אנו מודים לד&quot;ר ד&quot;ר מיכאל קאשל (National Institutes of Health, Bethesda, מסצ&#39;וסטס, ארה&quot;ב) לשליחת לנו זני חיידקים, פלסמידים, ופרוטוקולים הצורך. אנו מודים לד&quot;ר ג&#39;ון גלובר (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת טורונטו) לשימוש של הקורא צלחת SpecraMax. בבריטניה הוא מקבל הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) מלגות לתארים מתקדמים, המכון הקנדי של תוכנית הבריאות הדרכה אסטרטגי מחקר בביולוגיה מבנית של חלבונים בממברנה הקשורים למחלה, וכן אוניברסיטת אחוות פתח טורונטו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לחקר הבריאות (MOP-67210) כדי וואה.

1) ריאגנטים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להכין את הדברים הבאים שלושה פתרונות: 1 מ&quot;ל של פתרון אשר מורכב של 8 מ&quot;מ L-ליזין, נתרן 100 mM 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic חומצה (MES) pH 6.5, 0.2 מ&quot;מ נוקלאוטיד, שם הוא נוקלאוטיד או: diphosphate guanosine (תמ&quot;ג), guanosine טריפוספט (GTP), guanosine 5&#39;-diphosphate, diphosphate 3&#39;-(ppGpp), או guanosine 5&#39;-טריפוספט, diphosphate 3&#39;-(pppGpp), 0.1 מ&quot;מ pyridoxal 5&#39;-פוספט (PLP), ו - 1 mM β-mercaptoethanol / (β-ME). 1 מ&quot;ל של B פתרון המורכב נתרן 100 mM MES-pH 6.5, 0.1 מ&quot;מ PLP, 1 mM β-ME, ו - 50 ננומטר LdcI. LdcI היה מטוהרים כמתואר סניידר et al. 6 ו Kanjee et al. 14. 1 מ&quot;ל של C הפתרון הזהה ל-B אך הפתרון אינו מכיל LdcI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של הפתרון להפסיק המורכב נתרן קרבונט M 1 (10.6 g/100 מ&quot;ל) ו aliquot 50 μL לבאר כל צלחת 96-באר קלקר באמצעות פיפטה רב ערוצי. הוסף 30 μL מים לצלחת ואז לכסות. שים לב כי סכום של נפח המים הוסיף נפח מדגם שחולצו במהלך התגובה חייב אנזים שווה 50 μL. במקרה זה, 20 μL המדגם התגובה אנזים יוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של תמיסת TNBS על 10 מ&quot;מ על ידי דילול 294 μL של 5% (w / v) מניות TNBS עם מים לעטוף μL 4706, בנייר אלומיניום ולשמור על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את התרמוסטט Eppendorf פלוס בשעה 37 ° C. פלוס תרמוסטט יש 24 בארות 6 עמודות. ראה איור 2 עבור סכמטית. 1.5 תווית מ&quot;ל Eppendorf צינורות המציין את זהותו של נוקלאוטיד כי תיבחן (אחד לכל עמודה): GTP (עמודה A), התוצר המקומי הגולמי (עמודה B), ppGpp (עמודה C), pppGpp (עמודה D), לא נוקלאוטיד (E עמודה ), דגימות חלבון (עמודה F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Rack כמה קופסאות של 200 טיפים μL כך שכל שורה חלופי מושמט נותן סך של ארבע שורות של עצות. זה הכרחי לשימוש פיפטה רב ערוצי עם תרמוסטט פלוס heatblock במהלך assay האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן דיגיטלי Heatblock (VWR) בשעה 42 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים 96-גם צלחת 2.0 מ&quot;ל פוליפרופילן על הקרח להתקרר. </li></ol> 2) LdcI Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 50 Aliquot μL של פתרון עם נוקליאוטידים מתאימים 1.5 צינורות מ&quot;ל Eppendorf בכל אחד מחמשת עמודי התרמוסטט Eppendorf. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 330 μL של B פתרון לשלושה צינורות F טור ולהוסיף 330 μL הפתרון C (שליטה ללא חלבון) אל הצינור הסופי בעמודה F. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הפתרונות על 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. טיפ: לאחר 5 דקות, לנתק את כמוסות של הצינורות במרכז הבלוק חימום כדי למנוע מהם להפריע פיפטה רב לשמש הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש VWR μL 5-50 מרובת ערוצים פיפטה, 50 μL העברת צינורות בפה טור לתוך אחד הצינורות בעמודות AE. הפעל את שעון העצר ברגע הצינור הראשון הוא מעורב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב 2, 4 ו 6 דקות להסיר 20 μL המדגם באמצעות פיפטה רב ערוצי ולהוסיף הפתרון להפסיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: דגימות פתרון להפסיק יכול להיות מכוסה בניילון קפוא ב -20 ° C לעיבוד שלאחר מכן. הצלחות יש להפשיר בטמפרטורת החדר לפני תגובה עם