מימון פרויקט זה סופק על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים OCE1029607 (עד XM) ו MCB0702125 (אל MAM) ואת גורדון ובטי מור קרן (אל MAM).

1. דגימת מים עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנן מים סביבתיים 10L עד 1 מיקרומטר, נקבוביות בגודל מסננים קרום להסיר חלקיקים גדולים bacteriovores. אסוף את תסנין בקבוק מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 36 מ&quot;ל תסנין לכל לתוך 3 צינורות סטרילי Eppendorf (50 מ&quot;ל) המכילה 4 מ&quot;ל טרי paraformaldehyde פתרון מוכן (PFA; 10%). דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר כדי לשמר את התאים. איסוף תאים על 0.22-מיקרומטר, נקבוביות בגודל מסננים קרום לבן על ידי סינון ואקום. שטפו את המסנן על ידי העברת 10 מ&quot;ל בופר פוספט (PBS) דרך המסנן על ידי סינון ואקום. לייבל מסננים כפקדי שלילי ולאחסן אותם -20 ° C. </li></ol> צעדים 1.3-1.4 הם אופציונליים להקמת DOC מוגבלת בתנאים. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים תערובת של חנקן זרחן אורגניים (5 מיקרומטר NH 4 Cl, 5 מיקרומטר NANO 3, 1μM לאא 2 PO 4 בריכוז הסופי) לתוך בקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בחושך על הטמפרטורה במשך 48 שעות באתרו עם בהסתה מזדמנים. </li></ol> 2. מיקרוקוסמוס הקמת הדגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל צלוחיות של six 1-L עם זכוכית מדגם 800 מ&quot;ל בקבוק מים של 1.4 צעד להקים מיקרוקוסמוס. הוסף BrdU (10 מיקרומטר, הריכוז הסופי) כדי מיקרוקוסמוס כל אחד. מערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל מודל DOC פתרון מתחם לשלוש של מיקרוקוסמוס, אלה ישמש תיקונים DOC. הוסף 1 מ&quot;ל סטרילי PBS לשלוש מיקרוקוסמוס הנותרים, אלה ישמש ללא בנוסף שולטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה כל מיקרוקוסמוס בתוך שייקר החממה דגירה בחושך בבית בטמפרטורה באתרו תוך רועד ב 100 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף של 36 מ&quot;ל דגימת מים מן מיקרוקוסמוס כל העברה לתוך 50 מ&quot;ל צינורות סטרילי Eppendorf בנקודות זמן של 0, 8, 16, ו - 24 שעות. מיד להוסיף 4 מ&quot;ל של PFA טריים (10%) לצינורות איסוף דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר כדי לשמר את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן נשמר באמצעות תאים 0.22-מיקרומטר, נקבוביות בגודל מסננים פוליקרבונט הממברנה. שטפו את המסננים עם 10 מ&quot;ל PBS. המשך מיד לשלב הבא או לאחסן את המסננים ב -20 ° C. </li></ol> 3. Immunodetection באתרו עבור התאגדות BrdU <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה מסננים (דגימות DOC המתוקן, ללא תוספת שולט שולטת שלילי) בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 1 מ&quot;ל של תמיסת ליזוזים [10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ליזוזים ביצה לבן 100 מ&quot;מ טריס, 50 ננומטר EDTA (pH = 8)] 4 תאים חיידקיים כדי לכסות על המסנן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את המסנן על ידי העברת 10 מ&quot;ל PBS דרכו תחת יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של תמיסת K proteinase [2 מ&quot;ג / מ&quot;ל proteinase K ב 100 מ&quot;מ טריס, 50 ננומטר EDTA (pH = 8)] 4 תאים חיידקיים כדי לכסות על המסנן. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. שטפו את המסנן על ידי העברת 10 מ&quot;ל PBS דרכו תחת יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל exonuclease פתרון [exonuclease III (50 U / ml) ב 5 מ&quot;מ MgCl 2 ו - 50 מ&quot;מ טריס-HCl] 5 תאים חיידקיים כדי לכסות על המסנן. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. שטפו את המסנן על ידי העברת 10 מ&quot;ל PBS דרכו תחת יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב מסגרת חותם בתאי הדגירה (Bio-Rad) על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פורסים את המסנן לתוך שמיניות באמצעות להב סטרילי על פני השטח אלכוהול לניקוי יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, במקום סעיף השמיני של מסנן לתוך תא מסגרת אחת חותם התאספו הדגירה (שמונה מסגרת חותם בלשכה יש צורך במדגם כל מסנן). הצד של הסעיף לסנן המכילה תאים צריך הפנים כלפי מעלה. רטיבות בחלק האחורי של המסנן תאפשר את המקל לסנן לשקופית. אם המסנן הופך יבש, להחיל טיפה (2 μl) של diH 2 O במרכז החדר לפני הצבת בסעיף לסנן בשקופית. </li></ol> צעדים 3.8-3.20 להשתמש ריאגנטים מן רוש קיט תא באתרו הפצת נשק, FLUOS שונה מן הנהלים הבאים הוראות היצרן. חוץ PBS, ריאגנטים כל מסופקות בתוך הערכה. <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל חיץ דגירה מספיק (0.5% שור בסרום חלבון, 0.1% Tween20 ב-PBS,) כדי לכסות את החלק שווה לסנן כולו בתא דגירה מבלי לגרום הצפת פעם את החותם מוחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום מסגרת פוליאסטר לכסות על מסגרת הקאמרית הדגירה. לחץ כלפי מטה בחוזקה כדי לאטום את תא הדגירה. הימנע בועות אוויר מעל המסנן. דגירה לתאי חתום על 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החותם פוליאסטר לפתוח בתאי הדגירה. (הערה: פתיחת לתאי לפעמים ימשוך את חותם מסגרת משקופית במקרה זה, להכין חדר חדש עבור לשלבים הבאים..) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet מחוץ למאגר הדגירה מפינה אחת של החדר. יש להימנע ממגע עם המסנן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסנן על ידי בעדינות pipetting 100 PBS μl פנימהמתוך החדר 3 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אנטי BrdU-FLUOS פתרון עובד ביצוע הפעולות המומלץ על ידי היצרן מיד לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 120 μl אנטי BrdU-FLUOS עובדים על פתרון הסינון, מקפיד באופן שווה לכסות את כל פני השטח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Reseal תא עם כיסוי פוליאסטר חדש. הימנע בועות אוויר על גבי המסנן. דגירה הקאמרית בחושך על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. צעד זה יהיה תווית ה-DNA BrdU שולבו באתרו עם isothiocyanate והעמסת (FITC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את כיסוי פוליאסטר לפתוח את תא הדגירה. Pipet את פתרון האנטי BrdU-FLUOS העבודה. שטפו את המסנן 3 פעמים עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת את המסנן מתא הדגירה על משטח סטרילי. פורסים את סעיף לסנן לחתיכות קטנות בעזרת סכין סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את חתיכות לסנן לתוך 2 צינורות microcentrifuge מ&quot;ל, שכל אחת מהן מכילה 1 מ&quot;ל PBS. כובע בחוזקה את צינור וסוגרים עם parafilm. לדגור על 37 ° C ו 200 סל&quot;ד במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הצינורות על vortexer ו מערבולת במהירות מקסימלית במשך 5 דקות. Pipet supernatant לתוך צינור סטרילי Eppendorf 15 מ&quot;ל. חזור על צעדים הדגירה מערבולת עבור פי 5 יותר. מערבבים את supernatant באותה 15 מ&quot;ל Eppendorf צינור עבור כל דגימה. בדרך כלל, 80% תאים ניתן לשחזר ב ההשעיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות supernatant עם תאים resuspended ב 4 ° C. מיון בתוך 2 ימים. </li></ol> 4. FACS ניתוח הליך עבור cytometer BD תזרים FACSAria ותוכנה המקביל מתואר כאן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את ההגדרה של cytometer תזרים השלבים הבאים המומלץ על ידי היצרן. זה כרוך: התאמת בקרה הגברה כדי להגדיר את הפרמטרים הנדרשים breakoff ואת הנקודה המתוקה: אופטימיזציה של עיכוב לייזר דרוג גורמי שטח הלחץ נדן ניסוי ואופטימיזציה הגדרות עבור FSC מתח SSC, סף FSC, דרוג FSC הקרינה, הקרינה מתח PMT וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל דגימות בקרה שלילית על cytometer הזרימה (FCM) מבוסס על עוצמת הקרינה של פיזור FITC צד (SSC). הגדלת סף FITC עד לא התאים שולט שלילי ניתן דמיינו ידי להציג FITC-SSC הרכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה ללא תוספת דגימות מלאה לבחון את דפוס והפצה של 10,000 תאים בהתבסס על FITC ורכישת SSC. הגדרת שער לצרף את כל התאים לייעד אותם &quot;תאים בעצימות נמוכה&quot; (LIS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל DOC-המתוקן דגימות ולבחון את דפוס והפצה של 10,000 תאים בהתבסס על FITC ו SSC. תאים מסוימים יופיעו השער LI מראש. הגדרת שער נוסף לצרף את התאים יש עוצמת הקרינה גבוהה יותר (שלו) מאשר ליס. רוכשת את הסטטיסטיקה כדי לראות את השפע היחסי של תאים מגודרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין תאים HI לתוך צינורות אוסף המכיל 500 PBS μl ב &quot;לטהר 1 טיפה&quot; מצב. לסיים מיון כאשר מספר שלו מגיע 500,000 שחשוב. </li></ol> 5. סנן הגברה PCR של 16S rRNA גנים סנן נהלים PCR משתנים מן Kirchman et al. 6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים ממוינים סנן על לבן, 0.22 מיקרומטר, נקבוביות בגודל 25 מ&quot;מ בקוטר, פוליקרבונט הממברנה הסינון. חתוך את קצה של מסנן שאינו מכיל תאים חיידקיים באמצעות להב סטרילי. פורסים את המסנן לתוך 8 חתיכות בגודל שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים חתיכת מסנן יחיד לתוך צינור תגובת PCR, עם התאים הפונים פנימה של הצינור. הוסף 45 μl מים PCR כיתה לתוך הצינור תגובת PCR. את המסנן לחלוטין במים הצף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 רוש illustra PuReTaq קראו-To-Go חרוזי PCR לתוך הצינור תגובת PCR, בקצרה מערבולת. הוסף 2 μl אחד קדימה 16S rRNA הפוך גן primers (0.4 מיקרומטר הריכוז הסופי של כל פריימר), כגון 27F ו 1492R 7, לתוך כל אחד הצינורות תגובת PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הוסף פתרון 1μl שור אלבומין בסרום (BSA, הריכוז הסופי 30μg/100 μl) לתערובת התגובה PCR לעזור מעכבי הגברה לספוג. אם מישהו בוחר שלא להוסיף BSA, להוסיף 1μl של מים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע הגברה PCR על Cycler תרמית. לנחות תוכנית PCR מומלץ, יש בו את הטמפרטורה חישול ברצף הפחתת 62-52 ° C על ידי 1 ° C לכל מחזור של 11 מחזורים, ואחריו 15 מחזורים עם חישול בטמפרטורה של 52 ° C. כל המחזורים כוללים denaturing (ב 95 ° C), חישול (ב 62-52 ° C), והסיומת (ב 72 ° C) מדרגות משך ה -50. Denaturation הראשונית של 3 דקות ו - השלב הסופי של 10 דקות הארכה נכלל גם בתוכנית PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשר הגברה PCR על ידי אלקטרופורזה על ברומיד מוכתם ethidium 1% agarose ג&#39;ל. והבלו amplicons PCR מן הג&#39;ל ונקי עם ערכת חילוץ QIAquick ג&#39;ל QIAGEN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע שתי amplifications PCR נוספים מדגם זה, בכל פעם להשתמש בסעיף מסנן חדש. אחרי ה-PCR בג&#39;ל purificatiעל, הבריכה amplicons המדגם אותו יחד. מטוהרים 16S amplicons rDNA מוכנים כעת במשך מספר ניתוחים מולקולריים, המאפשרים זיהוי טקסונומי, כגון בניית שיבוט ספריה וסדר. </li></ol> 6. נציג התוצאות: תוצאות נציג מתוארים באמצעות לימוד putrescine-חיידקים מפרקי כדוגמה. דגימות מים נאספו מאתר החוף של גאורגיה מעובד בעקבות הליכים שתוארו לעיל. ניתוח FACS גילה כי בנוסף putrescine המושרה הפיתוח של קבוצת חיידקים עם עוצמת הקרינה גבוהה FITC, המציין שיעור גבוה BrdU ההתאגדות (איור 1). תאים אלה הוגדרו גבוהה BrdU-התאגדות תאים (שלו) היו אמורים להכיל בעיקר putrescine-משפיל חיידקים. היו חסרים ללא בנוסף שולטת, אשר הכיל רק תאים עם רמות נמוכות יותר של ההתאגדות BrdU (LIS). ליס היו אמורים להכיל bacterioplankton בעיקר כי לא היו מסוגלים להשתמש putrescine הוסיף. שלו היו מיון לתוך צינורות מופרדים ולאחר מכן נאסף על מסנני הממברנה. 16S rRNA amplicons גן התקבלו גבוהה בתאים באמצעות מסנן HI-PCR. <img src="/files/ftp_upload/2855/2855fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. ניתוח תזרים cytometric של שליטה ללא תוספת מודל-תרכובת-המתוקן (putrescine כדוגמה כאן) דגימות שנאספו לאחר 24 שעות של דגירה. הפצה וניתוח Cell התבסס על עוצמה (1) הקרינה של FITC תיוג (ציר x), אשר קשורה באופן חיובי לרמת ההתאגדות BrdU, ו (2) פיזור צד (SSC, ציר y), אשר קשורה באופן חיובי לתא גודל. בסימון שער מתבססת על רמת ההתאגדות BrdU, (היי, גבוהה BrdU-ההתאגדות; LI, נמוך BrdU-ההתאגדות). האחוז היחסי של HI ו - LI תאים מוצגים שערי המקביל.

