, 58-65 (2004).</li><li>Porter, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+solidstate+sensor+platform+for+the+detection+of+hydrogen+cyanide+gas.">A solidstate sensor platform for the detection of hydrogen cyanide gas.</a> Sens. Actuator B Chem. 123, 313-317 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים מוצהר

הפרדיגמה נתחים המולקולריים ההכרה ניצבת בבסיס גדול של ביולוגיה ורפואה. בפרמקולוגיה, למשל המטרה היא להפריע למסלול פתולוגית על ידי מיקוד משתתף מרכזי בתהליך ביוכימי כגון transglycoslyation או transpeptidation שמזרז crosslinking של פפטידים קיר תא חיידק. תכנון התרופות מצטמצם ולכן להגדרת מולקולה מתאימה כדי למקד את אתר עגינה חיידקים ספציפי כדי לגרום להתאמה מושלמת. דוגמה קלאסי לחיקוי ההצלחה של גישה זו היא ונקומיצין (ואן), אשר מטרות דופן תא פפטידוגליקן, תכונה מבנית שימור של חיידק. בחיידק גראם חיובי המתהווה, מטריצת פפטידוגליקן מורכבת של פפטידים המסתיימים ברצף ליזין-D-אלנין-D-אלנין, קשורים באמצעות C55 8-10 מקשר שומנים כאן מכונה D-עלא. פפטידים אלו שנחשפו על מבשרי peptidoglycan הם יסוד להגנה מכאנית של התאים חיידקיים נגד כוחות סביבתיים קשים, וחשוב מכך, לא נמצא בתאים אנושיים, מה שהופך אותם למטרות אידיאליות לתרופות אנטיביוטיות. אן במיוחד נקשר לC-הסופית של פפטידים קיר תא החיידק יוצרים ואן-פפטיד חזק בינוני מורכב, כפי שמוצג באיור 1. אינטראקציה זו בין ואן ואת אבני פפטידים שנחשפו מעשיו של transpeptidases וtransglycosylases, אשר לזרז cross-linking של קירות תא 1, ביעילות לעצור אותם מcrosslinking ולכן nanomechanically מחליש את תא החיידק שהוביל למותה על ידי קרע 1,6, 7. הופעתה של vancomycin עמיד אנטרוקוקוס (VRE) היא בעיה בריאות 11 גוברת ובגלל עמידות החיידקים בEnterococci מתעוררת עקב השינוי העדין של לין אמיד<html> Kage להצמדת אסתר 8, שינוי מבני פשוט מטעה זה על פני השטח של החיידק מוחק קשר מימן אחד מאתר עגינה של ואן עם השינוי הבא של הכיס המחייב. חשוב לציין את התהליך הזה משנה את הווה אלאנין מסוף pentapeptide בונקומיצין רגיש אנטרוקוקוס (VSE) ליזין 10,12-D-אלנין-D-חומצת חלב, המכונה כאן D-Lac, מניב לירידה משמעותית בזיקה מחייבת ואן-D-Lac ידי שלושה סדרי הגודל ואן טיוח טיפולי יעילה נגד זיהומי Enterococcal 1, הצמיחה המדאיגה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה הוא נוהגים פיתוח גישות חדשניות אפוא להאיץ ולשחזר את הפעילות אנטיבקטריאלי של סוכנים אנטיבקטריאלי או גילוי של תרופות יותר חזקות נגד חיידקים עמידים multidrug זיהומים. = &quot;Jove_content&quot; כיתה&gt; הניסויים שלנו באמצעות cantilevers שעמד חופשי בהשראת המערכות כגון תאים אשר לרתום אנרגיה כימית לתנועה. היכולת של חיישני שלוחה לתרגם אנרגיה כימית לתנועה מכאנית גורמת להם בדיקות ייחודיות עם יתרונות רבים לניטור הפרעות מכאניות של מטרות קיר תא חיידק בזמן אמת. את חיישני שלוחה דורשים &#39;תגים&#39; לא כתב וביומולקולות מזוהות במהירות בתגובה בשלב יחידה. הם יכולים להקרין תרופות מרובות במקביל בסביבות פיסיולוגיות כגון פתרונות שנאגרו וכל סרום. בנוסף, הטכנולוגיה משתמשת בשלוחת התייחסות