עבודה זו מומנה בחלקה על ידי משרד האנרגיה האמריקני Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE משרד המדע BER DE-FC02-07ER64494) ולהעניק DE-FG02-91ER200021 ממשרד האנרגיה של ארה&quot;ב, משרד האנרגיה של יסוד מדעי, אגף של מדעי הכימיה, Geosciences ו Biosciences. אנו מודים ג&#39;ון סקוט קרייג ומליסה Borrusch חומר שלהם תרומות מושגית.

1. אנזימים הפקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצר חלבונים pastoris Pichia על ידי שיבוט של הגנים המתאימים לתוך וקטורים pPICZ או pPICZα ו והפיכתו פ pastoris. לגדל תאים של 300 מ&quot;ל קבוצות ב -500 מ&quot;ל צלוחיות מבולבל עם אינדוקציה מתנול בכל שעה 24 (Banerjee et al. 2010a). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתרכז desalt filtrates תרבות על ידי סינון תזרים משיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות אנזימים aliquots קטן גליצרול 20% ב -80 ° C. טווח הריכוז הוא 10-10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li></ol> 2. עיצוב של ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספר קלט של אנזימים להיבדק, והעליון שלהם בפרופורציות נמוכות (למשל שיעור נמוך יותר של 5% עבור אנזימים הליבה), ואת סוג של תכנון הניסוי (למשל, ריבועית או מעוקב) לתוך Design-Expertsoftware. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את הסכום מיקרוגרם של אנזים זה יתווספו לבצע העמסה הכולל של גלוקן מ&quot;ג / g 15, ולאחר מכן לחשב את כמות האנזים כל μl להוסיףכל תגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת גליונות עבודה של Excel labware ציון מקור, מקור בארות, labware היעד, בארות היעד כרכים העברה מחלק מים ואנזימים על פי תכנון ניסויי ולייבא אותו לתוך התוכנה Biomek FXP באמצעות פונקציית העברה מ-file. </li></ol> 3. אנזימתי הידרוליזה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את slurry ביומסה ציטראט 50 מ&quot;מ נתרן, pH 4.8, המכיל 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו טטרציקלין 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​cycloheximide, במאגר ההנעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רובוט 200 pipet μl של slurry לתוך היטב כל אחד 96-באר עמוקה, גם באמצעות צלחות התגובה Span-1000-8 μl טיפים pipet עם 0.5 ס&quot;מ האחרונה מנותקת. מערבבים את slurry פעם μl 100 / sec ואז לשאוב באותו נפח ממאגר ההנעה ולחלק לתוך הצלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחלקים את האנזימים לתוך צלחת אותו באמצעות התוכנית נכנסה המט&quot;ח Beckman. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את הצלחות עם capmats לנקבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך והקשהצלחות מספר פעמים להתגבר על מתח הפנים. מקמי את הצלחות על 50 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות את ההכלאה חממה מסתובב בסל&quot;ד 10. </li></ol> 4. קביעת Glc ו Xyl <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צלחות התגובה דקות 3 XG ב 1250 בצנטריפוגה דלי מתנדנד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של supernatant לתוך צלחות 96-היטב קבוע באמצעות תרמיל AP96 של FX Biomek. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 90-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על מנת להשבית את האנזימים, ולאחר מכן צנטריפוגות XG ב 1250 למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות Glc, להעביר 12 μl של supernatants לתוך 96-היטב צלחות קבוע. הוסף 192 μl של מגיב מונואמין / peroxidase (GOPOD) גלוקוז. דגירה צלחות ב 50 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות ולקרוא את absorbances ב 510 ננומטר קורא microplate. בלנק הוא תערובת התגובה עם האנזים לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מדידות Xyl, להעביר 4 ​​μl לתוך 384 גם הצלחות. מוסיפים את ריאגנטים assay ולקרוא את הצלחות ב 340 ננומטר. ריקהוא תערובת התגובה עם האנזים לא. