עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות לDJB (AI041930, AI073142, AI075931, וAI091461).

<ol>
	<li>Fox, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+II+Toxoplasma+gondii+KU80+knockout+strains+enable+functional+analysis+of+genes+required+for+cyst+development+and+latent+infection.">Type II Toxoplasma gondii KU80 knockout strains enable functional analysis of genes required for cyst development and latent infection.</a> Eukaryot. Cell. 10, 1193-1206 (2011).</li><li>Fox, B. A., Ristuccia, J. G., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+replacements+in+Toxoplasma+gondii+strains+deficient+for+nonhomologous+end+joining.">Efficient gene replacements in Toxoplasma gondii strains deficient for nonhomologous end joining.</a> Eukaryotic Cell. 8, 520-529 (2009).</li><li>Fox, B. A., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avirulent+uracil+auxotrophs+based+on+disruption+of+orotidine-5'-monophosphate+decarboxylase+elicit+protective+immunity+to+Toxoplasma+gondii.">Avirulent uracil auxotrophs based on disruption of orotidine-5'-monophosphate decarboxylase elicit protective immunity to Toxoplasma gondii.</a> Infection and Immunity. 78, 3744-3752 (2010).</li><li>Hortua Triana, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+molecular+characterization+of+the+pyrimidine+biosynthetic+enzyme+dihydroorotate+dehydrogenase+from+Toxoplasma+gondii.">Biochemical and molecular characterization of the pyrimidine biosynthetic enzyme dihydroorotate dehydrogenase from Toxoplasma gondii.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 184, 71-81 (2012).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+the+model+apicomplexan.">Toxoplasma gondii: the model apicomplexan.</a> Int. J. Parasitol. 34, 423-432 (2004).</li><li>Gajria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ToxoDB:+an+integrated+Toxoplasma+gondii+database+resource.">ToxoDB: an integrated Toxoplasma gondii database resource.</a> Nucleic Acids research. 36, 553-556 (2008).</li><li>Kim, K., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma:+the+next+100+years.">Toxoplasma: the next 100 years.</a> Microbes and infection / Institut Pasteur. 10, 978-984 (2008).</li><li>Butcher, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+rhoptry+kinase+ROP16+activates+STAT3+and+STAT6+resulting+in+cytokine+inhibition+and+arginase-1-dependent+growth+control.">Toxoplasma gondii rhoptry kinase ROP16 activates STAT3 and STAT6 resulting in cytokine inhibition and arginase-1-dependent growth control.</a> PLoS pathogens. 7, e1002236 (2011).</li><li>Daher, W., Klages, N., Carlier, M. F., Soldati-Favre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+Toxoplasma+gondii+formin+3,+an+actin+nucleator+dispensable+for+tachyzoite+growth+and+motility.">Molecular characterization of Toxoplasma gondii formin 3, an actin nucleator dispensable for tachyzoite growth and motility.</a> Eukaryot. Cell. 11, 343-352 (2012).</li><li>Fentress, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+immunity-related+GTPases+by+a+Toxoplasma+gondii-secreted+kinase+promotes+macrophage+survival+and+virulence.">Phosphorylation of immunity-related GTPases by a Toxoplasma gondii-secreted kinase promotes macrophage survival and virulence.</a> Cell Host Microbe. 8, 484-495 (2010).</li><li>Musiyenko, A., Majumdar, T., Andrews, J., Adams, B., Barik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRMT1+methylates+the+single+Argonaute+of+Toxoplasma+gondii+and+is+important+for+the+recruitment+of+Tudor+nuclease+for+target+RNA+cleavage+by+antisense+guide+RNA.">PRMT1 methylates the single Argonaute of Toxoplasma gondii and is important for the recruitment of Tudor nuclease for target RNA cleavage by antisense guide RNA.</a> Cellular microbiology. 14, 882-901 (2012).</li><li>Straub, K. W., Peng, E. D., Hajagos, B. E., Tyler, J. S., Bradley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+moving+junction+protein+RON8+facilitates+firm+attachment+and+host+cell+invasion+in+Toxoplasma+gondii.">The moving junction protein RON8 facilitates firm attachment and host cell invasion in Toxoplasma gondii.</a> PLos Pathog. 7, e1002007 (2011).</li><li>Szatanek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cactin+is+essential+for+G1+progression+in+Toxoplasma+gondii.">Cactin is essential for G1 progression in Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 84, 566-577 (2012).</li><li>Donald, R. G., Carter, D., Ullman, B., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insertional+tagging,+cloning,+and+expression+of+the+Toxoplasma+gondii+hypoxanthine-xanthine-guanine+phosphoribosyltransferase+gene.+Use+as+a+selectable+marker+for+stable+transformation.">Insertional tagging, cloning, and expression of the Toxoplasma gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase gene. Use as a selectable marker for stable transformation.</a> J. Biol. Chem. 271, 14010-14019 (1996).</li><li>Donald, R. G., Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+knock-outs+and+allelic+replacements+in+Toxoplasma+gondii:+HXGPRT+as+a+selectable+marker+for+hit-and-run+mutagenesis.">Gene knock-outs and allelic replacements in Toxoplasma gondii: HXGPRT as a selectable marker for hit-and-run mutagenesis.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 91, 295-305 (1998).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Borotz, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+characterization+of+a+mutant+resistant+to+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: characterization of a mutant resistant to 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 79, 374-382 (1994).