מיקרוסקופ כוח אטומי מדידות סחוס בגפיים אקסולוטליות שלמות ומתחדשות;

בפרוטוקול זה אנו מראים כיצד להכין רקמת אקסולוטל למיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ולבצע מדידות הזחה בסחוס גפיים שלם ומתחדש.

כוחות מכניים מספקים אותות חשובים לתפקוד תקין של תאים וליצירת תבניות ברקמות מתפתחות, ותפקידם נחקר רבות במהלך אמבריוגנזה ופתוגנזה. באופן יחסי, מעט מאוד ידוע על אותות אלה במהלך התחדשות בעלי חיים.

האקסולוטל הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר התחדשות, בהתחשב ביכולתו לשחזר באופן מלא איברים ורקמות רבים לאחר פציעה, כולל סחוס ועצם חסרים. בשל תפקידה המכריע כרקמה התומכת העיקרית בגוף החולייתנים, החזרת תפקוד השלד במהלך ההתחדשות דורשת הן את שיקום המבנים החסרים והן את תכונותיהם המכניות. פרוטוקול זה מתאר שיטה לעיבוד דגימות גפיים אקסולוטליות עבור מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM), שהוא תקן הזהב לבדיקת תכונות מכניות של תאים ורקמות ברזולוציה מרחבית גבוהה.

תוך ניצול יכולות ההתחדשות של האקסולוטל, מחקר זה מדד את נוקשות סחוס הגפיים במהלך הומאוסטזיס ושני שלבים של התחדשות גפיים: היסטוליזה של רקמות ועיבוי סחוס. אנו מראים כי AFM הוא כלי רב ערך להשגת תובנות לגבי ארגון מחדש דינמי של רקמות והשינויים המכניים המתרחשים במהלך רגנרציה.

השלד, בעיקר הסחוס והעצמות, מספק את התמיכה המכנית העיקרית לרקמות הרכות של הגוף אצל בעלי חוליות. לכן, כל נזק במערכת השלד עלול לפגוע מאוד בתפקוד ואף בהישרדות. אצל בני אדם, שברים בעצמות הם אחת הפציעות הטראומטיות הנפוצות ביותר¹, שרובן משתקמות תוך שבועות ספורים, אך 5%-10% מהן יסבלו מעיכובים בהחלמה או לעולם לא יתאוששו לחלוטין ^2,3. יתר על כן, בני אדם אינם מסוגלים להתאושש מאובדן עצם או סחוס נרחב ^4,5. עם זאת, חלק מהסלמנדרות יכולות לחדש מגוון מבני גוף, כולל גפיים מלאות⁶, מה שהופך אותן למודל אידיאלי לחקר התחדשות השלד.

אקסולוטל (שם מדעי: Ambystoma mexicanum) הוא סוג של סלמנדרה שבה התחדשות הגפיים נחקרה בהרחבה. תהליך זה מתרחש בארבעה שלבים עיקריים עוקבים אך חופפים: 1) ריפוי פצעים, 2) דלקת/היסטוליזה, 3) היווצרות בלסטמה, ו-4) צמיחת/התמיינות בלסטמה (נסקר^ב-7,8). לאחר הקטיעה, קרטינוציטים הגובלים באתר הפציעה נודדים במהירות, סוגרים את הפצע ויוצרים את אפיתל הפצע (WE). במהלך הדלקת וההיסטוליזה שלאחר מכן, פתוגנים מסולקים, פסולת ותאים פגומים מנוקים, והמטריצה החוץ תאית (ECM) מתחת לפני השטח לקטיעה משופצת⁹. היסטוליזה של רקמות חיונית להתחדשות הגפיים כדי להתרחש¹⁰, כאשר הפרשת אנזימים מפרקי חלבון חיונית לא רק לעיצוב מחדש של ECM כולל, אלא גם לשחרור התאים היוצרים את הבלסטמה ולמולקולות ביו-אקטיביות חופשיות הכלואות ב-ECM עצמו⁸. למעשה, מחקרים בהקשרים רגנרטיביים רבים ואורגניזמים מודל הראו כי התכונות החומריות הייחודיות של ECM במהלך היסטוליזה מסוגלות לגרום לתהליכי התמיינות או לכוון את נדידת התאים לעבר אתר הפציעה (נסקר ב^-11). יתר על כן, ספיגה מחדש של רקמה מסוידת בשלבים המאוחרים של היסטוליזה הוכחה כמפתח לאינטגרציה נכונה של אלמנטים חדשים של שלד הגפיים שנוצרו¹². לאחר שלב ההיסטוליזה, הבלסטמה נוצרת מתחת לאפיתל הפצע (WE) כהצטברות של אבות לא ממוינים, מרובי שושלות כתוצאה מתאי רקמה בוגרים שאינם ממוינים או תאי גזע תושבים. תאי בלסטמה מתרבים ומתמיינים לכל סוגי התאים החסרים. לבסוף, מורפוגנזה של הגפיים מתרחשת, שבה רקמת השלד מתחדשת באמצעות עיבוי של chondroprogenitors נגזר תאים periskeletal ו fibroblasts עורי transdifferentiated 13,14,15.