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המר את ערכי ספיגת ל% Glc שלהם תשואות Xyl מבוסס על Glc ידוע תוכן Xyl של ביומסה המקורי. ייבוא ​​אלה אחוזי כתגובות לתוך תוכנת עיצוב-המומחה. בדוק את paramenters סטטיסטי כדי להיות בטוח כי הקריטריונים מודל החזקה מתקיימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר את חיזוי המודל הטוב ביותר בניסוי. </li></ol> 6. תוצאות עם נציג GENPLAT: (1) יצירה של תערובות אופטימיזציה של חלבונים טהורים בודדים. תוצאות המחקר מראות אשר אנזימים חשובים, ובאיזה פרופורציות, וגם אנזימים אשר אינם חשובים. כמה חלבונים בשפע ט reesei secretome (Nagendran et al., 2009), כגון Cip1 ו Cip2, להופיע לשחק שום תפקיד Glc שחרור Stover תירס pretreated על ידי הרחבת אמוניה סיבים (AFEX) או hyd אלקליין<html> רוגן חמצן (AHP) (Banerjee et al. 2010b). מצד שני, כמה חלבונים חשובים באופן בלתי צפוי. לדוגמה, אנדו, xylanases משפחות Hydrolase Glycosyl 10 ו -11 הן חשובות עבור Glc שחרור, אחד xylanase לא יכולה להוות תחליף אחר (Banerjee et al, 2010b, ג.). Cel61A, חלבון קטין ט reesei secretome, חשוב מאוד Glc אך לא Xyl לשחרר. כמה אנזימים חשובים עבור שחרורו של שניהם Glc ו Xyl, בעוד שאחרים נדרשים רק עבור זה או אחר (Banerjee et al. 2010c). תערובת סינתטי המכיל 16 מרכיבים, שכל אחד מהם בריכוז של 0.94 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(כלומר, תערובת לא אופטימלית), שוחררו 38% Glc זמינים AFEX-pretreated DDG. הידרוליזה בתנאים זהים, תערובת אופטימלית, שבה ריכוזים של 16 רכיבים נע בין 0% ל -32%, שוחררו 52% Glc (איור 2). ניסוי זה ממחיש את התועלת של בניית תערובות מוגדרות. _content &quot;&gt; (2) יצירה של קוקטיילים אופטימיזציה עבור המקדים שונות / שילובים המצע. נוכחי ההכנות cellulase מסחריים הם&quot; אחד בגודל-fits-all &quot;. במציאות, קוקטייל הטובה ביותר תלויה המצע והן המקדים. מוצר יחיד כמו Accellerase 1000 נותן תשואות שונה מצעים שונים pretreated באותה הדרך, ומן המצע אותו חשוף pretreatments שונות (איור 1). השתמשנו GENPLAT כדי לייעל את תערובות של אנזימים טהור pretreatments מרובים feedstocks mutiple (Banerjee et al. 2010c). איור 2 מראה כיצד הפרופורציות האנזים אופטימלי של 16 אנזימים טהור שונה עבור AFEX-pretreated Stover תירס, AHP-pretreated Stover תירס, ו-AFEX pretreated DDG. רק 11 אנזימים מוצגות באיור 2. כיוון אופטימלי הפרופורציות של חמישה אחרים (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 ו Cel12A) נמצאו 0% (Banerjee et al. 2010c). (3) באנזים רומן הגילוי </strאונג&gt;. בניית תערובות אופטימיזציה של חלבונים טהורים הוא תהליך מתמשך. כמו חלבונים חדשים הופכים לזמינים בצורה הטהורה (ממקורות מסחריים, על ידי ביטוי Heterologous, או על ידי טיהור), הם יכולים להיבדק באופן שיטתי על ידי הוספת אותם כדי להגדיר את אופטימלית הנוכחית. חלבונים רומן שתורמים Glc Xyl או לשחרר ואז הופכים לחלק סט חדש, מותאם. בדרך זו, GENPLAT הופכת פלטפורמה לזיהוי של אנזימים חדשים הדקונסטרוקציה ביומסה. עשינו תמציות של פטריות אחר מאשר ט &#39; reesei וא ניז&#39;ר ​​גדלו על מצעים שונים. אחת לחלץ מסוים שיפרה תשואה Glc כאשר הוסיף להגדיר הליבה שלנו. חלבון זה אחראי היה מטוהרים