עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 HG002995 &quot;עיבדו את הגנום דג הזברה: גישה הפוכה גנטיקה&quot; כדי CBM.

חלק א &#39;: פתרונות הקפאת זרע 1. גינסברג דגים האצבעות (לעשות טרי כל 3 ימים; גינזבורג, 1963) הערה: הזמנה של תוספת IS חשוב למנוע רטיבות בשנת 450 מ&quot;ל סטרילי ddH2O לפזר: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaCl 3.25 גרם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.125 גרם KCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaCl2 • 2 H2O 0.175 גרם ואז להוסיף: </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> NaHCO3 0.10 גרם </li></ul> תביאו נפח סופי 500 מ&quot;ל עם ddH2O חנות סטרילית ב 4 ° C. 2. בינוני הקפאה (בצע יומי טרי) <ol style="list-style-type:lower-roman;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא מתנול <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גינזבורג אצבעות דגים 10 מ&quot;ל (טמפ החדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת חלב רזה 1.5 גרם </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מתנול הערה: הזמנה של תוספת IS חשוב למנוע רטיבות <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים גינזבורג אצבעות 9 מ&quot;ל (טמפ &#39;חדר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתנול 1 מ&quot;ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבקת חלב רזה 1.5 גרם </li></ul> לאחר הרכבת התקשורת מקפיא, ומערבבים היטב במשך 20 דקות. על ההקפה שייקר או נדנדה. לפני השימוש, aliquot לתוך צינורות 1 מ&quot;ל Eppendorf, הימנעות בועות על פני השטח. </li></ol> חלק ב &#39;: חומרים הדרושים הקפאת זרע חומרים הדרושים הקפאת זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 pipettes הפנויה μl (חתול Fisherbrand # 22-358697) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוסות 250 מ&quot;ל מים דגים המכיל MESAB / Tricaine </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצפות כוסות (חתול פיירקס # 9985-75) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> P20 pipetman (או שווה ערך) טיפים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספוג בעל דגים (להחזיק זכר תוך סחיטה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ עם תאורה מעל הבמה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקחיים שטוחים (למשל סוג Millipore) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.0ml קריוגני בקבוקונים (קורנינג חתול # 430488) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10X10 cryoboxes (Nalgene חתול # 03-337-7AA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלקר מיכל מלא ~ 15 ס&quot;מ של ice1 יבש כתוש דק </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 15 מ&quot;ל חרוטי צינורות (פלקון # 352099) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דיואר בקבוקון המכיל חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לונג מלקחיים (למשל CMS פישר חתול בריאות # 10-316B) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryogloves </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחזור טנק לגברים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת צינור Eppendorf מלא עם התקשורת ללא הקפאה מתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחת צינור Eppendorf מלא עם התקשורת הקפאה עם מתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryofreezer (למשל טיילור Warton-K-series) </li></ol> 1 שיטה פשוטה להכנת קרח יבש כתוש דק הוא לעטוף אותו במגבת לכתוש אותו עם פטיש. שיטה יעילה יותר היא להשתמש במטחנת קרח יבש, למשל מודל קלוסון RE-2. חלק ג&#39;: שיטת הקפאת זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרק צינורות נימי: לפני ההתחלה, לסמן את צינורות נימי 10μl עם עט במעבדה ברמה של μl 3.33 (כלומר 16.7 מ&quot;מ מלמטה; איור 1.1).. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים זכר: זכר מקום (ות) בכוס המכילה MESAB / tricaine מדולל במים דגים (מתכון של &quot;ספר דג הזברה&quot;) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים מיובשים: הרדים פעם, להרים דג מחוץ הרדמה בעזרת כף פלסטיק בעדינות כתם דג יבש על מגבת נייר, תשומת לב מיוחדת ייבוש בצד הגחון. מי מפעיל זרע כך חשוב ביסודיות יבש סביב הביב. מיקום דגים מחזיק ספוג, למעלה בצד הגחון (איור 1.2). אם האזור מסביב סנפיר אנאלי עדיין לח, יבש בעדינות עם kimwipe. יש להיזהר שלא לסחוט זרע בטרם עת! </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום מסומן צינור נימי מתאם הפה גומי פיפטה הכלול צינורות נימי. המתאם הוא צינור גומי בעל שופר בצד אחד בעל נימי מאידך. לחילופין, צינור נימי ניתן לחבר מזרק המילטון 50μl באמצעות פיסת קצר tygon צינורות בקוטר המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום זכר תחת היקף ולחשוף את פתיחת ואברי המין בקפידה על ידי הפצת סנפירי גחון בנפרד באמצעות קצה צינור נימי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוספים זרע: לגרש זרע ידי מלטפים בעדינות את צידי הדג עם מלקחיים חלקה (למשל Millipore), או על ידי לוחץ בעדינות את צידי הדג בין האצבע המורה והאגודל. איסוף הזרע בתוך צינור נימי כפי שהוא גירש באמצעות שאיבה עדינה (איור 1.2). הימנע צואה שעשויים להיות מגורש עם הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל את נפח הזרע 3.3 μl: אם את נפח מגיע ל זרע, או עולה סימן עט על צינור נימי (כלומר 16.7 מ&quot;מ או יותר), ולאחר מכן המשך לשלב 8. אם נפח הזרע אינו מגיע בנפח היעד, ואז לנרמל נפח לסמן באמצעות עט בינוני להקפיא ללא מתנול (איור 1.3). הסכום המינימלי של זרע כי מקובל משתנה עם איכות הזרע. הזרע הטוב הוא לבן אטום. זרע ירודה נראית מימית. באופן כללי, אנחנו מקבלים כמו מינימום: 1 זרע טוב μl (או 1 / 3 יעד) ו 2 הזרע עני μl (או 2 / 3 היעד). נפח הוא מנורמל כעת μl 3.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ADD CRYOPROTECTANT לזרע: להתחנף בינוני מקפיא עם מאתנול את סימן כתום (נפח כ הכולל הוא עתה 20 μl;. איור 1.4). לגרש תערובת זרע cryoprotectant על שטח נקי של זכוכית שעון, תשומת לב מיוחדת לא להכניס בועות. לערבב בעדינות על ידי pipetting למעלה ולמטה ~ 4 פעמים (למנוע החדרת בועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום 10μl הזרע אל כל אחד 2 CRYOVIALS: פיפטה 10 μl של הזרע: פתרון cryoprotectant לתוך התחתון של שני cryovials נפרד סומנו בתווית עם מידע רלוונטי (איור 1.5). נע במהירות, מבחנות כובע ושחרר אותם בתחתית בטמפרטורת החדר 15 מ&quot;ל פלקון צינורות אחד cryovial / צינור. שווי פלקון צינור והכנס את זוג cryovial המכילים צינורות פלקון לתוך קרח יבש כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקפאת זרע 20 דקות. על קרח יבש: קרח יבש צריכים להיות בצורת אבקה דקה, לא כדורי. צינורות צריך להיות מוכנס לתוך הקרח היבש עמוק מספיק שרק כמוסות שלהם להראות (איור 1.6). כדי לעקוב אחר צינורות קרח יבש, לתת לכל זוג צינורות פלקון מספר 1-20 (שנכתב על כמוסות) ולהקליט את הזמן הם נכנסים קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CRYOVIALS המקום לבית חנקן נוזלי:. אחרי הזרע הוקפאה על קרח יבש במשך 20 דקות, ולהעבירם המכילים חנקן נוזלי בקבוק ויסקי. הזרע מאוחסן כאן עד למקום למקפיא חנקן נוזלי. כאשר הנחת בתיבות במקפיא, המקפיא מקום בתיבה בתוך אמבט של חנקן נוזלי, כך דגימות לא לחמם. שימוש במלקחיים מתכת ארוכה כדי להתאושש צלוחיות מבקבוקון ויסקי ולהתמודד עם cryogloves. לחלופין, cryovials ניתן להעביר ישירות לתוך תיבת במקפיא של קרח יבש אם תיבת במקפיא נשמר שקוע חנקן נוזלי במיכל קלקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryovials חנות ארוך טווח הקפאה בחנקן נוזלי קריוגני. כדי לשמור על יכולת הקיום של זרע, חשוב צלוחיות מאוחסנים שקוע חנקן נוזלי. מניסיוננו, צלוחיות מאוחסן בשלב אדי לאבד את יכולת הקיום לאורך זמן. מהירות חשוב! הזמן בין הוספת cryoprotectant ומיקום מבחנות הזרע קרח יבש (כלומר צעדים 60-10) צריך להיות לא יותר מ 30 שניות. </li></ol> חלק ד &#39;: שיטה הפריה במבחנה באמצעות זרע Cryopreserved אנו מוצאים כי זה עובד הכי טוב עם שני אנשים. אדם אחד סוחטת ביצים מן הנקבות, ואילו אדם אחר מפשירה את הזרע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סט אמבטיה מים 33 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר cryovial מהמקפיא חנקן נוזלי כדי להעביר חנקן נוזלי המכיל