אתר למדידות דיפרנציאלי המאפשרים להם לזהות באופן ספציפי אינטראקציות סמים והיעד, מכוח הייצור שלהם באמצעות מסלולים מוליכים למחצה לעיבוד סטנדרטי, הם נוחים לייצור המוני ועמות להקרנת תפוקה גבוהה של אלפי של תרופות לשעה. בparticחיישן מערכים מרובים שלוחה ular הם כלים שימושיים לחקר עמידות לאנטיביוטיקה לונקומיצין - בגלל התנגדות לוונקומיצין היא בעיקרו בעיה מכאנית 1,6,7. התגובות שבין מודל יעד חיידקי דופן תא ואן בפתרון יכולות להיות מזוהות על ידי מעקב אחר השינויים במתח רלוונטי קליני הנגרמים מתגובות בין תרופתי מחייבות גבוהה מהיעד. המתח שנוצר משטח תגובות אשר באו לידי ביטוי באות כיפוף שלוחה מנותח על ידי חיישנים אופטי מאירים עם קרן לייזר. יתרה מזאת על ידי התאמת הציפוי פתוח של מולקולות מטרת משטח חיידקים על גבי חיישן שלוחה, קרוב למספר בלתי מוגבל של analytes (ואן), האינטראקציות ביוכימיות הספציפיות וביומכניקה של תא חיידק מודל קיר מטריצה ​​מנוטרת בזמן אמת. מלבד אירוע ההכרה המולקולרי, ישנם מספר גורמים שיכולים לגרום לחיישני שלוחה defבוחר בי, הכולל - וריאציות טמפרטורה, מחייב נוקבים או שינויים של מקדם שבירה של הפתרון. כדי להסביר את אותות ספציפיים, במדידות באתרו דיפרנציאלי מבוצעים בו הכיפוף של שניהם המדידה וcantilevers התייחסות מנוטרים באופן רציף כדי לנתח אינטראקציות ספציפיות. יתר על כן, ניתן לשפר את זיהוי של רגישויות חיישני שלוחה הנשען על פני השטח וגיאומטרית chemistries ידי כוונון צפיפות השטח עמ &#39;(עמ&#39; שבו מוגדר כיחס בין שטח הפנים שנכבש על ידי מולקולות לכידה לאזור המשטח העליון של כל שלוחה מכוסה על ידי האוכלוסייה של מולקולות, כפי שנקבע על ידי X-Ray Photoelectron ספקטרוסקופיה (XPS) 1. הנה פרטי פרוטוקול זה איך ונקומיצין או כל אנטיביוטיקה אחרת מחייב אנלוגים חיידקי דופן תא מבשר (mucopeptides) בריכוזים רלוונטיים קליני בפתרון שנאגרונסיוב דם ND יכול להיות מזוהה על ידי טכנולוגיית שלוחה תווית ללא שימוש. משטחי זהב טריים משמשים כי monolayers עצמית התאספו (Sams) נוטות ליצור שכבות יציבות בקלות על זהב נקי 13,14. טילים נ&quot;מ מורכב בדרך כלל ממולקולות קצרות עם מחצית תיאול המצורפת קוולנטית במשטח הזהב בזמן שיחידת לכידה הרצויה בצד השני מותרת להגיב בחופשיות עם המטרות אנליטי בתמיסה. Thiols ליצור מערכת גמישה במיוחד בהתחשב כי תרכובות תיאול רבות עם קבוצות קצה כימיות שונות זמינות באופן מסחרי או מסונתזים בקלות במעבדה. עם זאת, יש להקפיד על מנת להבטיח שמולקולות עם מחצית תיאול חייבת את קבוצות הקצה הנכונות, לדוגמה בחלבון או נטיה פפטיד, הקבוצה אמינית צריכה להתמודד פנימה לתגובה עם קבוצת carboxylic של מחצית תיאול קשורה על פני השטח כדי להתעורר. הנה, את thiols היה מצומדת ישירות עם mimetics tripeptide של חיידקי שומנים משניים בדופן תא acterial יעדים מסונתזת על ידי המתודולוגיה שלב מוצקה באמצעות זמין מסחרי מראש וואנג-D-עלא וואנג-D-Lac שרפים והסטנדרטי Fmoc הגנת קבוצת הכימיה 15. למרות שתיאור זה מתמקד לוונקומיצין, ברור שזה יכול להתארך לאנטיביוטיקה אחרות, ואכן מחקרים נוספים מוזמנים על ידי חוקרים מתחומים שונים ובמיוחד בביוכימיה, פרמקולוגיה, מדעי חומר ולאמץ פרוטוקול זה לניסויים שלהם בקלות.