</li><li>Gietz, R. D., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frozen+competent+yeast+cells+that+can+be+transformed+with+high+efficiency+using+the+LiAc/SS+carrier+DNA/PEG+method.">Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method.</a> Nature Protocols. 2, 1-4 (2007).</li><li>Oldenburg, K. R., Vo, K. T., Michaelis, S., Paddon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination-mediated+PCR-directed+plasmid+construction+in+vivo+in+yeast.">Recombination-mediated PCR-directed plasmid construction in vivo in yeast.</a> Nucleic Acids Res. 25, 451-452 (1997).</li><li>Fox, B. A., Gigley, J. P., Bzik, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+lacks+the+enzymes+required+for+de+novo+arginine+biosynthesis+and+arginine+starvation+triggers+cyst+formation.">Toxoplasma gondii lacks the enzymes required for de novo arginine biosynthesis and arginine starvation triggers cyst formation.</a> Int. J. Parasitol. 34, 323-331 (2004).</li><li>Roos, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+tools+for+the+identification+and+analysis+of+drug+targets+in+Toxoplasma+gondii.">Molecular genetic tools for the identification and analysis of drug targets in Toxoplasma gondii.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 219, 247-259 (1996).</li><li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii.">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods in Cell Biology. 45, 27-63 (1994).</li><li>Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+tachyzoite+to+bradyzoite+differentiation+mutants+in+Toxoplasma+gondii+reveals+a+hierarchy+of+gene+induction.">Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction.</a> Molecular Microbiology. 44, 721-733 (2002).</li><li>vanden Hoff, M. J., Moorman, A. F., Lamers, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+in+'intracellular'+buffer+increases+cell+survival.">Electroporation in 'intracellular' buffer increases cell survival.</a> Nucleic Acids Research. 20, 2902 (1992).</li><li>Pfefferkorn, E. R., Bzik, D. J., Honsinger, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii:+mechanism+of+the+parasitostatic+action+of+6-thioxanthine.">Toxoplasma gondii: mechanism of the parasitostatic action of 6-thioxanthine.</a> Exp. Parasitol. 99, 235-243 (2001).</li><li>Mital, J., Meissner, M., Soldati, D., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+expression+of+Toxoplasma+gondii+apical+membrane+antigen-1+(TgAMA1)+demonstrates+that+TgAMA1+plays+a+critical+role+in+host+cell+invasion.">Conditional expression of Toxoplasma gondii apical membrane antigen-1 (TgAMA1) demonstrates that TgAMA1 plays a critical role in host cell invasion.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 4341-4349 (2005).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מספקים פרוטוקול לגן המיקוד יעיל בזני הטפיל ku80 Δ כדי לאפשר התאוששות היעילה של צאצאי מניפולציות גנטית שיש ממוקדים מחיקות גנים, תחליפי גן, ו / או גנים מתויגים. הביצוע הרציף של שיטות אלה מספק גישה אמינה לבידוד של מוטציות טפילות המכילות מניפולציות גנטיות ממוקדות בודדות או מרובות 1-3. בעוד הדור של מחיקה ממוקדת תלוי בגורמים רבים, השימוש במתח Δ ku80 עם אסטרטגיה ופרוטוקול המובא מגדיל מאוד את היעילות וקלות מה שהופך את הזנים מוטנטים מוגדרים במדויק של ט gondii ללימודים הגנומי תפקודיים. הגנום של ט &#39; gondii במהלך שלבי זוויגיים הוא הפלואידים. כך בחשבון בעת תכנון לעשות כדי למחוק גן הוא, כי הגן לא חייב להיות חיוני במבחנה. יחד עם זאת, את היעילות של targeknockouts טינג גנים בזני Δ ku80 הוא גבוה מאוד, וזה מאפשר בידוד של זנים מוטנטים עם שיעורי שכפול לקויים באופן משמעותי. אם גן ממוקד הוא חיוני, טפילים לעתים קרובות יפסיקו לשכפל במהלך בחירה. גורם קריטי נוסף במניפולציה גנטית ממוקדת הוא שההומולוגיה מושלמת עם לפחות 620 נ&quot;ב של אגף המיקוד הגנומי נדרש כדי להשיג אינטגרציות ממוקדות לגילוי 2. אזורים ארוכים יותר הומולוגיה לייצר יעילות גבוהה יותר של מיקוד ומיקוד באמצעות אגפי ה-DNA של כ -1,000 נקודות בסיס הוא גישה אמינה ויעילה 1-4. מסיבה זו חשוב שאגפי מיקוד גנומית נוצרים מאותו הזן של ט gondii (RH, Pru) כזן אשר נמצא במניפולציות גנטית. חוסר ההומולוגיה מספקת יכול לעתים קרובות לגרום לאינטגרציה ממוקדת של אגף מיקוד אחד הגנומי, אבל לא את השני. אינטגרציה הושלמה, או אי קבלת תואר שני בנוקאאוטy להיות גם עקב התמדת episomal. מייד לאחר transfection, כל מולקולות המיקוד הם nonintegrated episomes, ולפעמים מולקולות מיקוד יכולות להימשך כepisomes במשך דורות רבים. באמצעות אגפי DNA היעד של ~ KBP 1 וממשיך להעביר טפילים מתחת לפני בחירה מחדש subcloning לעתים קרובות פותר בעיות הקשורות להתמדת episomal. ברגע שהוא תוקף נוקאאוט וסמן HXGPRT מוסר, ניתן לחזור על אסטרטגיית המיקוד בגן GOI שני לייצר מחיקות מרובות בגני זן טפיל חד 1-3. הדור של מחיקות, תחליפים, או גנים המכילות את התווית גם ניתן להשיג על ידי שימוש בסמנים שונים (לבחירת bleomycin, חתול, pyrimethamine עמיד DHFR, וכו &#39;). למרות שהסמן לבחירת CAT כרגע נמצא בסוג השני Δ ku80 Pru הגנום 1, ניתן להסירו באמצעות סמן זה HXGPRT </em&gt; פרוטוקול בחירה מתואר כאן. בידיים שלנו, בחירת HXGPRT היא הבטוחה ביותר וסמן יעיל ביותר עם ​​היעילות הגבוהה ביותר שבו מיקוד החדרה ממוקדת עותק יחידה היא מספיק חזקה לבחירה בMPA + X בינוני. HXGPRT גם מספק גישה רק שימושית כיום למחיקה ממוקדת של סמן לבחירה (איור 3) באמצעות 6 thioxanthine (6TX) מבחר 2,3. לכן פרוטוקול זה מספק גישה הנוכחית רק לפיתוח זנים מוטנטים מוגדרים עם כמה מניפולציות גנטיות ממוקדות. פרוטוקול זה מספק שיטה יקר ויעילה למניפולציה גנטית ממוקדת בזני Δ ku80 של Toxoplasma gondii וישים לניתוח של גן יחיד, משפחה של גנים, או מחקרים גנומיים פונקציונליים הגנום. לפני הזמינות של 1,2 Δ ku80 זנים, גישות אלו לא היו נרחבת ריאלי בשל inefficiency של שיטות אלה. כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הוא ישים באופן נרחב למניפולציה גנטית ממוקדת של Toxoplasma gondii, והוא נגיש לכל החוקרים המתעניינים בטיפול במגוון רחב של שאלות על טפיל ביולוגיה, תגובה מארחת, וגנומיקה פונקציונלית.