למרות שרבים מהרמזים הביוכימיים המווסתים שינויים בזהות התא ובהרכב ECM זוהו 10,13,14,16,17,18, התכונות המכניות של רקמות במהלך השלבים השונים של התחדשות הגפיים, כמו גם השפעתן על התחדשות, נותרו במידה רבה בלתי נחקרות. מחקרים רבים הראו כי תאים חשים ומשלבים רמזים מכניים המווסתים את גורלם והתנהגותם במספר הקשרים (נסקרו^ב-19,20). לכן, השלמת הידע התאי והמולקולרי שלנו על התחדשות גפיים עם מדידות מכניות של רקמות תשפר מאוד את הבנתנו את התהליכים הללו.

פותחו טכניקות שונות המאפשרות אפיון מכני ומניפולציה בכוח של דגימות ביולוגיות²¹. בין טכניקות אלה, מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) הפך לתקן הזהב במכנוביולוגיה, שבו התכונות הוויסקו-אלסטיות של דגימות ביולוגיות נבדקות ברזולוציה מרחבית גבוהה על ידי הזחה עם חיישן כוח רגיש במיוחד, AFM cantilever²². מאז טכניקה זו דורשת מגע ישיר עם הדגימה, בדרך כלל, פרוסות רקמה נוצרים, אשר יכול להיות מאתגר במקרים מסוימים. לכן, תנאי ההכנה צריכים להיות מותאמים ומותאמים לכל דגימה מסוימת, כך שהיא יכולה להישאר קרובה ככל האפשר לתנאים פיזיולוגיים וממצאים מינימליים נוצרים²³. פרוטוקול זה מתאר כיצד למדוד קשיחות רקמות בגפיים אקסולוטליות באמצעות AFM, תוך התמקדות ברקמות סחוס בתנאים שלמים, בזמן שהן עוברות היסטוליזה, ובשלבי עיבוי סחוס (איור 1 ואיור 2). שיטה זו עשויה להיות מורחבת גם למדידה של סוגי רקמות אחרים.

אקסולוטלים (Ambystoma mexicanum) גודלו במתקן אקסולוטל של המרכז לטיפולים רגנרטיביים דרזדן (CRTD) של האוניברסיטה הטכנולוגית של דרזדן (TUD). תיאור מלא של תנאי הגידול ניתן למצוא ב²⁴. בקצרה, החדרים נשמרו ב 20 - 22 ° C עם מחזור יום / לילה 12/12 שעות. כל הטיפול והניתוחים בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה המקומית ואושרו על ידי Landesdirektion Sachsen, גרמניה.