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>Not in production</td></tr><tr><td>Six-way valve</td><td></td><td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>Enables multiple concentration injection</td></tr><tr><td>EB Evaporator</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, UK</td><td>Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems</td></tr><tr><td>Storage vessel</td><td></td><td>Agar Scientific, UK</td><td>Keeps gold coated films fresh</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td></td><td>King Precision Glass, Claremont, CA, USA</td><td>For capillary functionalization of the cantilever arrays</td></tr><tr><td>Pump</td><td></td><td>Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA</td><td>Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels</td></tr><tr><td>0.2-4.5 &amp;mu;m Filters</td><td>1511940001</td><td>Merck Millipore</td><td>For sample filtering</td></tr><tr><td>Cantilever chips</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Highly sensitive</td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>For making buffer solutions</td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>For making buffer solutions</td></tr><tr><td>Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware</td></tr><tr><td>DI water</td><td></td><td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td><td>Used for making solutions</td></tr><tr><td>Whole serum</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td><td>Used in measurements that mimic physiological conditions</td></tr><tr><td>Vancomycin (Van)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>Drug used</td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>Used for glassware cleaning procedures</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>Used for glassware cleaning procedures</td></tr><tr><td>D-Ala and D-Lac</td><td></td><td>London Centre for Nanotechnology (LCN)</td><td>Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions</td></tr><tr><td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td><td>Software used for instrumental interface to allow controlled measurements</td></tr></tbody></table>

nanomechanics of drug-target interactions and antibacterial resistance detection

חיישן שלוחה, הפועל כמתמר של תגובות בין מודל חיידקי דופן תא משותקת על פני השטח שלו ותרופות אנטיביוטיות בפתרון מטריצה, הראה פוטנציאל רב ביישומי חישה ביוכימיים ברגישות וסגוליות 1-5 חסר תקדים. את אינטראקציות סמים היעד ליצור מתח פני השטח, וגרם שלוחה להתכופף, והאות ניתן לנתח אופטי כאשר הוא מואר על ידי לייזר. השינוי במשטח לחץ נמדד בדייקנות בקנה מידה ננו מאפשר שיבושים בביומכניקה של קיר תא חיידק מודל המטרות כדי להיות במעקב בזמן אמת. למרות מציע יתרונות משמעותיים, חיישן מערכי שלוחה מרובים מעולם לא יושמו בכימות אינטראקציות מחייבות סמים היעד. כאן אנו מדווחים על השימוש במערכים מרובים שלוחה סיליקון מצופה עצמית התאספו monolayers alkanethiol מחקה חיידקי קיר מטריצת תא כמותית לסטהאינטראקציות מחייבות אנטיביוטיות dy. כדי להבין את ההשפעה של ונקומיצין על המכניקה של מבני קיר תא חיידק 1,6,7. אנחנו פיתחה מודל חדש שמציע 1 שלוחה כיפוף שיכולה להיות מתוארת על ידי שני גורמים בלתי תלויים; I) כלומר גורם כימי, אשר ניתן על ידי ספיחת האיזותרמה אנגמיור קלסית, שממנו אנו מחשבים את שיווי משקל תרמודינמי ניתוק הקבוע (K ד) ו ii) גורם גיאומטרי, למעשה מדד של כמה קולטנים פפטיד חיידקים מופצים על פני שלוחה. משטח ההפצה של קולטנים פפטיד (עמ &#39;) משמשת כדי לחקור את התלות של גיאומטריה וטעינה ליגנד. הוא הראה כי ערך סף של p ~ 10% הוא קריטי ליישומי חישה. שמתחתיו אין אות זיהוי תוך כיפוף מעל ערך זה, אות הכיפוף מגדילה כמעט ליניארי, חושפת כי לחץ הוא תוצר של חומר כימי מקומי מחייבים facטור וגורם גיאומטרי בשילוב של הקישוריות מכאנית של אזורים הגיבו ומספק פרדיגמה חדשה לעיצוב של סוכנים רבי עוצמה כדי להילחם בזיהומי superbug.