עד בקבוק ויסקי מוכן להפשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסחוט מן הנקבות ביצים לתוך צלחת פטרי 35mm פלסטיק. אם אפשר, לנסות להשיג 3 מצמדים של ביצים לשלב לתוך צלחת אחת. אם אתה לא יכול לקבל שלוש הטלות טוב בתוך דקות 1 של המצמד הראשון שלך, ואז להמשיך לשלב 4 (אחד מצמד טוב מספיק). הגדרה של המצמד טוב:&gt; 150 ביצים נחמד להסתכל אחיד (צהבהב, כלומר בפסולת לא לבן מעיד על השפלה). שמור על צלחת מכוסה בעוד הזרע מופשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של חנקן נוזלי ולהסיר הכובע. בקבוקון לטבול במהירות ~ 1 / 2 הדרך אל 33 ° C אמבט מים במשך 8-10 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות 70 μl בטמפרטורת החדר הנקס על הבקבוקון ומערבבים ידי pipetting למעלה ולמטה. מיד מוסיפים ביצים ומערבבים בעדינות עם קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללא דיחוי, להפעיל זרע וביצים על ידי הוספת 750 μl מים ודגים. מערבולת לערבב. דגירה 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 5 דקות, למלא צלחת עם מים דגים צלחת לדגור על 28 ° C. לאחר 2-3 שעות, ספירה והעברת עוברים פורייה למנות 100mm (50/dish). הרוזן ביצים פוריות, כך תדירות הפריה ניתן לקבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשמרי על עצמך טוב של הזחלים! במשך 5 הימים הראשונים, שינוי יומי מים ולהסיר עוברים מתים. שים הזחלים רק כי יש שלפוחיות לשחות לחדר הילדים ביום 5. </li></ol> חלק ה: נציג תוצאות השתמשנו במתודולוגיה זו crypreservation לעשות ספריה של 8600 דגימות זרע קפוא לעבד בין השנים 2001 ו - 2003. יש לנו מופשר 106 דגימות אלה וקבע הפוריות שלהם. פריון הוא היחס בין העוברים קיימא המיוצרים הפריה חוץ גופית ב מחולק במספר הכולל של ביצים שהיו מופרות עם הזרע הקפוא. טרי (לא cryporeserved) זרע בדרך כלל יש&gt; פוריות 95%; זרע cryopreserved יש פוריות נמוכה הרבה יותר: ממוצע של 29% (n = 106 בקבוקונים). השתנות הבקבוקון אל הבקבוקון בפריון הוא גדול, החל פחות מ -1% ל גבוה ככל 62%. השתנות זו מיוצגת על ידי הסורגים שגיאה גדולה המייצג סטיית תקן באיור. 2. עם זאת ב 106 דגימות זרע מופשר עד כה חווינו רק פעם אחת 0% פוריות הן דגימות הזרע הצליחו לשחזר את המוטציה לעבד המקביל. לפי הפשרה מבחנות הזרע מהספרייה שלנו במשך מספר שנים (2001-2008) מצאנו כי הפריון הממוצע של דגימות זרע קפוא בשיטה זו נותרתלאורך זמן יציבה (איור 2). הפריון הממוצע של דגימות זרע קפוא מופשר בשנת 2001 היה 23.5% (בהתבסס על 11 דגימות זרע) ובשנת 2008 היה 25% (בהתבסס על 21 דגימות זרע). מספר חוקרים אחרים כיום באמצעות פרוטוקול זה הקפאת זרע במעבדות שלהם. אחדים דיווחו על הצלחה טובה עם שיעורי פריון המדגם ל-מדגם השתנות דומה למה צפינו. אחרים נכשלו הדיווחים לבצע פרוטוקול עבודה זה בידיהם. אנו מאמינים כי מקורות סביר של בעיות הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש cryovials המדויק או צינורות חרוטי שהצענו בפרוטוקול, המוביל שיעור שונה של קירור כאשר בקרח יבש; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש בקרח יבש אבקת, המוביל שיעור תת אופטימלית קירור; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגים זכרים עם עניים פוריות: אתה צריך לקבל לפחות 1 μl של זרע גברי אחד. ניתן גם לבדוק את פוריות הגבר על ידי ביצוע הפריה חוץ גופית עם זרע טרי, אולם זה יכול להיות מטעה כי זה לוקח זרע טרי מעט מאוד להתקרב פוריות 100%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תת תקן איכות הביציות בהפריה חוץ גופית בבית. באמצעות כל דבר אבל מצמדים מושלמת תמיד מוביל ליד פוריות 0%, אפילו דגימות זרע כי למעשה יש פריון טוב (מבוסס על הפוריות של הבקבוקון כפולות). </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. סכמטי של מתודולוגיה הקפאת זרע. <img src="/files/ftp_upload/1395/1395fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Cryopreserved פוריות הזרע נשאר יציב לאורך זמן. פוריות אחוז הוא מספר עוברי קיימא המיוצרים הפריה חוץ גופית ב מחולק במספר הכולל של ביצים שהיו מופרית עם זרע קפוא. &quot;N&quot; מתייחס למספר צלוחיות של זרע cryopreserved אשר פוריות נבדק בשנה המקבילה. ברים שגיאה מייצגים סטיית התקן. מאז כל בקבוקון זרע הוא מן זכר אחר, בקבוקון ל-בקבוקון השתנות הוא ציין.