TNBS. </li></ol> 3) TNBS תגובת ופיתוח צבע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של פתרון 10 mM TNBS לפתרון להפסיק את השימוש הרב ערוצית פיפטה ואז לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. הפתרון יהפוך צבע צהוב / כתום כהה כמו TNBS מגיב עם ליזין לבין קדברין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 6 דקות, לצנן את הצלחת על קרח כדי להאט את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 100 μL של המדגם באמצעות 20-200 VWR פיפטה μL מרובת ערוצים ומניחים את צלחת 2 מ&quot;ל עמוק היטב כי היה מקורר על הקרח. העברת קרח בדלי כדי fumehood. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 500 μL טולואן זה גם באמצעות HandyStep (מותג) pipettor לחזור ו 12.5 מ&quot;ל פיפטה קצה (Plastibrand). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבי את כל טולואן עודף באמצעות kimwipe ולכסות את הצלחת עם רצועות של סרט האריזה. הקפד ולחץ בחוזקה כלפי מטה כדי לקבל חותמת טוב. מכסים את צלחת 96-היטב עם מכסה שטוח ולאחר מכן ללחוץ בחוזקה במשך דקה 1 ו 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו הפתרונות להתיישב במשך 5 דקות. TNP-קדברין כעת בשלב טולואן העליון, בעוד TNP-ליזין נשאר מסיס במים (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 200 μL של טולואן באמצעות פיפטה 20-200 μL רב ערוצי לתוך צלחת 96-היטב לקריאה. הערה: הקפד לבדוק שכל מדגם סולקו ברורה אין שום שלב מימית בתחתית. הערה: מחסום להשתמש טיפים כדי למנוע נזק רב ערוצי פיפטה של ​​טולואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרא את ספיגת ב 340 ננומטר קורא SpectraMax 340 צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנקות את הצלחת קוורץ, לשטוף את טולואן עם מים במקום צלחת קוורץ גדולמגש זכוכית בשכונה קטר. יוצקים מעל 100 מ&quot;ל של תערובת 07:03 של 70% (v / v) חומצה חנקתית: 95% (v / v) אתנול לכסות את הצלחת קוורץ עם מגש הזכוכית השני. אזהרה: התגובה היא הגנה ללבוש אקסותרמית מאוד נפיץ לפעמים מתאימים להבטיח כי אבנט ברדס עשן מוגדר הרמה הנמוכה &quot;6 אחרי קירור, לשטוף חומצה חנקתית עם מים ואז אתנול 95%.. </li></ol> 4) נציג תוצאות 1) קדברין רגיל Curve (איור 3) Assay בוצע כמתואר אך ללא L-ליזין או LdcI וריכוזים שונים במקום קדברין שימשו כדי לקבוע באופן אמפירי את הטווח הליניארי של assay. Assay היה ליניארית OD 340 של 0.25, המקביל ל ~ 22 nmoles של קדברין (איור 3). 2) פעילות LdcI (איור 4) הפעילות של LdcI לבד היה נחוש בדעתו להיות 153.5 (± 18.1) nmoles קדברין min-1 מיקרוגרם LdcI-1 ב-pH 6.5. פעילות LdcI אינו מושפע בנוכחות 100 מיקרומטר GTP או התמ&quot;ג אך הוא חזק עכבות (&gt; 10 פי) בנוכחות pppGpp ו ppGpp (איור 4). <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. תרשים סכמטי של התגובה LdcI. התגובה decarboxylation של L-ליזין לייצר CO 2 ו קדברין מוצג כמו גם התגובה הבאים עם TNBS ב-pH גבוה כדי לייצר N, N&#39;-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N &quot;-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין). בהתבסס על et Phan al.11 <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. ההתקנה של טרמוסטט Eppendorf. הפריסה של דגימות התרמוסטט Eppendorf 24 גם מוצג יחד עם תיאור של הצעדים של assay (מסומן באותיות מודגשות). החצים מצביעים על העברת התגובה פתרונות על פי הפרוטוקול. הסרת פתרון התגובה לפתרון להפסיק בצלחת 96-טוב מצוין גם. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. קדברין Curve רגיל. העלילה של ספיגת ב 340 ננומטר לעומת nmoles של קדברין מוצג. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שלוש מדידות עצמאיות. הקו של בכושר הטוב ביותר מוצג גם ויש לו R2 של 0.996. <img src="/files/ftp_upload/2094/2094fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. תוצאות LdcI assay. חלקת קצב הפעילות LdcI (ב nmoles קדברין המיוצר min-1-1 מיקרוגרם LdcI) מוצגת נוכחותם של 100 מיקרומטר GTP, תוצר, pppGpp, ppGpp ובהעדר של נוקלאוטיד. נוקלאוטידים תגובה מחמירים (p) ppGpp מסוגלים פעילות LdcI עיכוב משמעותי. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שש מדידות עצמאיות.