שינוי המתח נמדד באמצעות דיוק בקנה מידה ננו עם רגישות חסרת תקדים למחיקת H-אג&quot;ח בודד, מנוצל כדי לעקוב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק מודל בזמן אמת (איורים 2 א, ד). המגבלה של רגישות גילוי סמים ולאן נחקרה על ידי דילול סדרה ריכוזיה בצעדים מ1,000 מיקרומטר ≤ 10 ננומטר, חושף 10 ננומטר (~ 15 ng / ml) כריכוז הנמוך ביותר לזיהוי והוליד ממוצע של ~ -9 ± 2 ננומטר כמו כיפוף אותות דיפרנציאליים (איור 2 ג). היכולת לזהות אנטיביוטיקה תחת הסביבה פיזיולוגית הייתה עוד יותר נחקר בסרום בטווח ריכוז רלוונטי קליני של 3-27 מיקרומטר 17. על הזריקה של 7 מיקרומטר ואן בסרום (90% נסיוב עגל העוברי בתוספת 10% pH חיץ פוספט נתרן 7.4) על פני כל cantilevers בתנאים זהים, את אות ההפרש עבורDala בסרום היה 105 ± 4 ננומטר ואילו עבור cantilevers מצופה DLac, לא נצפה כיפוף (איור 3). את אותות כיפוף הניכרים שנצפו למצופה dala (vancomycin רגישה) cantilevers נגרמים על ידי יחסי גומלין מחייבים תרופה היעד החזקים. עם זאת למצופה DLac (vancomycin עמיד) cantilevers, הנוכחות של דחיית מצב קרקע של הזוג הבודד חמצן ואת קשר NH המופחת בכיס 10,12 vancomycin המחייבת תורם להיחלשות של אינטראקציות מחייבות סמים היעד שהתוצאה פחות או כיפוף לא שלוחה, במיוחד לריכוזים נמוכים יותר vancomycin (איור 3). עם זאת, לריכוז גבוה וונקומיצין, אנו צופים אותות כיפוף מדידים לDLac. יתר על כן, עיצוב הניסיון שלנו הוא חשוב להתייחסות באתר שבו כל cantilevers מצופה שניהם dala וDLac חשוף בו זמנית לאותו אנליטי בזמן אמת. כדי להבין את תפקידו המדויק של כימיה וגיאומטריה, תכננו 1 מודל המתאר את הקשר בין אינטראקציות ממס משטח מכניקה. זה מייצר את מתח פני השטח: <img alt="משוואת 1" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> עבור p&gt; מחשב ואפס אחר (1) כהונתו הראשונה במשוואה (1) היא אנגמיור ספיחת Isotherm, והיווה אירועים מחייבים סמים היעד והקדנציה השנייה היא צורת שלטון החוק המתארת ​​את ההשלכות מכאניות בקנה מידה גדולה של היווצרות רשת לחוץ. הקבועה מתאים למתח פני השטח מרבי כאשר כל אתרי הקישור הנגישים הם כבושים וK D הוא חסרונות דיסוציאציה שיווי המשקל על פני השטחTANT על שלוחה. הניתוח כפי שמוצג באיור 4 הוא התוצאה של ההתאמה הגלובלית של משוואה (1) על גבי אותות מתח דיפרנציאלי מדודים חושפים; ~ 29.7 ± 1.0 או 14.1 ± 3.0 Mn / מ &#39;ו-K ד ~ 1.0 ± 0.3 או 800 ± 310 מיקרומטר לפפטידים DLac D-עלא או, שבו מקביל מידה של משטח לחץ, כאשר כל אתרי הקישור הנגישים תפוסים. הרגישות המוגברת של שלוחה הייתה מכוונת על ידי שיטתי משתנה עמ צפיפויות פפטיד תוך ניטור נתוני הלחץ כפונקציה של p קבוע ואילו ריכוזי אנטיביוטיקה בגיל 10, 100, ו -250 מיקרומטר, בהתאמה (איור 5). התהליך חזר על עצמו עם מצבי לחץ כפונקציה של ריכוז ואן בזמן קבוע את צפיפויות פפטיד בעמ &#39;~ 100%. &lt;IMG alt = &quot;איור 1&quot; עבור: תוכן-width = src &quot;5IN&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; איור 1. גילוי שלוחה של אינטראקציות מחייבות משטח אנטיביוטי. ייצוג סכמטי) של מערך שלוחה חיישן והמצב שבו אינטראקציות סמים היעד מזוהות nanomechanically. ב) מחייבת אינטראקציה כימית בין מולקולת תרופה (ואן) והאנלוגי mucopeptide החיידקים (D-עלא או D-Lac). ג) המנגנון שבו מוטציה חיידקים רגישים Vancomycin (VSE) רוכש עמידות לוונקומיצין ידי מחיקת H-אג&quot;ח בודד בכיס המחייב. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; איור 2. מעקב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק המודל בזמן אמת. א) אותות כיפוף מוחלטים של cantilevers מצופה PEG בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר D-עלא, D-Lac ו. את אותות התייחסות PEG דיפרנציאלי מוצגים בקווים שחורים. ב) אותות כיפוף הפרש של cantilevers מצופי D-Lac בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר. ג) סטיית שלוחה ההפרש של אות תלויה במינון כפונקציה של זמן D-עלא ו בנוכחות ריכוזי vancomycin בבסדר הגודל של 10 ננומטר (קו צהוב), 100 ננומטר (קו אדום) ו -1,000 ננומטר (קו אדום כהה) בהתאמה. ד) אותות סטיית שלוחה ההפרש לשלושה חיישני שלוחה מצופי D-עלא כ פונקציה של זמן בנוכחות 10vancomycin ננומטר. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> איור 3. מעקב של השיבושים ביומכניקה מודל חיידקי דופן התא בזמן אמת לcantilevers מצופי D-Lac בנוכחות vancomycin מיקרומטר 7 בסרום עוברי עגל D-עלא ו. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> איור 4. חוקר את nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד. מגרש מראה את תגובת לחץ משטח ההפרש הנמדדת עבור D-עלא (עיגולים שחורים) וcantilevers מצופה כפונקציה של ונקומיצין D-Lac (עיגולים אדומים)ריכוז בתמיסה [אן]. הנתונים שתוארו על ידי משוואה (1) (קווים מוצקים). 1 <img alt="איור 5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> איור 5. אופטימיזציה של רגישות זיהוי nanomechanical של קולטן ליגנד אינטראקציות על ידי חוקר את התלות של העמסת קולט וגיאומטריה באמצעות monolayers מעורבת. תגובות דחק משטח דיפרנציאלי המדודות של חיישני שלוחה כפונקציה של D-עלא פני השטח כיסוי, עמ &#39;בנוכחות ריכוזים קבועים בvancomycin פתרון ב10 מיקרומטר (קו שחור), 100 מיקרומטר (קו אדום), וכ -250 מיקרומטר (קו ירוק).

