<p class="jove_content"&gt; אנו מודים Nadeshda וולף, נאדין Eschen וסוזאנה דלונג עבור בעלי חיים מעולה. CW נתמך על ידי המלגה לתואר שלישי מתוך תוכנית הלמהולץ &quot;<em&gt; BioInterfaces</em&gt; הבינלאומי בוגר בית הספר &quot;(BIFIGS). תמיכה נוספת ניתן על ידי מענק KIT-RISC ועל ידי מארי קירי הבינלאומי Reintegration גרנט במסגרת תוכנית 7 הקהילה האירופית Framework (PIRG07-GA-2010-267552) כדי CG. AHS נתמך על ידי BOLD (ביולוגיה של הכבד והתפתחות מחלות הלבלב) - רשת הדרכה מארי קירי ראשוני (238,821). UL נתמך על ידי Dopaminet FP7 (תוכנית המסגרת השביעית) (223,744).</p&gt;

<ol>
	<li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish.">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li><li>Zon, L. I., Peterson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+drug+discovery+in+the+zebrafish.">In vivo drug discovery in the zebrafish.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 4, 35-44 (2005).</li><li>Loynes, C. A., Martin, J. S., Robertson, A., Trushell, D. M., Ingham, P. W., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pivotal+advance:+pharmacological+manipulation+of+inflammation+resolution+during+spontaneously+resolving+tissue+neutrophilia+in+the+zebrafish.">Pivotal advance: pharmacological manipulation of inflammation resolution during spontaneously resolving tissue neutrophilia in the zebrafish.</a> J. Leukoc. Biol. 87, 203-212 (2009).</li><li>Martin, J. S., Renshaw, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+in+vivo+zebrafish+models+to+understand+the+biochemical+basis+of+neutrophilic+respiratory+disease.">Using in vivo zebrafish models to understand the biochemical basis of neutrophilic respiratory disease.</a> Biochem. Soc. Trans. 37, 830-837 (2009).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108, 3976-3978 (2006).</li><li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish.">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).</li><li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo:+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation.">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li><li>D'Alençon, C. A., Peña, O. A., Wittmann, C., Gallardo, V. E., Jones, R. A., Loosli, F., Liebel, U., Grabher, C., Allende, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+chemically+induced+inflammation+assay+in+zebrafish.">A high-throughput chemically induced inflammation assay in zebrafish.</a> BMC Biol. 8, 151 (2010).</li><li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line.">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li><li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sciencenet'+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge.">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li><li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvester':+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources.">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li></ol>

אין ניגוד עניינים הצהיר.