העולם להיות hydrolase glycosyl רומן לא קיים שום הכנה אנזים מסחרי (Banerjee ו וולטון, התוצאות לא פורסם). (4) גילוי אנזימים טוב יותר. הראינו עם GENPLAT אשר אנזימים הם החשובים ביותר של השפלהביומסה מסוימת, יש לנו הבנה טובה יותר של אנזימים אשר צריך להיות המוקד לשיפור. דוגמאות טובות יותר של האנזימים קריטיים ניתן למצוא על ידי חיפוש בטבע או שבוצעו על ידי הנדסת חלבון. (האנזים יכול להיות &quot;טוב יותר&quot; מאשר homolog ט reesei שלה במספר דרכים, בהתאם הנכס הרצוי, פעילות למשל, ספציפיים יותר, סינרגיה גדולה יותר, ירידה ברגישות proteolytic, או יציבות תרמית משופרת). GENPLAT מספק פלטפורמה משמעותית עבור assaying אנזימים פוטנציאל טוב יותר, משום שהוא מנצל קוקטייל מורכב מציאותי (חשוב כי אין אנזים ביומסה עובד בבידוד) ואת מצע ריאליסטי (חשוב כי התוצאות עם תאית טהורה או מצעים מלאכותיים אחרים לא יכול להיות רלוונטי lignocellulosic טבעי חומרים). (5) אנזים מסחרי אופטימיזציה. כמויות גדולות מספיק של אנזימים טהור עדיין לא קיימים בעולם האמיתי. עד שהם עושים, אתנול הפרוducers להסתמך על מוצרים מסחריים כגון Accellerase 1000 ו MultifectXylanase. עם זאת, תערובות של אנזימים מסחריים בדרך כלל ביצועים טובים יותר מכל אדם אחד, ו GENPLAT ניתן להשתמש כדי לעצב קוקטיילים אופטימיזציה של אנזימים מסחרי מרובים. איור 3 מציג את השימוש GENPLAT כדי לייעל תערובת של ארבעה ההכנות אנזים מסחרי. הפרופורציות האופטימלי עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated DDG נמצאו 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, ו -4% Multifect Xylanase (Banerjee et al. 2010c). איור 3 ב מציג את ההבדלים בתשואה Glc מ AFEX-DDG עם ארבעה ההכנות אנזים; את התערובת מסחרי מותאם נותן תשואה גבוהה יותר מאשר Glc Accellerase1000 לבד, SpezymeCP בלבד, או תערובת 16-מרכיב סינתטי. ניסוי זה גם מציין כי את התערובת 16-מרכיב סינתטי חסר אחד או יותר האנזימים הדרושים אופטימלי Glc שחרור, אשר נמצאים אחד או יותר של האנזימים מסחרי. GENPLAT ניתן לנועורך לזהות מרכיבים כאלה. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. ללא הכנה יחיד אנזים מסחרי הוא אופטימלי עבור כל מצעים וכל pretreatments. חמש מצעים ושלושה pretreatments הושוו בתנאים דומים של שחיקה (החלקיקים בגודל 0.5 מ&quot;מ), טוען האנזים (15 מ&quot;ג / g גלוקן), ותנאי הידרוליזה (48 שעות, 50 ° C). A. עיכול של AFEX-pretreated מצעים שונים עם Accellerase 1000. עיכול ב &#39;של Stover תירס pretreated על ידי שלוש שיטות שונות עם Accellerase 1000 (ראה בנרג&#39;י et al. 2010c). <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig2.jpg" alt="איור 2"/> באיור 2. הפרופורציות אופטימלית של 11 אנזימים עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated Stover תירס (AFEX-CS), אלקליין חמצן, מימן pretreated Stover תירס (AHP-CS), או AFEX-pretreated יבשים לזקקERS &quot;דגנים (AFEX-DDG). הנתונים הם מתוך בנרג&#39;י et al. (2010c). מספרים לאורך החלק העליון של הסורגים הם התשואות Glc כאחוז מסך Glc במדגם ביומסה. <img src="/files/ftp_upload/3314/3314fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3 א. השימוש GENPLAT לייצר תערובת אופטימלית של ארבעה ההכנות אנזים מסחרי עבור שחרורו של Glc מ AFEX-pretreated DDG. Multifect Xylanase עשה את התרומה הקטנה ביותר (4%) ו - הושמט ולכן מן התרשים הזה משולשת. התשואות ב Glc מ AFEX-DDG עם טיפולים אנזים שונה בתנאים זהים הידרוליזה (15 מ&quot;ג / g אנזים גלוקן, 48 שעות, 50 ° C) . &quot;ארבע מרכיב מסחרי&quot; יש את הפרופורציות נקבע מהניסוי באיור. 3A.