Watch this Scientific Journal Video about Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection at JoVE.com

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקים עמידים.

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

nanomechanics-drug-target-interactions-antibacterial-resistance

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Views.  University College London. רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקי...

Video: Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our entire society's ability to treat systemic infections. In the United States alone, antibiotic-resistant infections kill approximately 23,000 people a year and cost around 20 billion USD in additional healthcare. One approach to combat antimicrobial resistance is combination therapy, which is particularly useful in the critical early stage of infection, before the infecting organism and its drug resistance profile have been identified. Many antimicrobial treatments use combination therapies. However, most of these combinations are additive, meaning that the combined efficacy is the same as the sum of the individual antibiotic efficacy. Some combination therapies are synergistic: the combined efficacy is much greater than additive. Synergistic combinations are particularly useful because they can inhibit the growth of antimicrobial drug resistant strains. However, these combinations are rare and difficult to identify. This is due to the sheer number of molecules needed to be tested in a pairwise manner: a library of 1,000 molecules has 1 million potential combinations. Thus, efforts have been made to predict molecules for synergy. This article describes our high-throughput method for predicting synergistic small molecule pairs known as the Overlap2 Method (O2M). O2M uses patterns from chemical-genetic datasets to identify mutants that are hypersensitive to each molecule in a synergistic pair but not to other molecules. The Brown lab exploits this growth difference by performing a high-throughput screen for molecules that inhibit the growth of mutant but not wild-type cells. The lab's work previously identified molecules that synergize with the antibiotic trimethoprim and the antifungal drug fluconazole using this strategy. Here, the authors present a method to screen for novel synergistic combinations, which can be altered for multiple microorganisms.

High-throughput Identification of Synergistic Drug Combinations by the Overlap2 Method

Synergistic drug combinations are difficult and time-consuming to identify empirically. Here, we describe a method for identifying and validating synergistic small molecules.

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה2

Although antimicrobial drugs have dramatically increased the lifespan and quality of life in the 20th century, antimicrobial resistance threatens our ...