<ol>
	<li>Gale, E. F., Epps, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+the+pH+of+the+medium+during+growth+on+the+enzymic+activities+of+bacteria+(Escherichia+coli+and+Micrococcus+lysodeikticus)+and+the+biological+significance+of+the+changes+produced.">The effect of the pH of the medium during growth on the enzymic activities of bacteria (Escherichia coli and Micrococcus lysodeikticus) and the biological significance of the changes produced.</a> Biochem J. 36, 600-618 (1942).</li><li>Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+acid+resistance:+tales+of+an+amateur+acidophile.">Escherichia coli acid resistance: tales of an amateur acidophile.</a> Nat Rev Microbiol. 2, 898-907 (2004).</li><li>Castanie-Cornet, M. P., Penfound, T. A., Smith, D., Elliott, J. F., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+acid+resistance+in+Escherichia+coli.">Control of acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 181, 3525-3535 (1999).</li><li>Iyer, R., Williams, C., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine-agmatine+antiporter+in+extreme+acid+resistance+in+Escherichia+coli.">Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 185, 6556-6561 (2003).</li><li>Sabo, D. L., Boeker, E. A., Byers, B., Waron, H., Fischer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+physical+properties+of+inducible+Escherichia+coli+lysine+decarboxylase.">Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase.</a> Biochemistry. 13, 662-670 (1974).</li><li>Snider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+distinctive+complex+between+the+inducible+bacterial+lysine+decarboxylase+and+a+novel+AAA++ATPase.">Formation of a distinctive complex between the inducible bacterial lysine decarboxylase and a novel AAA+ ATPase.</a> J Biol Chem. 281, 1532-1546 (2006).</li><li>Kashiwagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+the+genes+for+putrescine+transport+protein+and+ornithine+decarboxylase+at+16+min+on+Escherichia+coli+chromosome.">Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome.</a> J Biol Chem. 266, 20922-20927 (1991).</li><li>Schneider, G., Kack, H., Lindqvist, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+manifold+of+vitamin+B6+dependent+enzymes.">The manifold of vitamin B6 dependent enzymes.</a> Structure. 8, 1-6 (2000).</li><li>Cashel, M., Gentry, D. R., Hernandez, V. J., Vinella, D., Curtiss, R., Neidhardt, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Escherichia coli and Salmonella : cellular and molecular biology. , 1458-1496 (1996).</li><li>Magnusson, L. U., Farewell, A., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ppGpp:+a+global+regulator+in+Escherichia+coli.">ppGpp: a global regulator in Escherichia coli.</a> Trends in Microbiology. 13, 236-242 (2005).</li><li>Phan, A. P., Ngo, T. T., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+assay+for+lysine+decarboxylase.">Spectrophotometric assay for lysine decarboxylase.</a> Anal Biochem. 120, 193-197 (1982).</li><li>Park, Y. K., Bearson, B., Bang, S. H., Bang, I. S., Foster, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Internal+pH+crisis,+lysine+decarboxylase+and+the+acid+tolerance+response+of+Salmonella+typhimurium.">Internal pH crisis, lysine decarboxylase and the acid tolerance response of Salmonella typhimurium.</a> Mol Microbiol. 20, 605-611 (1996).</li><li>Merrell, D. S., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cadA+gene+of+Vibrio+cholerae+is+induced+during+infection+and+plays+a+role+in+acid+tolerance.">The cadA gene of Vibrio cholerae is induced during infection and plays a role in acid tolerance.</a> Mol Microbiol. 34, 836-849 (1999).</li><li>Kanjee, U., Gutsche, I., Alexopoulos, E., Zhao, B., Bakkouri, M. E. l., Thibault, G., Liu, K., Ramachandran, S., Snider, J., Pai, E. F., Houry, W. A., A, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linkage+between+the+Bacterial+Acid+Stress+and+Stringent+Responses+Revealed+by+the+Structure+of+the+Inducible+Lysine+Decarboxylase.">Linkage between the Bacterial Acid Stress and Stringent Responses Revealed by the Structure of the Inducible Lysine Decarboxylase.</a> EMBO Journal. 30, 931-944 (2011).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