מחקר זה השתמש באקסולוטלים לבנים (d/d) לכל הניסויים, זן מוטנטי טבעי חסר פיגמנטציה של הגוף (מעט מאוד מלנופורים וקסנטופורים), עם אירידופורים רק בקשתית העיניים. במחקר זה נעשה שימוש באקסולוטלים בגודל 8-15 ס"מ מהחוטם ועד הזנב (בני 5-7 חודשים) ללא הטיה ספציפית למין.

1. הכנה

1. הכינו תמיסת מלאי בנזוקאין 10% (w/v) שתשמש להרדמה והמתת חסד של האקסולוטים (ראו להלן). לשם כך, מערבבים בבקבוק נפח 50 גרם של בנזוקאין עם 100% אתנול עד לגבול 500 מ"ל הושג.
2. הכינו תמיסת מלאי בנזוקאין 0.03% (w/v).
   1. עבור 1 ליטר, יש לערבב 50 מ"ל של 10x Tris-buffered salt (TBS) עם 30 מ"ל של 10% (w/v) בנזוקאין ו-5 מ"ל של 4000% (w/v) התמיסות של Holtfreter עם 915 מ"ל מים מזוקקים ולערבב במשך הלילה עם מוט ערבוב מגנטי.
   2. לקבלת ליטר אחד של תמיסת 10x TBS, ערבבו 24.2 גרם בסיס Trizma ו-90 גרם NaCl עם 990 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה. מערבבים היטב עם מוט ערבוב מגנטי. לאחר מכן, הוסף כ -10 מ"ל של HCl מרוכז (12 M או 37%) והתאם עבור pH 8.
   3. עבור 1 ליטר של 4000% (w/v) הפתרון של Holtfreter, לערבב 158.4 גרם של NaCl, 11.13 גרם של MgSO₄·7H₂O, 5.36 גרם של CaCl₂·2H₂O ו 2.88 גרם של KCl עם מים deionized עד 1 L.
3. הכינו דילול בנזוקאין עובד של 0.01% (w/v) בהחזקת מי מיכל להרדמה על ידי דילול תמיסת המלאי 1:3 של 0.03% (w/v).
   1. עבור 1 ליטר של תמיסה, השתמש 333 מ"ל של תמיסת מלאי בנזוקאין בתוספת 666 מ"ל של מי מיכל החזקה.
4. הכן 5 מ"ג / מ"ל butorphanol טרטרט פתרון מלאי עבור שיכוך כאבים. לשם כך, מערבבים 100 מ"ג של מלח butorphanol (+)-טרטרט עם 20 מ"ל של מים טהורים במיוחד. יש לאחסן aliquots ב 4 °C.
5. ביום הקטיעות, להכין טרי 0.5 מ"ג / ליטר butorphanol טרטרט פתרון עבודה כדי להפחית את כאבי בעלי חיים לאחר הליכים כירורגיים על ידי דילול תמיסת מלאי 1:10.000 במיכל החזקה.
   1. עבור בעלי חיים שאורכם קטן מ-8 ס"מ, יש לערבב 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי במיכל החזקה של 200 מ"ל.
   2. עבור בעלי חיים גדולים יותר, ערבבו 60 מיקרוליטר של תמיסת מלאי במיכל החזקה של 600 מ"ל.
6. הכינו תמיסת מלח סטרילית חוצצת פוספט (APBS), תמיסת PBS של 80% (v/v), ושמרו אותה בטמפרטורת החדר (RT) על ידי ערבוב של 800 מ"ל של DPBS עם 200 מ"ל של מים שעברו דה-יוניזציה.
7. הכינו תמיסת מלאי אינסולין 1 מ"ג/מ"ל. לשם כך, מערבבים 250 מ"ג אבקת אינסולין עם 25 מ"ל HCl 0.1 M ומתסיסים לאט עד להמסה. תוך כדי התססה, להוסיף 225 מ"ל של APBS עד הפתרון ברור. מסנן סטרילי, ולאחסן 4 מ"ל aliquots ב -20 ° C.