Toxoplasma gondii הוא טפיל שלעתים קרובות protozoan תאי מחייב שכיח וכרוני מדביק מגוון רחב של בעלי חיים ובני אדם 5. ההערכה היא כי יותר מ 1 מליארד בני אדם כיום ונגוע כרוני על ידי פתוגן זה. בנוסף לחשיבות של מחלה הנגרמת על ידי ט gondii זיהום, הזמינות הגוברת של כלים ניסיוניים, משאבי גנומיקה עוצמה 6, קלה בצמיחת מבחנה ומודלי עכבר מצוין עשה ט gondii מערכת מודל מוביל למחקר הרחב יותר של פתוגנים אוקריוטים תאיים וטפילי apicomplexan משמעותיים אחרים הגורמים למחלות הרסניות כגון מלריה (Plasmodium sp.) וCryptosporidiosis (Cryptosporidium) 5,7. מגבלה משמעותית של Toxoplasma gondii כאורגניזם מודל כבר לא יעילה ההתאוששות של צאצאים שנושאים ממוקדות מניפולציות גנטיות. זה probleמ &#39;במיקוד גן בשל תדירות נמוכה של הומולוגי רקומבינציה יחסית לתדר הגבוה מאוד של nonhomologous רקומבינציה בזני הבר מסוג של ט gondii גם כאשר ה-DNA הומולוגיה נרחבת ניתן במולקולות מטרת דנ&quot;א המשמשים במחקרים גנטיים 2. לאחרונה חסמו גנטי המסלול העיקרי של nonhomologous רקומבינציה בסוג I וסוג II Toxoplasma gondii זנים של ידי מחיקת גן מקודד החלבון 1,2 KU80. סוג כתוצאה מכך אני וזנים מסוג II Δ ku80 מפגינים שיעורי צמיחה נורמלים, גודל והתנהגות הן במבחנה in vivo במהלך tachyzoite ושלבי bradyzoite במבחנה ובחי, עם זאת, זנים אלה מפגינים בעצם תדר 100% מהומולוגיים רקומבינציה וזה הפנוטיפ מגביר את הסבירות של מהירות צאצאי בידוד רצוי של מניפולציות גנטיות ממוקדות על ידי כמה מאה עד כמה אףUSand פי 1,2,4. השימוש האחרון בקהילה רחבה של סוגים והזנים שאני סוג II Δ ku80 יש ramped באופן משמעותי את הקצב, מגוון, כמו גם את שיעור ההצלחה של גישות גנטיות ממוקדים בט gondii 1-4,8-13. כאן אנו מתארים פרוטוקול מקיף לממוקד מחיקת גן, החלפת גן, ותיוג גן בזני Δ ku80 של ט gondii. נדגים לנו כיצד לעצב ומהימן למקד מניפולציות גנטיות לגנים ספציפיים או לוקוסים גנטיים בזני Δ ku80 של Toxoplasma gondii.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Overlap Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>4 nmole Ultramer DNA oligos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Validation Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>100 nmole DNA Oligo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Strain #90845</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Designation FY834</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shuttle Vector pRS416</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>87521</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DH10B E. coli</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12033-015</td>
			<td>SOC broth in kit with E. coli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resuspension Buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Buffer P1 in QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Beads</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-BG05</td>
			<td>0.5 mm acid-washed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiacube Automated Robotic Work Station</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation Cuvette</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>9104-5050</td>
			<td>2 mm-gap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BTX600 electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxiprep Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12662</td>
			<td>QIAprep Spin Maxiprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 cm2 Canted neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430168</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 cm2 Canted Neck plug seal flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430823</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>SCRC1041</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swin-lok Filter Holder</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>420200</td>
			<td>25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110612</td>
			<td>Nucleopore Track-etched Membrane 3 mm pore size, 25-mm-diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mycophenolic acid (MPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xanthine (X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Tissue Culture Tray</td>
			<td>Corning Costar</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Eagle Media</td>
			<td>Lonza Biowhittaker</td>
			<td>12-611F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-111</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (Anti-Anti)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin Column</td>
			<td>Primm Labs</td>
			<td>PAE-100</td>
			<td>Easy Clean DNA Extraction Spin Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-thioxanthine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue DNA Minikit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51104</td>
			<td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Freeze/Recovery Media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>126-48-010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td>minus calcium, minus magensium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic manipulation in &delta;ku80 strains for functional genomic analysis of toxoplasma gondii