<ol>
	<li>Pernthaler, A., Pernthaler, J., Schattenhofer, M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+DNA-synthesizing+bacterial+cells+in+coastal+North+Sea+plankton.">Identification of DNA-synthesizing bacterial cells in coastal North Sea plankton.</a> Appl. Environ. Microbiol. 68, 5728-5728 (2002).</li><li>Urbach, E., Vergin, K. L., Giovannoni, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+and+isolation+of+DNA+from+metabolically+active+bacteria.">Immunochemical detection and isolation of DNA from metabolically active bacteria.</a> Appl. Environ. Microbiol. 65, 1207-12 (1999).</li><li>Mou, X. Z., Hodson, R. E., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterioplankton+assemblages+transforming+dissolved+organic+compounds+in+coastal+seawater.">Bacterioplankton assemblages transforming dissolved organic compounds in coastal seawater.</a> Environ. Microbiol. 9, 2025-2025 (2007).</li><li>Hodson, R. E., Dustman, W. A., Garg, R. P., Moran, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+PCR+for+visualization+of+microscale+distribution+of+specific+genes+and+gene+products+in+prokaryotic+communities.">In situ PCR for visualization of microscale distribution of specific genes and gene products in prokaryotic communities.</a> Appl. Environ. Microbiol. 61, 4074-4074 (1995).</li><li>Dinjens, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bromodeoxyuridine+(BrdU)+immunocytochemistry+by+exonuclease+III+(Exo+III)+digestion.">Bromodeoxyuridine (BrdU) immunocytochemistry by exonuclease III (Exo III) digestion.</a> Histochemistry. 98, 199-199 (1992).</li><li>Kirchman, D. L., Yu, L. Y., Fuchs, B. M., Amann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+bacterial+communities+in+aquatic+systems+as+revealed+by+filter+PCR.">Structure of bacterial communities in aquatic systems as revealed by filter PCR.</a> Aquat. Microb. Ecol. 26, 13-13 (2001).</li><li>Delong, E. F., Wickham, G. S., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+stains:+ribosomal+RNA-based+probes+for+the+identification+of+single+cells.">Phylogenetic stains: ribosomal RNA-based probes for the identification of single cells.</a> Science. 243, 1360-1360 (1989).</li><li>Artursson, V., Jansson, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine+immunocapture+to+identify+active+bacteria+associated+with+arbuscular+mycorrhizal+hyphae.">Use of bromodeoxyuridine immunocapture to identify active bacteria associated with arbuscular mycorrhizal hyphae.</a> Appl. Environ. Microbiol. 69, 6208-6208 (2003).</li><li>Mou, X. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+carbon+processing+by+generalist+species+in+the+coastal+ocean.">Bacterial carbon processing by generalist species in the coastal ocean.</a> Nature. 451, 708-708 (2008).</li><li>Mou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow-cytometric+cell+sorting+and+subsequent+molecular+analyses+for+culture-independent+identification+of+bacterioplankton+involved+in+dimethylsulfoniopropionate+transformations.">Flow-cytometric cell sorting and subsequent molecular analyses for culture-independent identification of bacterioplankton involved in dimethylsulfoniopropionate transformations.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71, 1405-1405 (2005).</li><li>Dean, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+human+genome+amplification+using+multiple+displacement+amplification.">Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5261-5261 (2002).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