<p class="jove_content"&gt; כאן אנו מציגים אוטומטי לחלוטין תפוקה גבוהה האסטרטגיה ההקרנה מה שמאפשר זיהוי של modulatory החיסון תרכובות בהקשר בעלי חיים שלם. ובכך מאפשר ניטור של תגובה דלקתית חריפה<em&gt; In vivo</em&gt; ובזמן אמת.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנו מספקים פרוטוקול ליישם דג הזברה כאורגניזם מודל בעל ערך עבור גילוי תרופות או סמים המאמצים repurposing, שכן השפעות התרופה על גיוס ליקוציט על הפצעים ניתן ללמוד בקלות יחסית בהקשר של המערכת מתפקדת במלואה החיסון המולדת. היתרון הייחודי של הגישה שלנו היא העובדה כי הפציעה כימי הופך מניפולציה הזחלים ידנית מיושן, ולכן התרת אוטומציה הקרנה בפורמט תפוקה גבוהה.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; בנוסף, תופעות לוואי או רעילים, כמו גם חזקות מחוץ היעד אפקטים ניתן להעריך בקלות עם הצעת הגדרת. ספריית ה-FDA אישר זאת לא מכיל חומרים רעילים בכל הריכוזים ההקרנה נתון. עם זאת, אנו מציעים עבור תרכובות רעילות לכאורה להשוות את מערך הנתונים זמינים (למשל modulatory פנוטיפ החיסונית, ריכוז התרופה) בין חברי הנוכחי חומר תרופתי באותו מעמד בספרייה נבדק. חברי הרעילות של המשפחה החומר, כי אחרת מפעילה פנוטיפ מבטיח modulatory החיסונית, יכול להערכה מחדש בריכוזים נמוכים יותר, אם יהיה צורך.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; אנחנו הוכיחו את האפשרות של תרופות לסווג באופן אוטומטי על פי אפקט המופעל modulatory המערכת החיסונית שלהם. תרופות השייכות לקטגוריה של תרכובות נוגדות דלקת לא ניתן תוקף ניסויים עצמאיים, ברוב של תרכובות הפעלת השפעתם באופן תלויה במינון. ארבעה מתחמים המזוהים כפרו ברזולוציה תרופות פוטנציאליות היה עד כה לא יאושר בהתאם. כמו כן, עולה כי זו קטגוריה מסוימת modulatory החיסונית קשה לתאר, שכן לא רק תרופות המשפיעות על ההחלטה עד כה תוארו בספרות. עם זאת, 3 מ -4 תרופות להערכה מחדש הראו מגמה אנטי דלקתי בריכוזים גבוהים יותר טוחנת. אופטימיזציה של הקריטריונים הסף שהוגדרו אמפירית צריך לעזור להפחית את מספר תוצאות חיוביות שגויות.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; כמו כן, הציג את הטכניקה מציעה את האפשרות להיות מנוצל לזיהוי של מוטציות בגנים המשפיעים על התנהגות הנדידה ליקוציט<sup&gt; 8</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; סיכום, השיטה המוצעת יכולה להקל ולהאיץ את גילוי תרופות או סמים repurposing מאמצי מניב פוטנציאליים מבנים להוביל חדשים עם מידע זמין ונגיש על סובלנות סמים, רעילות, המינון, כמו גם פוטנציאל מחוץ היעד אפקטים. לכן, כיהן אסטרטגיה, פשוט העלות והזמן חיסכון בשלבים הראשונים של פיתוח התרופה.</p

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> דימתיל sulphoxide </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td> (II) נחושת סולפט נטול מים </td><td> קרל רוט GmbH &amp; Co KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> ה-FDA אישר תרופה הספריה </td><td> אנזו מדעי החיים </td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384 microwell צלחת בלתי מחייב, μClear </td><td> גריינר </td><td> 781906 </td><td> שחור </td></tr><tr><td> אולימפוס סריקה ^ R </td><td> אולימפוס </td><td></td><td></td></tr><tr><td> צפריר נוזלי קומפקטי טיפול Workstation </td><td> Caliper </td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

facilitating drug discovery: an automated high-content inflammation assay in zebrafish