מניפולציה גנטית ממוקדת באמצעות הומולוגי רקומבינציה היא שיטת בחירה של אנליזה גנומית תפקודית לקבל תצוגה מפורטת של תפקוד גן והפנוטיפ (ים). הפיתוח של זנים מוטנטים עם מחיקות ממוקדות, מוטציות גנטיות ממוקדות, תפקוד גן כהשלמה, ו / או גנים מתויגים מספק אסטרטגיות חזקות כדי לטפל בתפקוד גן, במיוחד אם מניפולציות גנטיות אלה יכולים להיות ממוקדות ביעילות למוקד הגן של עניין באמצעות תיווך אינטגרציה על ידי לחיצה כפולה לחצות הומולוגי רקומבינציה. בשל שיעור גבוה מאוד של nonhomologous רקומבינציה, אנליזה גנומית התפקודית של Toxoplasma gondii היה מוגבל בעבר על ידי העדר שיטות יעילות למיקוד מחיקות גנים והחלפות גן ללוקוסים גנטיים ספציפיים. לאחרונה, ביטל את המסלול העיקרי של nonhomologous רקומבינציה בסוג I וסוג II זנים של ט gondii ידי מחיקת encodin הגןגרם החלבון 1,2 KU80. את Δku80 הזנים להתנהג כרגיל במהלך tachyzoite (אקוטי) וbradyzoite (כרוני) שלבים במבחנה ובחי ולהציג למעשה תדר 100% מהומולוגיים רקומבינציה. זני ku80 Δ לעשות מחקרים גנומיים פונקציונליים אפשריים בגן היחיד, כמו גם בקנה מידת הגנום 1-4. כאן אנו מדווחים שיטות לשימוש בסוג זה אני וזנים מסוג II Δku80Δhxgprt לקדם גישות המתמקדות בגנים ב ט gondii. אנו מתארים שיטות יעילות להפקת מחיקות גנים, תחליפי גנים, וגנים מתויגים על ידי החדרה או מחיקה ממוקדות של הסמן (HXGPRT) phosphoribosyltransferase hypoxanthine-xanthine-גואנין לבחירה. הגן תאר מיקוד פרוטוקול יכול לשמש במגוון רחב של דרכים בΔku80 זנים לקדם ניתוח פונקציונלי של הגנום הטפיל ולפתח זנים יחידים שנושאיםמרובים ממוקד מניפולציות גנטיות. יישום שיטה זו גנטית והמבחנים פנוטיפי הבאים יחשוף היבטים בסיסיים וייחודיים של הביולוגיה של ט &#39; gondii ופתוגנים אנושיים משמעותיים נלווים הגורמים למלריה (Plasmodium sp.) וCryptosporidiosis (Cryptosporidium).