<ol>
	<li>Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. , (2007).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+enzyme+mixtures+for+biomass+deconstruction:+production+and+optimization+of+a+core+set.">Synthetic enzyme mixtures for biomass deconstruction: production and optimization of a core set.</a> Biotechnol. Bioengineer. 106, 707-720 (2010).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Bongers, M., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+multi-component+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+lignocellulosic+biomass.">Synthetic multi-component enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass.</a> Bioresour. Technol. 101, 9097-9105 (2010).</li><li>Banerjee, G., Car, S., Scott-Craig, J. S., Borrusch, M. S., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+optimization+of+enzyme+mixtures+for+deconstruction+of+diverse+pretreatment/biomass+feedstock+combinations.">Rapid optimization of enzyme mixtures for deconstruction of diverse pretreatment/biomass feedstock combinations.</a> Biotechnol. Biofuels. 3, 22-22 (2010).</li><li>Berlin, A., Maximenko, V., Gilkes, N., Saddler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+enzyme+complexes+for+lignocellulose+hydrolysis.">Optimization of enzyme complexes for lignocellulose hydrolysis.</a> Biotechnol. Bioeng. 97, 287-296 (2007).</li><li>Decker, S. R., Brunecky, R., Tucker, M. P., Himmel, M. E., Selig, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+throughput+screening+techniques+for+biomass+conversion.">High throughput screening techniques for biomass conversion.</a> Bioenerg. Res. 2, 179-192 (2009).</li><li>Gao, D., Chundawat, S. P., Krishnan, C., Balan, V., Dale, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixture+optimization+of+six+core+glycosyl+hydrolases+for+maximizing+saccharification+of+ammonia+fiber+expansion+(AFEX)+pretreated+corn+stover.">Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover.</a> Bioresour. Technol. 101, 2770-2781 (2010).</li><li>Harris, P. V., Welner, D., McFarland, K. C., Re, E., Poulsen, J. C. N., Brown, K., Salbo, R., Ding, H., Vlasenko, E., Merino, S., Xu, F., Cherry, J., Larsen, S. Y., LoLeggio, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+lignocellulosic+biomass+hydrolysis+by+proteins+of+glycoside+hydrolase+family+61:+Structure+and+function+of+a+large,+enigmatic+family.">Stimulation of lignocellulosic biomass hydrolysis by proteins of glycoside hydrolase family 61: Structure and function of a large, enigmatic family.</a> Biochemistry. 49, 3305-3316 (2010).</li><li>Kim, E., Irwin, D. C., Walker, L. P., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factorial+optimization+of+a+six-cellulase+mixture.">Factorial optimization of a six-cellulase mixture.</a> Biotechnol. Bioeng. 58, 494-501 (1998).</li><li>King, B. C., Donnelly, M. K., Bergstrom, G. C., Walker, L. P., Gibson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+microplate+assay+system+for+quantitative+evaluation+of+plant+cell+wall-degrading+enzyme+activity+of+fungal+culture+extracts.">An optimized microplate assay system for quantitative evaluation of plant cell wall-degrading enzyme activity of fungal culture extracts.</a> Biotechnol. Bioeng. 102, 1033-1044 (2009).</li><li>Nagendran, S., Hallen-Adams, H. E., Paper, J. M., Aslam, N., Walton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+genomic+potential+for+secreted+plant+cell-wall-degrading+enzymes+in+the+ectomycorrhizal+fungus+Amanita+bisporigera,+based+on+the+secretome+of+Trichoderma+reesei.">Reduced genomic potential for secreted plant cell-wall-degrading enzymes in the ectomycorrhizal fungus Amanita bisporigera, based on the secretome of Trichoderma reesei.</a> Fung. Genet. Biol. 46, 427-435 (2009).</li><li>Rosgaard, L., Pedersen, S., Langston, J., Akerhielm, D., Cherry, J. R., Meyer, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+minimal+Trichoderma+reesei+cellulase+mixtures+on+differently+pretreated+barley+straw+substrates.">Evaluation of minimal Trichoderma reesei cellulase mixtures on differently pretreated barley straw substrates.</a> Biotechnol. Prog. 23, 1270-1276 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הוא זוכה להכרה רחבה, כי הפחתת העלות של אנזימים חשוב בהתפתחות של תעשיית האתנול חסכוני lignocellulosic. כרגע זמין קוקטיילים אנזים מסחריות הן תערובות מורכבות מוגדרת היטב של חלבונים רבים (Nagendran et al., 2009), והם מותאמים בעיקר לשימוש על חומצה pretreated Stover תירס. על מנת להאיץ את הפיתוח של קוקטיילים אנזים טוב יותר, מעבדות כמה פיתחו תפוקה גבוהה פלטפורמות גילוי האנזים ואפיון. המאמצים בתחום זה שילבו אחד או יותר מהמאפיינים הבאים נמצא גם GENPLAT: מחלק הרובוטית של אנזימים slurries ביומסה, עיצוב הסטטיסטית של הניסוי, ו / או קביעה אוטומטית של Glc ו Xyl (ברלין et al, 2007; דקר et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT מרחיב את המאמצים האלה מוקדם יותר, באופן משמעותי ביותר את המורכבות של תערובות האנזים כי ניתן לנתח מן היותר 6 רכיביםמחקרים קודמים יותר מ 16 בעבודה האחרונה שלנו (Banerjee et al. 2010c). תכונות עיקריות נוספות של GENPLAT הן את השימוש של חדר ערבוב חרוז (מאגר ההנעה) שיכולה לשמור slurries סטובר הושעה במהלך מחלק; ערבוב עדין במהלך העיכול על ידי סיבוב קצה מעל הקצה; ונחישות colorimetric אוטומטי של Glu ו Xyl.