Genetics

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Bioengineering

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria survive these stressful conditions. The hypothesis behind this method is new: stress activation of biochemical pathways, which are targets of antibiotics, can accelerate antibiotic susceptibility testing. As compared to standard antibiotic susceptibility testing methods, the rate-limiting step -&#160;bacterial growth -&#160;is omitted during antibiotic application. The technical implementation of the method is in a combination of standard techniques and innovative approaches. The standard parts of the method include bacterial culture protocols, defining microfluidic channels in polydimethylsiloxane&#160;(PDMS), cell viability monitoring with fluorescence, and batch image processing for bacteria counting. Innovative parts of the method are in the use of culture media flow for mechanical stress application, use of enzymes to damage but not kill the bacteria, and use of microarray substrates for bacterial attachment. The developed platform can be used in antibiotic and nonantibiotic related drug development and testing. As compared to the standard bacterial suspension experiments, the effect of the drug can be turned on and off repeatedly over controlled time periods. Repetitive observation of the same bacterial population is possible over the course of the same experiment.

We have developed a microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Fluid is passed at high speeds over bacteria immobilized on the bottom of a microfluidic channel. In the presence of stress and antibiotic, susceptible strains of bacteria die rapidly. However, resistant bacteria can survive these stressful conditions.

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקת סינון בתפוקה גבוהה עבור Mycobacterium abscessus באמצעות כתבים כפולים

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: Scalable Drug Screening Protocol for Efficient Discovery of M . abscessus Therapies

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many doses, allow sensitive measurement of drug interactions. However, these assays are costly and do not scale well for measuring interaction among many drugs. Several recent studies have reported drug interaction measurements using a diagonal sampling of the traditional checkerboard assay. This alternative methodology greatly decreases the cost of drug interaction experiments and allows interaction measurement for combinations with many drugs. Here, we describe a protocol to measure the three pairwise interactions and one three-way interaction among three antibiotics in duplicate, in five days, using only three 96-well microplates and standard laboratory equipment. We present representative results showing that the three-antibiotic combination of Levofloxacin + Nalidixic Acid + Penicillin G is synergistic. Our protocol scales up to measure interactions among many drugs and in other biological contexts, allowing for efficient screens for multi-drug synergies against pathogens and tumors.

In this protocol, we describe how to make Loewe additivity-based drug interaction measurements for pairwise and three-way drug combinations.

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

A synergistic drug combination has a higher efficacy compared to the effects of individual drugs. Checkerboard assays, where drugs are combined in many ...

Biology

Quadruple-Checkerboard: A Modification of the Three-Dimensional Checkerboard for Studying Drug Combinations

The concept of drug-combination therapy is becoming very important mainly with the drastic increase in resistance to drugs. The Quadruple&#160;checkerboard, also called the Q-checkerboard, aims at maximizing the number of possible combinations that can be obtained between four drugs in one experiment to minimize the time and work needed to accomplish the same results with other protocols. This protocol is based on the simple micro dilution technique where the drugs are diluted and combined together in several 96-well plates.
In the first set of 96-well plates, Muller-Hinton broth is added followed by the first required drug (e.g., Cefotaxime here) to serially dilute it. After the first step is done, another set of 96-well plates is used to dilute the second drug (e.g., Amikaci), which will be transferred by removing a specific volume of drug 2 and put in the corresponding wells in the first set of 96-well plates that contains drug one. The third step is done by adding the required concentrations of the third drug (e.g., Levofloxacin), to the appropriate plates in the initial set containing combination of drug 1 and 2. The fourth step is done by adding the required concentrations of the fourth drug (e.g., Trimethoprim-sulfamethoxazol) into the appropriate plates in the first set. Then, E. coli ESBL bacterial inoculum will be prepared and added.
This method is important to evaluate all the possible combinations and has a wider range of possibilities to be tested furthermore for in vivo testing. Despite being a tiring technique requiring a lot of focus, the results are remarkable and time saving where a lot of combinations can be tested in a single experiment.

This protocol describes how to study all possible combinations that can be obtained between four drugs in one single experiment. This method is based on the standard 96-well plate micro dilution assay and the calculation of fractional inhibitory concentrations (FICs) to evaluate the results.

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

זיהוי תפוקה גבוהה של שילובים תרופתיים סינרגטי בשיטת חפיפה²

Biosensor לאיתור של חיידקי סטפילוקוקוס עמידים לאנטיביוטיקה

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

שיטת באלכסון כדי למדוד סינרגיה בין כל מספר של סמים

לוח בדיקה מרובע: שינוי לוח השחמט התלת מימדי לחקר שילובי סמים