זוגות הגישה שלנו ההתאגדות BrdU, FACS ו 16S ניתוח rDNA כדי לאפשר זיהוי ברמת המין של bacterioplankton כי לעכל רכיבים בודדים DOC בסביבות מימיים. Assay ההתאגדות BrdU תוויות תאים חיידקיים מבוסס על פעילות מטבולית, המאפשר ניתוח רק על חיידקים פעילים, ולכן אינה כוללת תאים רדומים. בגישה שלנו, ההתאגדות BrdU הוא חיידקים באתרו immunodetected וכי יש רמות שונות של התאגדות BrdU הם דמיינו לאחר מכן, לקבץ מיון באמצעות FACS. ניתוח של תאים משולבים BrdU יש גם דיווחו על שימוש מגנטי חרוז immunocapture של ה-DNA BrdU שכותרתו ואחריו מנתח מולקולרית 2,8,9. מגבלה אחת של המתודולוגיה השניה היא חוסר יכולתו להבחין בין תאים של רמות פעילות שונות. במקרה כזה, הניתוח יכלול תאים להישאר פעיל רק מעט באמצעות DOC הילידים בדגימות מים (איור 1, LIS). הגישה יחד נעשה שימוש כדי לזהות את המבנים טקסונומי של חיידקים המסוגלים לפגוע תרכובות DOC כגון dimethylsulfoniopropionate (DMSP), vanillate, betaine גליצין במי הים החוף 3. היישום שלה ניתן להסיק באופן כללי ללמוד טקסונומיה של חיידקים שמשתמשים אחרים מצעים מומס אחד או מעורבים בסביבות מימיים. בנוסף גנים 16S rRNA, סמנים גן פונקציונלי יכול גם להיות מנותח בצורה דומה. ניתוח מולקולרית על תאים ממוינים מאתגר בשל שפע קטן של תאים ממוינים, שהוא בדרך כלל פחות מ 1 מיליון תאים. לכן, תבנית הגברה DNA בדרך כלל יש צורך בניתוח נוסף מולקולרית. אמנם מוגבל בכמות התאים, ברזולוציה מספקת של מבנה הקהילה מתקבל בדרך כלל. מחקרים הוכיחו כי אצבע הקהילה הדפסים שנוצר על ידי הגבלת אורך קטע מסוף פולימורפיזם (T-RFLP) מ נמוך כמו 2000 תאים (~ 1 ים μl) בעיקר דומות לאלו שנוצרו 2x10 9 תאים (~ 1 ים L) במי הים החוף 10. בנוסף הגברה גן יחיד באמצעות PCR, ניתוח metagenomic של תאים ממוינים אפשרי באמצעות טכניקה בלתי PCR הגברה מבוסס גנומי, הגברה עקירה מרובים כלומר, מד&quot;א 11. צעדים קריטיים כדי לשמור על תנאים קרובים בנוסף לטבע, של כמויות עודפות של תרכובות חיצוני DOC כדי מיקרוקוסמוס ו דגירה ממושכת יש להימנע. ניסויים ראשוניים מומלץ מאוד לקבוע את הסכומים הנמוכים ביותר של תרכובות מודל DOC הנדרשים כדי לגרום להתפתחות של תאים HI בתוך זמן קצר יחסית (&lt;72 שעות). פעמים הדגירה ארוך יותר יכול להעלות את החשש להתפתחות של אפקט, בקבוק מיקרוקוסמוס. טרום הדגירה עם N אורגניים P הוא אופציונלי, אך עשוי לעזור לקצר את משך זמן הדגירה הנדרש להתפתחות של תאים HI ב DOC מיקרוקוסמוס מתוקן. תנאי קיבוע התא לפני immunodetection הקרינה BrdU חשובים באופן ביקורתי. קיבעון מספקת תגרום לאובדן של תאים במהלך תא צעדים קיר permeabilization (ליזוזים ו proteinase טיפולים K). מצד שני, תאים מעל לגובה נוטים להיות נוקשים מדי lyse ולשחרר תבנית ה-DNA של הגברה מסנן-PCR. בחירה של משמר, משמר ריכוז וזמן אורך שימור צריך להיות מותאם במיוחד לקהילה חיידקי למד. נהלים לשימור המפורטים בפרוטוקול זה מוטבו עבור קהילה bacterioplankton החוף ימיים כי הוא נשלט במידה רבה את אלפא ואת gamma-10 המחוזות על ידי Proteobacteria. שלבים מרובים של immunodetection BrdU מבוצעות על מסנני הממברנה. זהירות יש לנקוט כדי למנוע את ייבוש מסננים. תאים מיובש על פני מיובש מסננים עשוי מאוד לצרף את ממברנות לסנן מכן ניתן יהיה קשה resuspend לניתוח FACS מאוחר יותר. ספירת תאים של חיידקים לפני ואחרי immunodetection BrdU יש למדוד תמיד כדי לקבוע את קצב ההתאוששות של תאים חיידקיים. בעת ביצוע מסנן-PCR 6, את עוצמת הקול של ה-PCR ריאגנטים צריך להיות מספיק כדי להטביע את פיסת לסנן לחלוטין. התוכנית מותאמת חם להתחיל ולגעת למטה PCR בכלל יעזור לייצר הגברה גנים טובים. יתר על כן אופטימיזציה PCR יכול להתבצע באמצעות ערכת אופטימיזציה PCR (כגון כשל מערכת EPICENTRE PCR) או מניפולציה של ריכוזי מרכיבים Mg 2 +, BSA אחרים. שיטת ההגבלה גישה זו מאפשרת בשילוב אוסף של חיידקים שעלולים לבזות מצע מסוים ויכולים תרבות עצמאי לזהות תאים אלה תפקודית רמות טקסונומיות מפורטות. עם זאת, מספר שיקולים צריכים להילקח acלספור כאשר פירוש התוצאות. גישה יוזמת ידי הדגירה של bacterioplankton טבעי עם תרכובות מסוימות, בדרך כלל לא נותב רמות בבקבוקי זכוכית. תאים שזוהו מכלולים פונקציונלי עשויים להיות שונים מאלה כי התהליך מורכב נתון (ים) תחת בתנאים באתרה. שילוב BrdU נמצא להיות מורגשת במשך 1,2 חיידקים מסוימים. חיידקים אלה, ולכן, אינם נגישים באמצעות שיטה זו. חיידקים שאינם מעורבים ישירות השפלה מתחם אבל לקחת את המוצרים השפלה של מתחם נוסף (ים) עשוי לתת חיוביות שגויות אותות כי הם נבדלים מן degraders נכון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> סוג </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> BrdU </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> B5002-5G </td><td></td></tr><tr><td> ליזוזים </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> L6876-5G </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> מגיב </td><td> סיגמא </td><td> P2308-25mg </td><td></td></tr><tr><td> באתרו התפשטות תאים קיט, FLUOS </td><td> ערכה </td><td> רוש </td><td> 11810740001 </td><td> לצרוך יותר של Anti-BrdU-FLUOS ו חיץ דגירה לכל תגובה מאשר הציע ידי היצרן. </td></tr><tr><td> מסגרות חותם דגירה צ&#39;יימברס </td><td> חומר </td><td> Bio-Rad </td><td> SLF-1201 </td><td></td></tr><tr><td> פוליקרבונט ממברנה מסננים (142 מ&quot;מ, קוטר, 1.0 מיקרומטר הנקבוביות, בגודל) </td><td> חומר </td><td> Millipore </td><td> FALP14250 </td><td></td></tr><tr><td> פוליקרבונט מסננים ממברנה (25 מ&quot;מ, קוטר, 0.2 מיקרומטר-נקבוביות בגודל) </td><td> חומר </td><td> Millipore </td><td> FGLP02500 </td><td></td></tr><tr><td> illustra PuReTaq Ready-To-Go-PCR חרוזים </td><td> ערכה </td><td> GE Healthcare </td><td> 27-9559-01 </td><td></td></tr><tr><td> QIAquick ג&#39;ל ערכת חילוץ </td><td> ערכה </td><td> QIAGEN </td><td> 28704 </td><td></td></tr><tr><td> כשל מערכת ה-PCR </td><td> ערכה </td><td> EPICENTRE </td><td> FS99060 </td><td></td></tr></tbody></table>