הזחלים דג הזברה הם נוחים במיוחד בעל חיים כל מולקולה קטנה מסכי 1,2 בשל גודלם הקטן והקלות היחסית של מניפולציה תצפית, כמו גם את העובדה כי תרכובות יכול פשוט להוסיף מים לרחצה נספגים בקלות כאשר מנוהל &lt;1% DMSO פתרון. בשל בהירות אופטית של הזחלים דג הזברה ואת הזמינות של קווי מהונדס המבטאים חלבונים ניאון leukocytes, דג הזברה להציע את היתרון הייחודי של ניטור תגובה דלקתית חריפה in vivo. כתוצאה מכך, ניצול דג הזברה גבוהה תוכן מסכי מולקולה קטנה שמטרתן זיהוי של modulatory החיסון תרכובות עם קצב העברת נתונים גבוה הוצע 3-6, דבר המצביע על אינדוקציה תרחישים דלקת כגון חתכים מקומיים ברקמת הסנפיר, נזק לייזר מכוונת אל פני השטח של חלמון עוברים 7 או קטיעה הסנפיר 3,5,6. החיסרון העיקרי של שיטות אלו עם זאת היההדרישה של מניפולציה הזחל ידנית על מנת לגרום לפציעה, ובכך למנוע תפוקה גבוהה ההקרנה. מבוא של דלקת הנגרמת כימית (סנטר) assay 8 בוטלו המכשולים הללו. מאז הפציעה נגרם באופן כימי את מספר העוברים, כי ניתן לטפל בעת ובעונה אחת הוא כמעט בלתי מוגבל. טיפול זמני של הזחלים דג הזברה עם נחושת סלקטיבי גורם מוות של תאים בתאי השיער של מערכת קו לרוחב והתוצאות בגיוס granulocyte מהירה neuromasts פצועים. התגובה הדלקתית ניתן בעקבות בזמן אמת באמצעות תרכובת מהונדס cldnB :: GFP / lysC :: DsRED2 6,9 הזחלים דג הזברה המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק בתאים neuromast, כמו גם כמה אדומים ניאון תיוג גרנולוציטים חלבון. על מנת לגבש אסטרטגיה ההקרנה שיאפשר שני ניתוחים גבוהה תוכן תפוקה גבוהה הצגנו טיפול הנוזל רובוטית ו MICR אוטומטי משולבoscopy עם סקריפט תוכנות מותאמות אישית מפותחת. סקריפט זה מאפשר כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית על ידי הבקיע את השטח הכבוש על ידי אחוז leukocytes ניאון אדומים בתוך שטח מוגדר באופן אמפירי סביב הפצועים neuromasts ניאון ירוקים. יתר על כן, אנו עיבוד נתונים אוטומטי, טיפול, דמיון מודרך, אחסון מבוססים על מותאם אישית שפותחה MATLAB ו הסקריפטים פייתון. בקיצור, אנחנו מציגים את המסך אוטומטית HC / HT המאפשר בדיקה של תרכובות כימיות עבור השפעתם על התפתחות ייזום, או ברזולוציה של תגובה דלקתית granulocytic. פרוטוקול זה משמש נקודת פתיחה טובה ניתוחים מעמיקים יותר של מנגנוני סמים המסלולים המעורבים תזמור תגובת החיסון המולדת. בעתיד, הוא עשוי לסייע בזיהוי ההשפעות הרעילות או מטרה מחוץ בלתי נסבלים בשלבים המוקדמים של גילוי תרופות ועל ידי כך להפחית את הסיכונים פרוצדורליים ועלויות לפיתוח התרופה.

Watch this Scientific Journal Video about Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish at JoVE.com

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

כאן אנו מתארים assay הרומן גבוהה תוכן דלקת הנגרמת כימית מכוון לזיהוי modulatory החיסון bioactives. יש לנו שילוב בהצלחה מיקרוסקופ עם אוטומטיות מותאמות אישית סקריפטים תוכנה שפותחו המאפשרים כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית כמו גם עוד עיבוד נתונים, ניתוח, כרייה, ואחסון.

גילוי תרופות בהנחיית: Assay אוטומטי גבוהים תוכן דלקת דג הזברה

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.1K Views.  Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany. כאן אנו מתארים assay הרומן גבוהה תוכן דלקת הנגרמת כימית מכוון לזיהוי modulatory החיסון bioactives. יש לנו שילוב בהצלחה מיקרוסקופ עם אוטומטיות מותאמות אישית סקריפטים תוכנה שפותחו המאפשרים כימות אוטומטי של התגובה הדלקתית כמו גם עוד עיבוד נתונים, ניתוח, כרייה, ואחסון.

Video: Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Assays for the Identification of Novel Antivirals against Bluetongue Virus

To identify potential antivirals against BTV, we have developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based assay was the first assay developed to evaluate whether a compound showed any antiviral efficacy and have been used to screen large compound library. Meanwhile, cytotoxicity of antivirals could also be evaluated using the CPE-based assay. The dose-response assay was designed to determine the range of efficacy for the selected antiviral, i.e. 50% inhibitory concentration (IC50) or effective concentration (EC50), as well as its range of cytotoxicity (CC50). The ToA assay was employed for the initial MoA study to determine the underlying mechanism of the novel antivirals during BTV viral lifecycle or the possible effect on host cellular machinery. These assays are vital for the evaluation of antiviral efficacy in cell culture system, and have been used for our recent researches leading to the identification of a number of novel antivirals against BTV.