<ol>
	<li>Ginsburg, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-egg+association+and+its+relationship+to+activation+of+the+egg+in+salmonid+fishes.">Sperm-egg association and its relationship to activation of the egg in salmonid fishes.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 11, 13-33 (1963).</li><li>Harvey, B., Kelley, R. N., Ashwood-Smith, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+zebra+fish+spermatozoa+using+methanol.">Cryopreservation of zebra fish spermatozoa using methanol.</a> Can. J. Zoology. 60, 1867-1870 (1982).</li></ol>

מספר חוקרים אחרים כיום באמצעות פרוטוקול זה הקפאת זרע במעבדות שלהם. אחדים דיווחו על הפוריות דומה ואת השתנות מדגם זהה ל-לדוגמה ראינו. אחרים נכשלו הדיווחים לבצע פרוטוקול עבודה זה בידיהם. אנו מאמינים כי מקורות סביר של בעיות הם: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש cryovials המדויק או צינורות חרוטי שהצענו בפרוטוקול, המוביל שיעור שונה של קירור כאשר בקרח יבש; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אי להשתמש בקרח יבש אבקת, המוביל שיעור תת אופטימלית קירור; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דגים זכרים עם עניים פוריות: אתה צריך לקבל לפחות 1 μl של זרע גברי אחד. ניתן גם לבדוק את פוריות הגבר על ידי ביצוע הפריה חוץ גופית עם זרע טרי, אולם זה יכול להיות מטעה כי זה לוקח זרע טרי מעט מאוד להתקרב פוריות 100%. גדולה יותר, הזכרים צבעוניים יותר וחסונה בדרך כלל לתת זרע באיכות גבוהה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תת תקן איכות הביציות בהפריה חוץ גופית בבית. באמצעות כל דבר אבל מצמדים מושלמת תמיד מוביל ליד פוריות 0%, אפילו דגימות זרע כי למעשה יש פריון טוב (מבוסס על הפוריות של הבקבוקון כפולות). </li></ol>