bromodeoxyuridine (brdu) labeling and subsequent fluorescence activated cell sorting for culture-independent identification of dissolved organic carbon-degrading bacterioplankton

חיידקים הם סוכני התיווך העיקריים את ההשפלה של פחמן אורגני מומס רבים (DOC) מצעים בסביבות מימיים. עם זאת, זיהוי מינים חיידקים שהופכים בריכות ספציפיים של DOC בטבע מהווה אתגר טכני. כאן אנו מתארים גישה זוגות bromodeoxyuridine (BrdU) ההתאגדות, תא הקרינה מיון מופעל (FACS), ו - 16S rRNA ניתוח מולקולרי גנטי המבוסס המאפשר תרבות עצמאית זיהוי bacterioplankton מסוגל מתחם DOC משפיל ספציפי בסביבות מימיים. Bacterioplankton מיקרוקוסמוס בשלושה עותקים מוגדרים לקבל הן BrdU ו תרכובת DOC מודל (DOC תיקונים), או רק BrdU (ללא תוספת שליטה). תחליפי BrdU עמדות thymidine ב-DNA חיידקי מסונתז החדש ו-BrdU שכותרתו DNA ניתן 1,2 immunodetected בקלות. באמצעות bacterioplankton 24 שעות דגירה, כי הם מסוגלים להשתמש במתחם הוסיף DOC צפויים להיות מופעלים באופן סלקטיבי, ולכן יש רמות גבוהות יותר של שילוב BrdU (תאים HI) מאשר אי - היענות תאים התיקונים DOC ו תאים ללא בנוסף שולטת (נמוך תאים BrdU ההתאגדות, תאים LI). לאחר immunodetection פלואורסצנטי, HI תאים נבדלים ו מופרדים פיזית על ידי מיון הקרינה התא הפעיל (FACS) 3 מתאי LI. ממוין DOC-מגיבים תאים (תאים HI) המחולצים עבור דנ&quot;א שזוהו טקסונומית באמצעות 16S rRNA הבאים הגן מבוססי ניתוח כולל PCR, שיבוט בנייה ספריה וסדר.