ב assay decarboxylase ליזין, TNBS הוא הגיב עם אמינים העיקרי של L-ליזין קדברין כדי ליצור TNP-ליזין TNP-קדברין adducts (איור 1). בשל נוכחותם של הקבוצה חומצה carboxylic על TNP-ליזין, adduct זה נשאר מסיסים במים בעוד TNP-קדברין, חסרה הקבוצה חומצה carboxylic, הוא מסוגל מחיצות לתוך טולואן 11. סוג זה של assay יכול להיות מנוצל באופן נרחב יותר על סוגים אחרים של חומצות האמינו שבו הפסד של קבוצת חומצה carboxylic מתרחשת במהלך התגובה. זו מתרחשת במהלך decarboxylation של ornithine-L על ידי SpeF ועין מתנהלת ornithine decarboxylase לטופס putrescine polyamine 7 ואת decarboxylation של ארגינין L-ארגינין ועין מתנהלת על ידי decarboxylase עדיה לטופס agmatine polyamine 4. Assay LdcI המתואר כאן מספק שיטה מהירה יחסית לקביעת הפעילות של החלבון במבחנה מטוהרים. היתרונות העיקריים של assay זה הם: I) שימוש מרובים משכפל לכל הניסוי משפרת את דיוק המדידה כל אחד; ii) assay עשוי להתבצע על פני טווח רחב של מצבים חיץ (pH מלח שונים, צמצום סוכן וכו &#39;) ללא שינוי של הפרוטוקול; iii) assay עשוי להיות שונה למדידת פעילות vivo של LdcI על ידי קביעת כמות קדברין מופרש במהלך גדילת התאים. המגבלות העיקריות של assay זה הם: ט) הרגישות של הניסויים מוגבלים על ידי בטווח הליניארי של ספיגת של TNP-adducts; ii) מדרגות עיבוד רבות להגדיל את גודל שגיאות הניסוי; ג) לא כל decarboxylases חומצת אמינו ניתנים לסוג זה של פרוטוקול. לדוגמה, decarboxylation של חומצה גלוטמית L-על ידי חומצה גלוטמית decarboxylases ועין מתנהלת GadA / GadB מייצר γ-amino acid-butyric 2, TNBS-adduct אשר יהיה מסיס במים בשל נוכחותם של חומצה בצד שרשרת carboxylic קבוצה. החקירה ביוכימיים תגובת חומצה הלחץ של E. coli הוא אזור הרחבת המחקר יאפשר לנו להבין טוב יותר את הבסיס המולקולרי של התגובה ללחץ E. coli הקשורים γ-proteobacteria דומה כי יש מתח חומצה בתגובה מערכות כגון סלמונלה enterica serovar Typhimurium 12 ו ויבריו כולרה 13. הגילוי כי פעילות LdcI מעוכבת על ידי ppGpp תגובה מחמירים הרגולטור סיפק לנו תובנה ידועה קודם לכן אל תקנה של חלבון זה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P2297</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.1 mM pyridoxal 5'-phosphate (PLP)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>P9255</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cadaverine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich</td>
<td>D22606</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96 well polystyrene plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sarstedt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>96-well quartz plate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Hellma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>VWR Digital Heatblock</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ThermoStat Plus</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2.0 mL 96-well polypropylene plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Axygen</td>
<td>P-DW-20-C</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Handy Step Repeat Pipettor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brand</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12.5 mL Repeat Pipettor Tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Brand (Plastibrand)</td>
<td>702378</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SpectraMax 340PC Plate Reader</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SpectraMax</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an assay for measuring the activity of escherichia coli inducible lysine decarboxyase