ציוד ותוכנה בשימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב, מומחה התוכנה, גרסה 8.0 (Stat-קלות, Inc, מיניאפוליס, מינסוטה) ( <a href="http://www.statease.com">http://www.statease.com</a> ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biomek FXP מעבדה אוטומציה תחנת עבודה (Beckman-קולטר, Fullerton, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biomek FXP התוכנה, גרסה 3.3 (Beckman-קולטר, Fullerton, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוט המאגר (דגם VP-756C 1P100, V &amp; P מדעי בע&quot;מ, סן דייגו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות, 96-עמוק (1.5 מ&quot;ל) גם (Abgene, פישר סיינטיפיק, Epson, בריטניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Capmats לנקבה (ארה&quot;ב מדעי, אוקלה, פלורידה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיבוב הכלאה חממה (דגם 5420, VWR) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Swinging-דלי צנטריפוגה (דגם 5810R, Eppendorf, המבורג, גרמניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות, שחקן המשנה 96-היטב (Abgene, פישר סיינטיפיק, Epson, בריטניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות, 384-היטב (BD פלקון, BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) </li></ol> ריאגנטים בשימוש: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pichia pastoris ו וקטורים: זן X33, ו pPICZ ו pPICZα (Invitrogen, Carlsbad, CA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ט &#39;ו reesei וקטורים: זן QM9414 (משרד החקלאות של ארה&quot;ב המרכז הלאומי לחקר ניצול חקלאי, Peoria, IL) ו pCB1004-EV (Banerjee et al, 2010b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Accellerase 1000 (מספר רב 1600844643) (Genencor, Inc, רוצ&#39;סטר, ניו יורק) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 סודיום ציטרט mM חיץ, pH 4.8 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טטרציקלין במלאי: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניות Cycloheximide: 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> GOPOD assay הערכה, קטלוג K-GLUC (Megazyme, בריי, אירלנד) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קסילוז assay הערכה, קטלוג K-קסילוז (Megazyme, בריי, אירלנד) </li></ol>