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>10 &mu;l disposable pipettes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>22-358697</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Watch glasses</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pyrex</td>
<td>9985-75</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 ml cryogenic vials</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>430488</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 x 10 cryoboxes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nalgene</td>
<td>03-337-7AA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15 ml conical tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>352099</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tongs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Health Care</td>
<td>10-316B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cryofreezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Taylor-Warton</td>
<td>K-series</td>
<td>For example</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

a high-throughput method for zebrafish sperm cryopreservation and in vitro fertilization

זוהי שיטה cryopreservation זרע דג הזברה כי הוא עיבוד של שיטת הארווי (הארווי et al., 1982). יש לנו הציג שני שינויים בפרוטוקול המקורי הן לייעל את ההליך מדגם אחידות להגדיל. ראשית, עלינו לנרמל את כל אמצעי האחסון באמצעות מדיה הקפאת זרע כי אינו מכיל את cryoprotectant. זרע שנית, cryopreserved מאוחסנים cryovials במקום צינורות נימי. שיעורי זרע קפוא מפשיר (δ ° C / שעה) הם ככל הנראה שני המשתנים הקריטיים ביותר לשלוט בהליך זה. מסיבה זו, אין תחליף צינורות שונים לאלה שצוינו. עבודה בצוותים של 2 אפשר להקפיא את הזרע של 100 גברים לכל צוות ~ 2 שעות. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% בפריון (כפי שנמדד במספר העוברים קיימא שנוצר הפריה חוץ גופית מחולק במספר הכולל של ביציות מופרות) וזה פוריות אחוז יציב לאורך שנים רבות.

Watch this Scientific Journal Video about A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization at JoVE.com

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.

שיטת תפוקה גבוהה עבור cryopreservation זרע דג הזברה במבחנה הפריה

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

a-high-throughput-method-for-zebrafish-sperm-cryopreservation-vitro

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

30.9K Views.  University of California, Davis. זהו תפוקה גבוהה cryopreservation זרע פרוטוקול דג הזברה. זרע cryopreserved בפרוטוקול זה יש ממוצע של 25% פוריות הפריה חוץ גופית לאחר מכן והוא יציב לאורך שנים רבות.