תבנית מפורטת מסופקת לבניית פלסמיד מיקוד למחוק גן, כולל מיקום של אתרי אנזים הגבלה והדור של פריימרים המאפשרים מיקוד גנטי ואימות של גן מיקוד, כמו גם בניית פלסמיד למחיקה הבאה של HXGPRT ב תהליך בשלב יחיד (איורים 1 א-C, איור 2 א, איור 3 א). סכמטי כללית מוצג לביצוע מחיקת גן ממוקד (איור 2 א), לזוגות פריימר משמשים כדי לאמת את המחיקה של נוקאאוט, למשל, אני סוג rop18 (איור 2), ותוצאות מייצגות של אימות PCR מוצגות (איור 2 ג). תוצאת נציג זו מוצגת כדי להמחיש את מגוון רחב של תוצאות שניתן להשיג בלוקוסים גנטיים שקשה יחסית ליעד. מחיקת גן ממוקדת בהצלחה תגרום להיעדרות של הגן של במוצר terest PCR (1 PCR), הנוכחות של 3 &#39;מיקוד אגף גנומית (PCR2), ואת הנוכחות של הסמן לבחירת HXGPRT המשולב כראוי בין 5&#39; צלעות מיקוד הגנומי &#39;3 המגדירות את המחיקה (PCR3 וPCR4) ו . 3 שיבוטים, 4, 5, 6, 8, 9, ו -11 הם תוקף מחיקות גן ממוקדות (knockouts) שבו החליף את HXGPRT GOI (איור 2 ג). שיבוט שאינו מכיל מחיקת גן יכול להיות מיוצג על ידי מגוון רחב של דפוסי banding. בדרך כלל, שיבוט ללא מחיקת גן יהיה במראה את הלחץ ההורי (דפוס הורי) עם להקות שנצפו לPCR1 וPCR2, אך לא לPCR3 או PCR4 כפי שניתן לראות לשיבוטי 1 ו -2 (איור 2 ג). &quot;דפוס הורי&quot; זה נובע מכמה מנגנונים אפשריים. לפעמים, טפילים עמידים MPA נבחרו לשאת episomes מתמיד nonintegrated של pΔGOI מיקוד פלסמיד, ונציין, כי בחירת המשך לעתים קרובות מאלצת episomes אלהלשלב. אנחנו גם שומרים קצת רקע נדיר בסוג I Δ ku80 מתח בשל שילוב לא מכוון של pΔGOI מיקוד פלסמיד, המכיל cDNA HXGPRT הביע באמצעות אלמנטים של פרומוטר DHFR 5 &#39;3 ו&#39;, או למוקד או לDHFR HXGPRT נמחק באופן חלקי לוקוס 14. אמנם האירוע הנדיר הזה הוא שילוב ממוקד, זה לא היה שילוב המיועד ומשמש כנקודת מפתח שיש לזכור בעיצוב כל אסטרטגית החלפת גנים. הומולוגיה-DNA גדול יותר מ -120 נ&quot;ב נשא על pΔGOI המיקוד שלך לפלסמיד עשויה לספק אתר חלופי לרקומבינציה בku80 זני Δ 2 שיכולים לתת בחזרה רקע בלתי רצוי. בסוג הזן השני Pru Δ ku80 רקע זה מצטמצם או לא קיים בהשוואה להקלדה אני משום הסמן לבחירת HXGPRT מבוסס על סוג I רצפים שיש לי פולימורפיזמים נוקלאוטיד בהשוואה עם ה-DNA מסוג II המקטין באופן משמעותי רקע נדיר זו בניסויים בשימוש בסוג השני Pru Δ ku80 זן 1. אם מוקד גן חיוני (לא ניתן למחוק), או שיש גן נמוך מאוד מיקוד תדירות במוקד, או אם מתמיד [nonintegrated] episomes לא בוטל בקלות באמצעות צמיחה ובחירה, דפוס הורי זה ישלוט הדפוס שנצפה בMPA שיבוטים עמידים. לחלופין, מולקולת הדנ&quot;א המיקוד לעתים נצפתה לשלב רק ב 5 &#39;או 3&#39; אגף מיקוד הגנומי ולהקה הוא ציין גם עבור PCR3 או PCR4 (אך לא את שניהם), יחד עם PCR1 וPCR2 כפי שניתן לראות לשיבוט 10 (5 &quot;אינטגרציה) ושיבוט 7 (3 &#39;אינטגרציה) (איור 2 ג). דפוסים אלה מצביעים על התופעה נדירה של צלב יחיד על שילוב של מיקוד פלסמיד במוקד המשלב HXGPRT אבל אינטגרציה ממוקדת זו אינה מוחקת את הגן של עניין. דפוס זה (נתיבים 7 &amp; 10 באיור 2 ג)phasizes הצורך לדווח על נתוני ה-PCR כדי לוודא שהאינטגרציה ממוקדת התרחשה במקום יחידה הומולוגי לחצות ואינטגרציה שנייה nonhomologous של מולקולת המיקוד. לעיתים נדירות, אנו רואים תערובת גנטית מיוצגת על ידי 12 שיבוט (איור 2 ג) שמייצג גם דפוס הורי ודפוס מחיקה ממוקד. דפוס זה ככל הנראה נובע בהזדמנות משני גנוטיפים טפילים שנמצאים באותו המקום בשיבוט היטב. סכמטי כללית להסרת HXGPRT מΔ ku80Δgoi :: HXGPRT למחוק HXGPRT מהזן מוצג (איור 3 א). זוג פריימר משמש לאימות הסרת HXGPRT מΔ Δ ku80 gra2 :: HXGPRT (איור 3) מגביר ~ להקת KBP 1.2 ייחודית בPCR5 כפי שניתן לראות בשיבוטי 4, 7, 9, 11 ו -12 (איור 3 ג). אם HXGPRT לא הוסר מהלוקוס, ~ 3.4 KBP להקה הוא ציין (1 שיבוטים, 2, 3, 6, 8, 10, ובקרת ההורים). מספר מנגנונים לפעול כדי להפוך את הסרת HXGPRT (6TX בחירה) יותר מאתגר ופחות יעילה מאשר שילוב של HXGPRT (MPA + X מבחר). בחירת MPA היא פשוט יעילה יותר מ6TX בחירת 14,16. בנוסף, רמות גבוהות יותר של ביטוי HXGPRT נדרשות לבחירת 6TX מאשר לMPA בחירות 16,24. כתוצאה מכך, מוטציות שעשויות להפחית את פעילות אנזים HXGPRT או מוטציות או שינויים אפיגנטיים המפחיתים את רמת הביטוי של HXGPRT במוקד של גן עלולים לבטל את האפקטיביות של בחירת 6TX. אפילו עם אתגרים של בחירת 6TX אלה, שיעור ההצלחה של בחירת 6TX בזני ku80 Δ הוא יותר מ -90% בניסיון הראשון 1-3. תכנית כללית לתיוג C-מסוף ישיר של חלבון קידוד גנים מוצג (איור 4). זהתכנית עושה שימוש באינטגרציה ישירה באמצעות צלב כפול מעל הומולוגי רקומבינציה של HXGPRT 3 &#39;של הגן מתויג ומעסיקה גם אסטרטגיות אימות דומות לאלה שתוארו לעיל. כאשר יש חשד לגן להיות גן חיוני זה ניתן לאמת באמצעות transfection שנייה עם ה-DNA מיקוד באופן עצמאי בודד פלסמיד. שיטות חלופיות, כגון תוכניות לביטוי מוסדר גן, זמינות לאימות נוספת, אם גן הוא חיוני 25. <img alt="איור 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig1.jpg" /> איור 1. סקירה כללית של העיצוב של ה-DNA פלסמיד מיקוד. . סכמטי לעיצוב חפיפה פריימרים המשמשים לPCR להגביר אגפי היעד 5 &#39;3 ו&#39; עם 33 נ&quot;ב חופף לוקטור מעבורת pRS416 וקלטת minigene HXGPRT. פריימרים המתוארים בסכימה היוהשתמש כדי ליצור את 5 &#39;ו 3&#39; צלעות היעד של pΔROP18 10. אסטרטגיה כוללת לעיצוב ב &#39;מולקולת הדנ&quot;א מיקוד. עמוד השדרה של pΔGOI הוא אורציל pRS416 מעבורת הווקטור המכיל (אורה) ו( AMP) סמנים לבחירת אמפיצילין. הכניס היא לתוך pRS416 ~ 1 KBP 5 &#39;אגף יעד DNA מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף לקלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות primers F1 וR1, ~ KBP 