genplat: an automated platform for biomass enzyme discovery and cocktail optimization

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.
GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of &tilde;10 pure enzymes requires less than 100 &mu;g of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).
Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are "mixture" experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.
All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For "core" enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as "accessory" are set to 0%. "Core" and "accessory" are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (&beta;-glucosidase), EX3 (endo-&beta;1,4-xylanase, GH10), and BX (&beta;-xylosidase).
<div id="myEventWatcherDiv">
	 </div>

Watch this Scientific Journal Video about GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization at JoVE.com

GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

GENPLAT (רציף GLBRC אנזימים) מהווה פלטפורמה אוטומטיות לגילוי ואופטימיזציה של קוקטיילים אנזים לפירוק ביומסה. זה יכול להיות מותאם ממקורות מרובים תערובות של אנזימים המכילים רכיבים מרובים.

GENPLAT: פלטפורמת Automated Discovery עבור ביומסה אנזימים ואופטימיזציה קוקטייל

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid ...

genplat-an-automated-platform-for-biomass-enzyme-discovery-cocktail

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Views.  Michigan State University. GENPLAT (רציף GLBRC אנזימים) מהווה פלטפורמה אוטומטיות לגילוי ואופטימיזציה של קוקטיילים אנזים לפירוק ביומסה. זה יכול להיות מותאם ממקורות מרובים תערובות של אנזימים המכילים רכיבים מרובים.

Video: GENPLAT: an Automated Platform for Biomass Enzyme Discovery and Cocktail Optimization

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a combinatorial library of materials to be screened in a parallel, high throughput format1. Herein is described the formation and characterization of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique 2. This involves mixing monomers at varied ratios to produce a library of monomer solutions, transferring the solution to a glass slide format using a robotic printing device and curing with UV irradiation. This format is readily amenable to many biological assays, including stem cell attachment and proliferation, cell sorting and low bacterial adhesion, allowing the ready identification of 'hit' materials that fulfill a specific biological criterion3-5. Furthermore, the use of high throughput surface characterization (HTSC) allows the biological performance to be correlated with physio-chemical properties, hence elucidating the biological-material interaction6. HTSC makes use of water contact angle (WCA) measurements, atomic force microscopy (AFM), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS). In particular, ToF-SIMS provides a chemically rich analysis of the sample that can be used to correlate the cell response with a molecular moiety. In some cases, the biological performance can be predicted from the ToF-SIMS spectra, demonstrating the chemical dependence of a biological-material interaction, and informing the development of hit materials5,3.

A description of the formation of a polymer microarray using an on-chip photopolymerization technique. The high throughput surface characterization using atomic force microscopy, water contact angle measurements, X-ray photoelectron spectroscopy and time of flight secondary ion mass spectrometry and a cell attachment assay is also described.