Video: A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

שיטת תפוקה גבוהה ברחבי העולם כדי ללמוד את המורפולוגיה של אברון cerevisiae ס

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

שיטה מהירה תפוקה גבוהה עבור Ribonucleoproteins מיפוי (RNPs) על mRNA מראש אדם

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and hermaphrodites. In the earlier phase of gametogenesis, the germ cells of hermaphrodites differentiate into limited number of sperm - around 300 - and are stored in a small 'bag' called the spermatheca. Later on, hermaphrodites continually produce oocytes1. In contrast, males produce exclusively sperm throughout their adulthood. The males produce so much sperm that it accounts for &gt;50% of the total cells in a typical adult worm2. Therefore, isolating sperm from males is easier than from that of hermaphrodites.
Only a small proportion of males are naturally generated due to spontaneous non-disjunction of X chromosome3. Crossing hermaphrodites with males or more conveniently, the introduction of mutations to give rise to Him (High Incidence of Males) phenotype are some of strategies through which one can enrich the male population3.
Males can be easily distinguished from hermaphrodites by observing the tail morphology4. Hermaphrodite's tail is pointed, whereas male tail is rounded with mating structures.
Cutting the tail releases vast number of spermatids stored inside the male reproductive tract. Dissection is performed under a stereo microscope using 27 gauge needles. Since spermatids are not physically connected with any other cells, hydraulic pressure expels internal contents of male body, including spermatids2.
Males are directly dissected on a small drop of 'Sperm Medium'. Spermatids are sensitive to alteration in the pH. Hence, HEPES, a compound with good buffering capacity is used in sperm media. Glucose and other salts present in sperm media help maintain osmotic pressure to maintain the integrity of sperm.
Post-meiotic differentiation of spermatids into spermatozoa is termed spermiogenesis or sperm activation. Shakes5, and Nelson6 previously showed that round spermatids can be induced to differentiate into spermatozoa by adding various activating compounds including Pronase E. Here we demonstrate in vitro spermiogenesis of C. elegans spermatids using Pronase E.
Successful spermiogenesis is pre-requisite for fertility and hence the mutants defective in spermiogenesis are sterile. Hitherto several mutants have been shown to be defective specifically in spermiogenesis process7. Abnormality found during in vitro activation of novel Spe (Spermatogenesis defective) mutants would help us discover additional players participating in this event.

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

A protocol for isolating and activating spermatids from male C. elegans is described here. Cutting the posterior end of male releases spermatids. The spermatids can be activated by addition of protease.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

Males and hermaphrodites are the two naturally found sexual forms in the nematode C. elegans. The amoeboid sperm are produced by both males and ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice יתר: שיטה גידול ארבידופסיס צמחים עגבניות ב 96-פלטות היטב genotyping תפוקה גבוהה

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

תפוקה גבוהה התגבשות של חלבונים בממברנה שימוש בשיטה Lipidic Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

שיטת תפוקה גבוהה למדידה של קצב סינון הגלומרולרי בעכברים בהכרה

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for forward genetic analysis of developmental processes due to their external fertilization, embryonic size, rapid ontogeny, and optical clarity &#8211; a constellation of traits that enable the direct observation of events ranging from gastrulation to organogenesis with a basic stereomicroscope. Further, zebrafish embryos can survive for several days in the haploid state. The production of haploid embryos in vitro is a powerful tool for mutational analysis, as it enables the identification of recessive mutant alleles present in first generation (F1) female carriers following mutagenesis in the parental (P) generation. This approach eliminates the necessity to raise multiple generations (F2, F3, etc.) which involves breeding of mutant families, thus saving the researcher time along with reducing the needs for zebrafish colony space, labor, and the husbandry costs. Although zebrafish have been used to conduct forward screens for the past several decades, there has been a steady expansion of transgenic and genome editing tools. These tools now offer a plethora of ways to create nuanced assays for next generation screens that can be used to further dissect the gene regulatory networks that drive vertebrate ontogeny. Here, we describe how to prepare haploid zebrafish embryos. This protocol can be implemented for novel future haploid screens, such as in enhancer and suppressor screens, to address the mechanisms of development for a broad number of processes and tissues that form during early embryonic stages.

Production of Haploid Zebrafish Embryos by In Vitro Fertilization

The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.

ייצור של הפלואידים עוברי דג הזברה על ידי<em&gt; במבחנה</em&gt; הפריה

The zebrafish has become a mainstream vertebrate model that is relevant for many disciplines of scientific study. Zebrafish are especially well suited for ...

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

מסך ידני מולקולה קטנה מתקרב תפוקה גבוהה באמצעות עוברי דג הזברה

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

שחזור של לבבות למבוגרים דג הזברה עבור יישומי תפוקה גבוהה

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...