Escherichia coli הוא חיידק enteric כי הוא מסוגל לגדול על פני טווח רחב של ערכי ה-pH (pH 5-9) 1, לא ייאמן, הוא מסוגל לשרוד חומצה קיצונית מדגיש כולל מעבר דרך הקיבה יונקים שבו pH יכול ליפול נמוך כמו pH פבואר 01-02. כדי לאפשר כזה מגוון רחב של הישרדות pH חומצי, א coli בעלת ארבעה שונה ועין מתנהלת חומצה אמינית decarboxylases כי המצע שלהם decarboxylate חומצות אמינו בצורה פרוטון תלויי ובכך להעלות את ה-pH הפנימי. Decarboxylases כוללים חומצה גלוטמית decarboxylases GadA ו GadB 3, decarboxylase ארגינין עדיה 4, decarboxylase ליזין LdcI 5, 6 ו decarboxylase ornithine SpeF 7. כל אנזימים אלה לנצל pyridoxal-5&#39;-phospate כגורם משותף 8 ולתפקד יחד עם המצע מוצר antiporters-הקרום הפנימי להסיר מוצרים decarboxylation למדיום חיצוני תמורת מצע טרי 2. במקרה של LdcI, antiporter ליזין-קדברין נקרא CadB. לאחרונה, אנו נקבע את מבנה רנטגן של גביש LdcI ל 2.0, ואנו גילו מולקולה קטנה, רומן חייב LdcI התגובה מחמירים הרגולטור guanosine 5&#39;-diphosphate, diphosphate 3&#39;-(ppGpp) 14. התגובה מחמירים מתרחשת כאשר התאים גדל באופן אקספוננציאלי ניסיון חסך תזונתי או אחת למספר מדגיש אחרים 9. כתוצאה מכך, התאים לייצר ppGpp שמוביל מפל איתות ששיאה במעבר גידול מעריכי לגידול שלב נייח 10. אנחנו הוכיחו כי ppGpp הוא מעכב ספציפי של LdcI 14. כאן אנו מתארים את assay decarboxylase ליזין, שונה מן assay שפותחה על ידי Phan et al. 11, שיש לנו כדי לקבוע את הפעילות של LdcI והשפעת pppGpp / ppGpp על פעילות זו. התגובה decarboxylation LdcI מסיר את קבוצת α-carboxy של L-ליזין מייצרת פחמן דו חמצני קדברין polyamine (1,5-diaminopentane) 5. L-ליזין קדברין ניתן הגיבו 2,4,6-trinitrobenzensulfonic חומצה (TNBS) ב-pH גבוה כדי לייצר N, N&#39;-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N&#39;-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין), בהתאמה 11. TNP-קדברין ניתן להפריד TNP-ליזין כמו לשעבר הוא מסיס בממסים אורגניים כגון טולואן בזמן האחרון הוא לא (ראו תרשים 1). טווח ליניארי של assay נקבע באופן אמפירי באמצעות מטוהרים קדברין.

Watch this Scientific Journal Video about An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase at JoVE.com

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

an-assay-for-measuring-activity-escherichia-coli-inducible-lysine

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

14.1K Views.  University of Toronto. הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.

Video: An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

מדידת קשיחות כיפוף של תאים חיידקיים באמצעות מלכודת אופטית

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

הקרנת תפוקה גבוהה של פעילות Endoglucanase פטרייתיים ב Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

יישום MassSQUIRM עבור מדידות כמותיות של פעילות Demethylase ליזין

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

ראפיד פרוטוקול להכנת Electrocompetent<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; ו<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

פרוטוקולים ליישום<em&gt; חיידקי Escherichia</emמערכת&gt; בהתבסס TX-TL סלולרי ללא ביטוי של ביולוגיה סינתטית

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

איתור של שידור חי<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; O157: H7 תאים על ידי PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

תועלת רבה פנים של Co-ביטוי חלבון ב<em&gt; Coli Escherichia</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

שאריות ספציפיות התאגדות של חומצות אמינו Noncanonical לחלבוני דגם שימוש<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; חינם-Cell מערכת-תמלול תרגום

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

מדידת פעילות אנזימטי לקטאז במעבדת ההוראה

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...