3 1&#39; אגף יעד DNA מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף ל קלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות primers F2 ו R2 ואת קלטת minigene HXGPRT. אתרי אנזים ההגבלה הייחודיים הבאים לעכל מתווספים לפריימרים: RE.X (אתר חתך אנזים הגבלת X) בפריימר F1 כדי לחתוך את הפלסמיד ב5 &quot;סוף של 5 &#39;אגף יעד ה-DNA, בRE.Y R2 פריימר לחתוך את הפלסמיד ב&#39;סוף 3 &#39;3 אגף יעד ה-DNA וRE.Z בפריימרים R1 וF2 כדי בלו דקות HXGPRTרצפי קלטות igene. ג פריימר השתמשו כדי ליצור את מבנה המיקוד למחיקה של rop18. האזורים המודגשים מתאים לט רצף הגנומי gondii, ואזורי nonbold מתאים לאתרי אנזים ההגבלה והרצפים אשר חופפים pRS416 וקלטת minigene HXGPRT. זוג פריימר HX_F וHX_R מגביר את קלטת minigene 14 HXGPRT. פריימרים לקרוא מ5 &#39;ל 3&#39;. לוח מותאם פנטרס ואח&#39; 10. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50598/50598fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig2.jpg" /> איור 2. סקירה כללית של הפרוטוקול למחיקה של גנים באמצעות HXGPRT. . Disruption של אירוע רקומבינציה הומולוגית באמצעות ~ 1 &#39;אגף יעד ה-DNA ו~ KBP 3 1&#39; KBP 5 אגף יעד ה-DNA בpΔGOI פלסמיד GOI בזן ku80Δhxgprt Δ ידי מוצלב כפול. אסטרטגיה באמצעות PCR PCR1, PCR2, PCR3, וPCR4 (שלא בקנה מידה) מוצגים המאפשרת אימות גנוטיפ כדי לאמת את השיבוטים עם שילוב ממוקד של HXGPRT ומחיקה של לוקוס GOI. זוגות פריימר נציג B. נועדו לאמת את המחיקה של rop18 . ROP18_DF וROP18_DR להגביר PCR1, ROP18_ExF וROP18_CxR להגביר PCR2, ROP18_CxF וDHFR_CxR להגביר PCR3 וDHFR_CxF וROP18_CxR להגביר PCR4 (ראה איור 2 א). פריימרים לקרוא מ5 &#39;ל 3&#39;. לוח מותאם פנטרס אח&#39; 10 תוצאות נציג. ג האימות של מחיקת גן ממוקדת (rop18) באמצעות HXGPRT. Transfection הבאה של pΔROP18 פלסמיד לתוך Δ ku80Δhxgprt ובחירה בMPA +X, X + MPA שיבוטים העמידים היו assayed למחיקה של rop18. בקרת ההורים היא המתח חיובית עבור 1 PCR (~ 400 נ&quot;ב) וה-PCR 2 (~ 650 נ&quot;ב) ושלילית למוצר ה-PCR 3 (~ 1,200 BP) ו-PCR 4 (~ 1,300 BP) מוצר. נוקאאוט GOI ממוקד הוא חיובי עבור מוצרי PCR2, PCR3 וPCR4 ושלילי למוצר ה-PCR 1 (ראה איור 2 א). מוצגים הם פנלים מייצגים של תוצאות PCR1 וPCR2 (פנל עליון), PCR3 (פנל באמצע), וPCR4 (פנל תחתון). 3 שיבוטים, 4, 5, 6, 8, 9 ו -11 מציגים את דפוס הפסים הנכון של 1-PCR, PCR2, PCR3 וPCR4 שמגדיר את אירוע מחיקת גן ממוקד בשיבוט. 1 שיבוטים, 2, 7, 10 ו -12 אינם מחיקות גנים, ומתאימים לתוצאות נציג פוטנציאליות אחרות. (C = זן בקרת ההורים Δ ku80Δhxgprt, מ = סמני גודל). <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/50598/50598fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig3.jpg" /> איור 3. סקירה כללית של הפרוטוקול למיקוד מחדש את הגן של עניין למחוק HXGPRT. האסטרטגיה א &#39;להסרת הסמן לבחירת HXGPRT ידי מוצלב כפול אירוע רקומבינציה הומולוגית בזן Δ ku80Δgoi :: HXGPRT באמצעות ~ 1&#39; אגף יעד ה-DNA ו~ 1 KBP 3 &#39;KBP 5 אגף יעד ה-DNA בpΔGOIc פלסמיד. אסטרטגיית ה-PCR לאימות גנוטיפ מתוארת באמצעות זוג פריימר לassay עבור מוצר ה-PCR (PCR5) החובק את המחיקה (שלא בקנה מידה). ב &#39;זוג פריימר נציג שנועד לאמת את ההסרה של הסמן לבחירת HXGPRT מgra2 לוקוס בזן Δ ku80Δgra2 :: HXGPRT. Primers GRA2 _CLF וGRA2_CxR להגביר PCR5. פריימרים<html> לקרוא מ5 &#39;ל 3&#39; פנל. נציג ג השיבוטים 6TX העמידים שהיה יכולים להתקבל transfection הבאה של pΔGOIc פלסמיד לתוך Δ ku80Δgoi :: HXGPRT והבחירה ב6TX. שיבוטים 4, 7, 9, 11 ו -12 מציגים את הדפוס הנכון של פסי PCR5 המתאימים למחיקה ממוקדת של סמן HXGPRT (~ 1.2 KBP מוצר שמשתרע על פני &#39;אגף עם חפיפה קלה עם 5&#39; 3 אגף ומחוצה לו 3 &#39; אגף). 1 שיבוטים, 2, 3, 6, 8, ו -10 (הלהקה הזאת היא אור) מייצגים את דפוס הפסים הצפוי של כ ~ 3.4 KBP שמתאים לגנוטיפ השיבוט ההורי, למרות ששיבוטים אלה הציגו מידה מסוימת של התנגדות ל6TX שמותרית הבחירה שלהם (הפנוטיפ זה לעתים יכול להיווצר באופן ספונטני על ידי כיבוי ביטוי HXGPRT (ראה הערה בפרוטוקול 2.1 (שלב 8) וסעיף נציג תוצאות). (C, M = סמני גודל = זן בקרת ההורים Δ ku80Δgoi :: HXGPRT).w.jove.com/files/ftp_upload/50598/50598fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50598/50598fig4.jpg" /> איור 4. עיצוב של מולקולת הדנ&quot;א מיקוד לתייג סוף C-המסוף של חלבון. האסטרטגיה מבוססת על יכולתו של סמן HXGPRT גם לתפקד כאזור רגולציה במורד הזרם 3 &#39;. עמוד השדרה של pΔGOItag הוא אורציל מכיל pRS416 מעבורת הווקטור (אורה) ו( AMP) סמנים לבחירת אמפיצילין. הכניס היא לתוך pRS416 ~ &#39;אגף ה-DNA היעד מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף לקלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות Fgoi וRtag פריימרים, ~ KBP 3 1&#39; 1 KBP 5 אגף יעד DNA מוגבר מהדנ&quot;א הגנומי עם חופף ל קלטת minigene HXGPRT וpRS416 באמצעות F2 וR2פריימרים וקלטות minigene HXGPRT. אגף ה-DNA יעד 5 &#39;מחליף את קודון הסיום עם התג (HA, Myc,, וכו&#39;) ואחרי קודון סיום החלפה. MPA + X מבחר משלב את תג C-המסוף וHXGPRT במורד הזרם, ומעביר את &#39;3 UTR לעמדה הבא סמן HXGPRT. אתרי אנזים ההגבלה הייחודיים הבאים לעכל מתווספים לפריימרים: RE.X (אתר חתך אנזים הגבלת X) בפריימר Fgoi לחתוך את הפלסמיד ב5 &quot;סוף של 5 &#39;אגף יעד ה-DNA, וRE.Y ב R2 פריימר לחתוך את הפלסמיד ב&#39;סוף 3 &#39;3 אגף יעד ה-DNA, וRE.Z בRtag ופריימרים F2 כדי בלו קלטת minigene HXGPRT לשימוש לבנייה לפלסמיד למקד מחדש את לוקוס הגן מתויג למחוק סמן HXGPRT שישחזר את המיקום של &#39;3 UTR.