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Hydrophobic Salt-modified Nafion for Enzyme Immobilization and Stabilization

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel cells.1-3 In most bioelectrochemical applications, enzymes or organelles are immobilized onto an electrode surface with the use of some type of polymer matrix. This polymer scaffold should keep the enzymes stable and allow for the facile diffusion of molecules and ions in and out of the matrix. Most polymers used for this type of immobilization are based on polyamines or polyalcohols - polymers that mimic the natural environment of the enzymes that they encapsulate and stabilize the enzyme through hydrogen or ionic bonding. Another method for stabilizing enzymes involves the use of micelles, which contain hydrophobic regions that can encapsulate and stabilize enzymes.4,5 In particular, the Minteer group has developed a micellar polymer based on commercially available Nafion.6,7 Nafion itself is a micellar polymer that allows for the channel-assisted diffusion of protons and other small cations, but the micelles and channels are extremely small and the polymer is very acidic due to sulfonic acid side chains, which is unfavorable for enzyme immobilization. However, when Nafion is mixed with an excess of hydrophobic alkyl ammonium salts such as tetrabutylammonium bromide (TBAB), the quaternary ammonium cations replace the protons and become the counter ions to the sulfonate groups on the polymer side chains (Figure 1). This results in larger micelles and channels within the polymer that allow for the diffusion of large substrates and ions that are necessary for enzymatic function such as nicotinamide adenine dinucleotide (NAD). This modified Nafion polymer has been used to immobilize many different types of enzymes as well as mitochondria for use in biosensors and biofuel cells.8-12 This paper describes a novel procedure for making this micellar polymer enzyme immobilization membrane that can stabilize enzymes. The synthesis of the micellar enzyme immobilization membrane, the procedure for immobilizing enzymes within the membrane, and the assays for studying enzymatic specific activity of the immobilized enzyme are detailed below.

This article will describe the procedure for synthesizing a hydrophobically modified Nafion enzyme immobilization membrane and how to immobilize proteins and/or enzymes within the membrane and test their specific activity.

Nafion הידרופובי מלח, שונה עבור Immobilization האנזים ייצוב

Over the last decade, there has been a wealth of application for immobilized and stabilized enzymes including biocatalysis, biosensors, and biofuel ...

A Versatile Automated Platform for Micro-scale Cell Stimulation Experiments

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in vitro analysis are well suited to study of large numbers of cells (&ge;105) in milliliter-scale volumes (&ge;0.1 ml). However, there are many instances in which it is necessary or desirable to scale down culture size to reduce consumption of the cells of interest and/or reagents required for their culture, stimulation, or processing. Unfortunately, conventional approaches do not support precise and reproducible manipulation of micro-scale cultures, and the microfluidics-based automated systems currently available are too complex and specialized for routine use by most laboratories. To address this problem, we have developed a simple and versatile technology platform for automated culture, stimulation, and recovery of small populations of cells (100 - 2,000 cells) in micro-scale volumes (1 - 20 &mu;l). The platform consists of a set of fibronectin-coated microcapillaries ("cell perfusion chambers"), within which micro-scale cultures are established, maintained, and stimulated; a digital microfluidics (DMF) device outfitted with "transfer" microcapillaries ("central hub"), which routes cells and reagents to and from the perfusion chambers; a high-precision syringe pump, which powers transport of materials between the perfusion chambers and the central hub; and an electronic interface that provides control over transport of materials, which is coordinated and automated via pre-determined scripts. As an example, we used the platform to facilitate study of transcriptional responses elicited in immune cells upon challenge with bacteria. Use of the platform enabled us to reduce consumption of cells and reagents, minimize experiment-to-experiment variability, and re-direct hands-on labor. Given the advantages that it confers, as well as its accessibility and versatility, our platform should find use in a wide variety of laboratories and applications, and prove especially useful in facilitating analysis of cells and stimuli that are available in only limited quantities.

We have developed an automated cell culture and interrogation platform for micro-scale cell stimulation experiments. The platform offers simple, versatile, and precise control in cultivating and stimulating small populations of cells, and recovering lysates for molecular analyses. The platform is well suited to studies that use precious cells and/or reagents.