Watch this Scientific Journal Video about Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degradin

Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Bacterioplankton הסביבה מודגרת עם מודל מומס פחמן אורגני (DOC) המתחם מגיב תיוג DNA, bromodeoxyuridine (BrdU). לאחר מכן, DOC-משפיל תאים מופרדים מן הקהילה בתפזורת מבוסס על שילוב גבוהות BrdU שלהם באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS). תאים אלה מזוהים מכן על ידי מנתח מולקולרית שלאחר מכן.

Bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג ומיון לאחר פלואורסצנטי תא פעיל עבור זיהוי, תרבות עצמאית של פחמן אורגני מומסים משפיל Bacterioplankton

Microbes are major agents mediating the degradation of numerous dissolved organic carbon (DOC) substrates in aquatic environments. However, identification ...

bromodeoxyuridine-brdu-labeling-subsequent-fluorescence-activated

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Bromodeoxyuridine (BrdU) Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

20.9K Views.  Kent State University. Bacterioplankton הסביבה מודגרת עם מודל מומס פחמן אורגני (DOC) המתחם מגיב תיוג DNA, bromodeoxyuridine (BrdU). לאחר מכן, DOC-משפיל תאים מופרדים מן הקהילה בתפזורת מבוסס על שילוב גבוהות BrdU שלהם באמצעות תא הקרינה מיון מופעל (FACS). תאים אלה מזוהים מכן על ידי מנתח מולקולרית שלאחר מכן.

Video: Bromodeoxyuridine BrdU Labeling and Subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting for Culture-independent Identification of Dissolved Organic Carbon-degrading Bacterioplankton

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

מדידת Exocytosis בנוירונים באמצעות תיוג FM

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

הדור של האדם CD40 בתאי B המופעל

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

מיון פלואורסצנטי תא פעיל של Protoplasts הצמח

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting (LIMACS): a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification procedures. As an alternative, lipids can be coated on flat surfaces as used for lipid ELISA and Plasmon resonance spectroscopy. However, surface coating lipids do not form microdomain structures, which may be important for the lipid binding properties. Further, these methods do not allow for the purification of larger amounts of proteins binding to their target lipids.
 To overcome these limitations of testing lipid protein interaction and to purify lipid binding proteins we developed a novel method termed lipid vesicle-mediated affinity chromatography using magnetic-activated cell sorting (LIMACS). In this method, lipid vesicles are prepared with the target lipid and phosphatidylserine as the anchor lipid for Annexin V MACS. Phosphatidylserine is a ubiquitous cell membrane phospholipid that shows high affinity to the protein Annexin V. Using magnetic beads conjugated to Annexin V the phosphatidylserine-containing lipid vesicles will bind to the magnetic beads. When the lipid vesicles are incubated with a cell lysate the protein binding to the target lipid will also be bound to the beads and can be co-purified using MACS. This method can also be used to test if recombinant proteins reconstitute a protein complex binding to the target lipid. 
 We have used this method to show the interaction of atypical PKC (aPKC) with the sphingolipid ceramide and to co-purify prostate apoptosis response 4 (PAR-4), a protein binding to ceramide-associated aPKC. We have also used this method for the reconstitution of a ceramide-associated complex of recombinant aPKC with the cell polarity-related proteins Par6 and Cdc42. Since lipid vesicles can be prepared with a variety of sphingo- or phospholipids, LIMACS offers a versatile test for lipid-protein interaction in a lipid environment that resembles closely that of the cell membrane. Additional lipid protein complexes can be identified using proteomics analysis of lipid binding protein co-purified with the lipid vesicles.

Lipid Vesicle-mediated Affinity Chromatography using Magnetic Activated Cell Sorting LIMACS: a Novel Method to Analyze Protein-lipid Interaction

To test the interaction of a protein with its target lipid we used MACS and Annexin V-conjugated magnetic beads and lipid vesicles synthesized from the target lipid and Annexin V-binding phosphatidylserine. Proteins bound to the target lipid are co-purified and analyzed after elution from the beads.

שלפוחיות בתיווך זיקה ליפידים כרומטוגרפיה באמצעות Cell מגנטי מיון פעיל (LIMACS): שיטה חדשה לנתח חלבון, שומנים אינטראקציה