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Manipulation in ÃŽâ€ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii at JoVE.com

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג II<em&gt; Δku80</em&gt; זנים של<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; כדי לייצר ביעילות מחיקות גן ממוקדת והחלפות גן לאנליזה גנומית תפקודית.

מניפולציה גנטית ב<em&gt; Δku80</em&gt; זנים לאנליזה גנומית תפקודית של<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

genetic-manipulation-ku80-strains-for-functional-genomic-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.0K Views.  The Geisel School of Medicine at Dartmouth. כאן אנו מדווחים שיטה לשימוש בסוג I וסוג II Δku80 זנים של Toxoplasma gondii כדי לייצר ביעילות מחיקות גן ממוקדת והחלפות גן לאנליזה גנומית תפקודית.

Video: Genetic Manipulation in Δku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with causing food- and water-borne disease outbreaks. The definitive host is the feline species where sexual replication occurs resulting in the development of the highly infectious and environmentally resistant oocyst. Infection occurs via ingestion of tissue cysts from contaminated meat or oocysts from soil or water. Infection is typically asymptomatic in healthy individuals, but results in a life-long latent infection that can reactivate causing toxoplasmic encephalitis and death if the individual becomes immunocompromised. Meat contaminated with T. gondii cysts have been the primary source of infection in Europe and the United States, but recent changes in animal management and husbandry practices and improved food handling and processing procedures have significantly reduced the prevalence of T. gondii cysts in meat1, 2. Nonetheless, seroprevalence in humans remains relatively high suggesting that exposure from oocyst contaminated soil or water is likely. Indeed, waterborne outbreaks of toxoplasmosis have been reported worldwide supporting the theory exposure to the environmental oocyst form poses a significant health risk3-5. To date, research on understanding the prevalence of T. gondii oocysts in the water and environment are limited due to the lack of tools to detect oocysts in the environment 5, 6. This is primarily due to the lack of efficient purification protocols for obtaining large numbers of highly purified T gondii oocysts from infected cats for research purposes. This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation7.

Obtaining Highly Purified Toxoplasma gondii Oocysts by a Discontinuous Cesium Chloride Gradient

This study describes the development of a modified CsCl method that easily purifies T. gondii oocysts from feces of infected cats that are suitable for molecular biological and tissue culture manipulation

קבלת מטוהרים Toxoplasma gondii שביצים ידי Gradient כלוריד רציפה וצזיום

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular protozoan pathogen that commonly infects humans. It is a well characterized apicomplexan associated with ...

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma וול gondii ציסטה כינונה ב הופעל מח עצם הנגזרות המקרופאגים והגבלות Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged antigen-specific T cell receptor (TCR) have been an indispensable tool to study T cell development and function. However, such TCRs are usually isolated from the relevant T cells after long-term culture often following repeated antigen stimulation, which unavoidably selects for T cells with high affinity. Random genomic integration of the TCR &alpha;- and &beta;-chain and expression from non-endogenous promoters can lead to variations in expression level and kinetics.
Epigenetic reprogramming via somatic cell nuclear transfer provides a tool to generate embryonic stem cells and mice from any cell of interest. Consequently, when SCNT is applied to T cells of known specificity, these genetic V(D)J rearrangements are transferred to the SCNT-embryonic stem cells (ESCs) and the mice derived from them, while epigenetic marks are reset. We have demonstrated that T cells with pre-defined specificities against Toxoplasma gondii can be used to generate mouse models that express the specific TCR from their endogenous loci, without experimentally introduced genetic modification. The relative ease and speed with which such transnuclear models can be obtained holds promise for the construction of other disease models.

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

We demonstrate here that epigenetic reprogramming via Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) can be used as a tool to generate mouse models with pre-defined T cell receptor (TCR) specificities. These transnuclear mice express the corresponding TCR from their endogenous locus under the control of the endogenous promoter.

עכברים Transnuclear עם מוגדרים מראש תא קולטן T ספציפיות נגד Toxoplasma gondii לקבל ע&quot;י SCNT

Lymphocytes, such as T cells, undergo genetic V(D)J recombination, to generate a receptor with a certain specificity1. Mice transgenic for a rearranged ...

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat (VNTR) - Fragment Length Analysis (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory. The only sources of the bacteria are leprosy patients, and experimentally infected armadillos and nude mice. Thus, many of the methods used in modern epidemiology are not available for the study of leprosy. Despite an extensive global drug treatment program for leprosy implemented by the WHO1, leprosy remains endemic in many countries with approximately 250,000 new cases each year.2 The entire M. leprae genome has been mapped3,4 and many loci have been identified that have repeated segments of 2 or more base pairs (called micro- and minisatellites).5 Clinical strains of M. leprae may vary in the number of tandem repeated segments (short tandem repeats, STR) at many of these loci.5,6,7 Variable number tandem repeat (VNTR)5 analysis has been used to distinguish different strains of the leprosy bacilli. Some of the loci appear to be more stable than others, showing less variation in repeat numbers, while others seem to change more rapidly, sometimes in the same patient. While the variability of certain VNTRs has brought up questions regarding their suitability for strain typing7,8,9, the emerging data suggest that analyzing multiple loci, which are diverse in their stability, can be used as a valuable epidemiological tool. Multiple locus VNTR analysis (MLVA)10 has been used to study leprosy evolution and transmission in several countries including China11,12, Malawi8, the Philippines10,13, and Brazil14. MLVA involves multiple steps. First, bacterial DNA is extracted along with host tissue DNA from clinical biopsies or slit skin smears (SSS).10 The desired loci are then amplified from the extracted DNA via polymerase chain reaction (PCR). Fluorescently-labeled primers for 4-5 different loci are used per reaction, with 18 loci being amplified in a total of four reactions.10 The PCR products may be subjected to agarose gel electrophoresis to verify the presence of the desired DNA segments, and then submitted for fluorescent fragment length analysis (FLA) using capillary electrophoresis. DNA from armadillo passaged bacteria with a known number of repeat copies for each locus is used as a positive control. The FLA chromatograms are then examined using Peak Scanner software and fragment length is converted to number of VNTR copies (allele). Finally, the VNTR haplotypes are analyzed for patterns, and when combined with patient clinical data can be used to track distribution of strain types.