Three assays, including the cytopathic effect (CPE)-based assay, dose-response assay and Time-of-Addition (ToA) assay have been developed, optimized, validated and utilized to identify novel antivirals against Bluetongue virus (BTV), as well as to determine the possible Mechanism-of-Action (MoA) for newly identified antivirals.

מבחני לזיהוי של antivirals הרומן נגד וירוס Bluetongue

To identify potential antivirals against BTV, we have  developed, optimized and validated three assays presented here. The CPE-based  assay was the first ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

דור והקרנה גבוהה תוכן רב-פנוטיפי של<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; מוטאנטים טרנספוזון

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

An Optimized Method for Isolating and Expanding Invariant Natural Killer T Cells from Mouse Spleen

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells are therefore characterized as an innate T cell population capable of activating and steering adaptive immune responses. The development of improved techniques for the culture and expansion of murine iNKT cells facilitates the study of iNKT cell biology in in vitro and in vivo model systems. Here we describe an optimized procedure for the isolation and expansion of murine splenic iNKT cells.
Spleens from C57Bl/6 mice are removed, dissected and strained and the resulting cellular suspension is layered over density gradient media. Following centrifugation, splenic mononuclear cells (MNCs) are collected and CD5-positive (CD5+) lymphocytes are enriched for using magnetic beads. iNKT cells within the CD5+ fraction are subsequently stained with &#945;GalCer-loaded CD1d tetramer and purified by fluorescence activated cell sorting (FACS). FACS sorted iNKT cells are then initially cultured in vitro using a combination of recombinant murine cytokines and plate-bound T cell receptor (TCR) stimuli before being expanded in the presence of murine recombinant IL-7. Using this technique, approximately 108 iNKT cells can be generated within 18-20 days of culture, after which they can be used for functional assays in vitro, or for in vivo transfer experiments in mice.

Here we present an adapted protocol that can be used to generate a large number of murine invariant natural killer T cells from mouse spleen. The protocol outlines an approach by which splenic iNKT cells can be enriched for, isolated and expanded in vitro using a limited number of animals and reagents.

שיטה אופטימלית עבור בידוד והרחבת תאי Invariant הטבעי רוצח T מטחול העכבר

The ability to rapidly secrete cytokines upon stimulation is a functional characteristic of the invariant natural killer T (iNKT) cell lineage. iNKT cells ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the uremic milieu, oxidative stress, endotoxemia and the decreased clearance of circulating proinflammatory cytokines by producing a large number of acute-phase reactants. Experimental tools to study inflammation and the underlying role of hepatocytes are crucial to understand the regulation and contribution of hepatic cytokines to a systemic acute phase response and a prolonged pro-inflammatory scenario, especially in an intricate setting such as chronic kidney disease. Since studying complex mechanisms of inflammation in vivo remains challenging, resource-intensive and usually requires the usage of transgenic animals, primary isolated hepatocytes provide a robust tool to gain mechanistic insights into the hepatic acute-phase response. Since this in vitro technique features moderate costs, high reproducibility and common technical knowledge, primary isolated hepatocytes can also be easily used as a screening approach. Here, we describe an enzymatic-based method to isolate primary murine hepatocytes, and we describe the assessment of an inflammatory response in these cells using ELISA and quantitative real-time PCR.

Here, we show an enzymatic approach to isolate primary hepatocytes from adult mice, and we describe the quantification of an inflammatory response using ELISA and real-time PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

ויזואליזציה של ביופילמים ב קנדידה אלביקנס שימוש בהתקן Microfluidic אוטומטי

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...