The analysis of lipid protein interaction is difficult because lipids are embedded in cell membranes and therefore, inaccessible to most purification ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their prominent presence is often associated with poor prognosis1,2. CAFs are an activated subpopulation of stromal fibroblasts, many of which express the myofibroblast marker &alpha;-SMA3. CAFs originate from local tissue fibroblasts as well as from bone marrow-derived cells recruited into the developing tumor and adopt a CAF phenotype under the influence of the tumor microenvironment4. CAFs were shown to facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes tumor cell proliferation, angiogenesis, and invasion5-8. We demonstrated that CAFs enhance tumor growth by mediating tumor-promoting inflammation, starting at the earliest pre-neoplastic stages9. Despite increasing evidence of the key role CAFs play in facilitating tumor growth, studying CAFs has been an on-going challenge due to the lack of CAF-specific markers and the vast heterogeneity of these cells, with many subtypes co-existing in the tumor microenvironment10. Moreover, studying fibroblasts in vitro is hindered by the fact that their gene expression profile is often altered in tissue culture11,12 . To address this problem and to allow unbiased gene expression profiling of fibroblasts from fresh mouse and human tissues, we developed a method based on previous protocols for Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)13,14. Our approach relies on utilizing PDGFR&alpha; as a surface marker to isolate fibroblasts from fresh mouse and human tissue. PDGFR&alpha; is abundantly expressed by both normal fibroblasts and CAFs9,15 . This method allows isolation of pure populations of normal fibroblasts and CAFs, including, but not restricted to &alpha;-SMA+ activated myofibroblasts. Isolated fibroblasts can then be used for characterization and comparison of the evolution of gene expression that occurs in CAFs during tumorigenesis. Indeed, we and others reported expression profiling of fibroblasts isolated by cell sorting16. This protocol was successfully performed to isolate and profile highly enriched populations of fibroblasts from skin, mammary, pancreas and lung tissues. Moreover, our method also allows culturing of sorted cells, in order to perform functional experiments and to avoid contamination by tumor cells, which is often a big obstacle when trying to culture CAFs.

Isolation of Normal and Cancer-associated Fibroblasts from Fresh Tissues by Fluorescence Activated Cell Sorting FACS

Cancer Associated Fibroblasts (CAFs) facilitate tumor initiation, growth and progression through signaling that promotes proliferation, angiogenesis, and inflammation. Here we describe a method to isolate pure populations of normal fibroblasts and CAFs from fresh mouse and human tissues by cell sorting, using PDGFR&#x03B1; as a surface marker.

בידוד של פיברובלסטים נורמלים והסרטן הקשורים מרקמות טריות על ידי מיון תא הופעל פלואורסצנטי (FACS)

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most prominent cell type within the tumor stroma of many cancers, in particular breast carcinoma, and their ...

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these organisms form networks of interconnected hyphae, known as pellets, which are heterogeneous in size. Here we describe a method to analyze and sort mycelial pellets using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS). Detailed instructions are given for the use of the instrument and the basic statistical analysis of the data. We furthermore describe how pellets can be sorted according to user-defined settings, which enables downstream processing such as the analysis of the RNA or protein content. Using this methodology the mechanism underlying heterogeneous growth can be tackled. This will be instrumental for improving streptomycetes as a cell factory, considering the fact that productivity correlates with pellet size.

Sorting of Streptomyces Cell Pellets Using a Complex Object Parametric Analyzer and Sorter

Liquid-grown Streptomyces cultures are characterized by mycelial pellets that are heterogeneous in size. We here describe a method to analyze and sort such pellets in a high-throughput manner. These pellets can be used for further analyses, which will provide leads to understand and control growth heterogeneity.

מיון של<em&gt; Streptomyces</em&gt; פלטות ניידים באמצעות אובייקט מורכב פרמטריים מנתח וסדרן

Streptomycetes are filamentous soil bacteria that are used in industry for the production of enzymes and antibiotics. When grown in bioreactors, these ...

Nanogold Labeling of the Yeast Endosomal System for Ultrastructural Analyses

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the plasma membrane and the Golgi. As a result the endosomal system plays a central role in maintaining cell homeostasis, and mutations in genes belonging to this network of organelles interconnected by vesicular transport, cause severe pathologies including cancer and neurobiological disorders. It is therefore of prime relevance to understand the mechanisms underlying the biogenesis and organization of the endosomal system. The yeast Saccharomyces cerevisiae has been pivotal in this task. To specifically label and analyze at the ultrastructural level the endosomal system of this model organism, we present here a detailed protocol for the positively charged nanogold uptake by spheroplasts followed by the visualization of these particles through a silver enhancement reaction. This method is also a valuable tool for the morphological examination of mutants with defects in endosomal trafficking. Moreover, it is not only applicable for ultrastructural examinations but it can also be combined with immunogold labelings for protein localization investigations.

Yeast, Saccharomyces cerevisiae, has been a key model organism to identify and study genes regulating the biogenesis and functions of the endosomal system. Here we present a detailed protocol for the specific labeling of the endosomal compartments for ultrastructural studies.

Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural

Endosomes are one of the major membrane sorting checkpoints in eukaryotic cells and they regulate recycling or destruction of proteins mostly from the ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

תיוג רצף ספציפי של חומצות גרעין וחלבונים עם Methyltransferases ואנלוגים כקו-פקטורים

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...