פלטפורמה אוטומטית צדדי לניסויים בגירוי תא מיקרו בקנה מידה

Study of cells in culture (in vitro analysis) has provided important insight into complex biological systems. Conventional methods and equipment for in ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular processes. There is a need for culturing and measuring systems that incorporate programmed illumination and stimulation of optogenetic systems. We present a protocol for building and using a continuous culturing apparatus to illuminate microbial cells with programmed doses of light, and automatically acquire and analyze images of cells in the effluent. The operation of this apparatus as a chemostat allows the growth rate and the cellular environment to be tightly controlled. The effluent of the continuous cell culture is regularly sampled and the cells are imaged by multi-channel microscopy. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses in the fluorescence intensity and cellular morphology of cells sampled from the culture effluent are measured over multiple days without user input. We demonstrate the utility of this culturing apparatus by dynamically inducing protein production in a strain of Saccharomyces cerevisiae engineered with an optogenetic system that activates transcription.

We designed a continuous culturing apparatus for use with optogenetic systems to illuminate cultures of microbes and regularly image cells in the effluent with an inverted microscope. The culturing, sampling, imaging, and image analysis are fully automated so that dynamic responses to illumination can be measured over several days.

השרשה של תאורה אוטומטית, Culturing, מערכת דגימה עבור יישומים מיקרוביאלית optogenetic

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

A Performance-testing Platform for a Conduction Micropump with an FR-4 Copper-clad Electrode Plate

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is fabricated. It is used to investigate the influence of chamber dimensions on the performance of a conduction micropump and to determine the reliability of the conduction pump when acetone is used as the working fluid. A testing platform is set up to evaluate conduction micropump performance under different conditions. When the chamber height is 0.2 mm, the pump pressure reaches its peak value.

This paper presents a protocol for the fabrication of a conduction micropump using symmetric planar electrodes on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) to test the influence of chamber dimensions on the performance of a conduction micropump.

פלטפורמה בדיקות ביצועים הולכה Micropump עם צלחת אלקטרודה לבושת נחושת FR-4

Here, a conduction micropump with symmetric planar electrode pairs prepared on flame-retardant glass-reinforced epoxy (FR-4) copper-clad laminate (CCL) is ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

פרוטוקול גנרי עבור אופטימיזציה של ייצור החלבון Heterologous באמצעות טכנולוגיית Microbioreactor אוטומטיות

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using Chinese hamster ovary (CHO) cells, culture and process conditions must be optimized to maximize antibody titers and achieve target quality profiles. Typically, this optimization uses automated microscale bioreactors (15 mL) to screen multiple process conditions in parallel. Optimization criteria include culture performance and the critical quality attributes (CQAs) of the monoclonal antibody (mAb) product, which may impact its efficacy and safety. Culture performance metrics include cell growth and nutrient consumption, while the CQAs include the mAb's N-glycosylation and aggregation profiles, charge variants, and molecular weight. This detailed protocol describes how to purify and subsequently analyze HCCF samples produced by an automated microbioreactor system to gain valuable performance metrics and outputs. First, an automated protein A fast protein liquid chromatography (FPLC) method is used to purify the mAb from harvested cell culture samples. Once concentrated, the glycan profiles are analyzed by mass spectrometry using a specific platform (refer to the Table of Materials). Antibody molecular weights and aggregation profiles are determined using size exclusion chromatography-multiple angle light scattering (SEC-MALS), while charge variants are analyzed using microchip capillary zone electrophoresis (mCZE). In addition to the culture performance metrics captured during the bioreactor process (i.e., culture viability, cell counts, and common metabolites including glutamine, glucose, lactate, and ammonia), spent media is analyzed to identify limiting nutrients to improve the feeding strategies and overall process design. Therefore, a detailed protocol for the absolute quantification of amino acids by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) of spent media is also described. The methods used in this protocol take advantage of high-throughput platforms that are compatible for large numbers of small-volume samples.

A detailed protocol for the purification and subsequent analysis of a monoclonal antibody from harvested cell culture fluid (HCCF) of automated microbioreactors has been described. Use of analytics to determine critical quality attributes (CQAs) and maximizing limited sample volume to extract vital information is also presented.

טיהור וניתוח של נוגדן חד שבטיים מן הסינית שחלות אוגר תאים באמצעות מערכת Microbioreactor חקן אוטומטי

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...