DNA Fingerprinting of Mycobacterium leprae Strains Using Variable Number Tandem Repeat VNTR - Fragment Length Analysis FLA

Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, is still endemic in many places. In order to learn about the spread and mode of transmission of leprosy, it is important to determine which strain of M. leprae has infected a patient. Variable numbers of tandem repeats (VNTR) typing is one such method.

טביעת אצבעות של DNA Mycobacterium leprae מתחים באמצעות מספר משתנה טנדם חזור (VNTR) - אורך ניתוח שבר (FLA)

The study of the transmission of leprosy is particularly difficult since the causative agent, Mycobacterium leprae, cannot be cultured in the laboratory.  ...

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth defects upon congenital infection. The lytic replication cycle is characterized by three stages: 1. active invasion of a nucleated host cell; 2. replication inside the host cell; 3. active egress from the host cell. The mechanism of egress is increasingly being appreciated as a unique, highly regulated process, which is still poorly understood at the molecular level. The signaling pathways underlying egress have been characterized through the use of pharmacological agents acting on different aspects of the pathways1-5. As such, several independent triggers of egress have been identified which all converge on the release of intracellular Ca2+, a signal that is also critical for host cell invasion6-8. This insight informed a candidate gene approach which led to the identification of plant like calcium dependent protein kinase (CDPK) involved in egress9. In addition, several recent breakthroughs in understanding egress have been made using (chemical) genetic approaches10-12. To combine the wealth of pharmacological information with the increasing genetic accessibility of Toxoplasma we recently established a screen permitting the enrichment for parasite mutants with a defect in host cell egress13. Although chemical mutagenesis using N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) or ethyl methanesulfonate (EMS) has been used for decades in the study of Toxoplasma biology11,14,15, only recently has genetic mapping of mutations underlying the phenotypes become routine16-18. Furthermore, by generating temperature-sensitive mutants, essential processes can be dissected and the underlying genes directly identified. These mutants behave as wild-type under the permissive temperature (35 &deg;C), but fail to proliferate at the restrictive temperature (40 &deg;C) as a result of the mutation in question. Here we illustrate a new phenotypic screening method to isolate mutants with a temperature-sensitive egress phenotype13. The challenge for egress screens is to separate egressed from non-egressed parasites, which is complicated by fast re-invasion and general stickiness of the parasites to host cells. A previously established egress screen was based on a cumbersome series of biotinylation steps to separate intracellular from extracellular parasites11. This method also did not generate conditional mutants resulting in weak phenotypes. The method described here overcomes the strong attachment of egressing parasites by including a glycan competitor, dextran sulfate (DS), that prevents parasites from sticking to the host cell19. Moreover, extracellular parasites are specifically killed off by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), which leaves intracellular parasites unharmed20. Therefore, with a new phenotypic screen to specifically isolate parasite mutants with defects in induced egress, the power of genetics can now be fully deployed to unravel the molecular mechanisms underlying host cell egress.

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Forward genetics is a powerful method to unravel the molecular level of how Toxoplasma egresses from its host cell. Protocols are provided to chemically mutagenize parasites, enrich for mutants with defects in induced egress, and validate the phenotype of cloned mutants.

מסך גנטית לבודד Toxoplasma gondii מארח תאים יציאה מוטציות

The widespread, obligate intracellular, protozoan parasite Toxoplasma gondii causes opportunistic disease in immuno-compromised patients and causes birth ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

גישות גנטיות בקדימה<em&gt; כלמידיה trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

בעקבות בזמן אמת השפעת גורמי דלקת ריאות ארסיים בעכבר דלקת ריאות דגם אקוטי באמצעות חיידקי Bioluminescent

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within virtually any warm blooded vertebrate cell type. During parasite invasion of a host cell, the parasite creates a parasitophorous vacuole (PV) that originates from the host cell membrane independent of phagocytosis within which the parasite replicates. While IFN-dependent-innate and cell mediated immunity is important for eventual control of infection, innate immune cells, including neutrophils, monocytes and dendritic cells, can also serve as vehicles for systemic dissemination of the parasite early in infection. An approach is described that utilizes the host innate immune response, in this case macrophages, in a forward genetic screen to identify parasite mutants with a fitness defect in infected macrophages following activation but normal invasion and replication in na&#239;ve macrophages. Thus, the screen isolates parasite mutants that have a specific defect in their ability to resist the effects of macrophage activation. The paper describes two broad phenotypes of mutant parasites following activation of infected macrophages: parasite stasis versus parasite degradation, often in amorphous vacuoles. The parasite mutants are then analyzed to identify the responsible parasite genes specifically important for resistance to induced mediators of cell autonomous immunity. The paper presents a general approach for the forward genetics screen that, in theory, can be modified to target parasite genes important for resistance to specific antimicrobial mediators. It also describes an approach to evaluate the specific macrophage antimicrobial mediators to which the parasite mutant is susceptible. Activation of infected macrophages can also promote parasite differentiation from the tachyzoite to bradyzoite stage that maintains chronic infection. Therefore, methodology is presented to evaluate the importance of the identified parasite gene to establishment of chronic infection.

Forward Genetics Screens Using Macrophages to Identify Toxoplasma gondii Genes Important for Resistance to IFN-&#947;-Dependent Cell Autonomous Immunity

Forward genetics is a powerful approach to identify genes in intracellular pathogens important for resistance to cell autonomous immunity. The current approach uses innate immune cells, specifically macrophages, to identify novel Toxoplasma gondii genes important for immune evasion.

קדימה גנטיקה מסכי שימוש המקרופאגים לזיהוי<em&gt; Toxoplasma gondii</emחסינות אוטונומית נייד להתנגדות לIFN-γ-Dependent&gt; גנים חשובים

Toxoplasma gondii, the causative agent of toxoplasmosis, is an obligate intracellular protozoan pathogen. The parasite invades and replicates within ...