8. יש להכין מדיום תרבית סטרילית (כל % (v/v): 62.5% L15 בינוני, 10% FBS מומת חום, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1% אינסולין, 1% L-גלוטמין) ולשמור על טמפרטורה של 4°C עד ליום השימוש. ביום הניסוי, יש לאזן ל-RT לפני השימוש.
   1. עבור 400 מ"ל של מדיום תרבית, השתמש 250 מ"ל של L15 בינוני, 40 מ"ל של FBS מומת חום, 4 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין, 4 מ"ל של תמיסת אינסולין (משלב 1.7), 4 מ"ל של L-גלוטמין, ו 98 מ"ל של מים סטריליים deionized. מכינים בתנאים סטריליים ומסנן סטרילי לאחר ערבוב כל הרכיבים. הכינו 15 מ"ל aliquots.
9. הכינו נקודת התכה נמוכה (lmp) של 2.5% ו-3% (w/v) - אגרוז בתמיסת APBS וחממו בטמפרטורה של 70°C כדי להמיס את האגרוז לחלוטין. הכינו aliquots בצינורות 1.5 מ"ל ולאחסן ב 4 °C עד יום השימוש.
   1. עבור 20 מ"ל של 2.5% (w/v) lmp-agarose, לערבב 0.5 גרם של lmp-agarose עם 20 מ"ל של APBS בצינור 50 מ"ל לחמם באמבט מים ב 70 ° C עד agarose נמס לחלוטין. הפתרון צריך להיות ברור ושקוף. הכינו אליציטוטים בעודם חמים.
   2. עבור 20 מ"ל של 3% (w/v) lmp-agarose, לערבב 0.6 גרם של lmp-agarose עם 20 מ"ל של APBS ולהמשיך כאמור לעיל.
   3. (אופציונלי): עבור 20 מ"ל של 1% (w/v) lmp-agarose, לערבב 0.2 גרם של lmp-agarose עם 20 מ"ל של APBS ולהמשיך כמפורט לעיל.
      הערה: זמן ההתכה תלוי בריכוז הלמ"פ-אגרוז ועשוי לנוע בין 15-40 דקות בקירוב.
10. עבור קטיעה והרכבה של רקמות, השתמש בסטריאוסקופ brightfield.
11. הרכיבו צלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ"מ, מלקחיים, אזמל ומספריים כירורגיים לקטיעה ואיסוף רקמות.
12. הכינו צלחות פטרי מפלסטיק בקוטר 35 מ"מ למדידות הזחה.
13. הכינו צילינדרים באורך ~1 ס"מ בקוטר ~1 ס"מ. לשם כך, מחממים חותך קרטון תחת להבת מבער Bunsen וחותכים צינור 15 מ"ל עם הלהב המחומם.
14. חותכים קטן 1 ס"מ² ריבועים של parafilm וחנות.
15. הכינו גוש מתכתי או קר בטמפרטורה של -20°C על ידי השארתו במקפיא למשך שעה אחת לפחות.
16. מכינים פיפטות פסטר מפלסטיק.
17. (אופציונלי): הכינו תמיסת MEMFa מקובעת (3-(N-מורפולינו)חומצה פרופאנסולפונית [MOPS] 0.1 M pH 7.4, אתילן גליקול-ביס (2-אמינואתילתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית [EGTA] 2 mM, MgSO₄·7H₂O 1 mM, 3.7% פורמלדהיד). לשם כך, להוסיף 10.465 גרם של MOPS, 0.123 גרם של MgSO₄·7H₂O, 2 מ"ל של 0.5 M EDTA pH 8.0, ולהוסיף מים עד 45 מ"ל. הוסף 5 מ"ל פורמלדהיד 37% (w/v) לנפח כולל של 50 מ"ל.

2. ריאגנטים

1. עיין בטבלת החומרים עבור הריאגנטים המשמשים לעבודה זו, אך ניתן להשתמש גם בספקים מסחריים אחרים.

3. קטיעת אקסולוטל והתחדשות גפיים

1. לפני כל הליכי הניסוי, יש להרדים את בעל החיים ב-0.01% (w/v) בנזוקאין מדולל במי מיכל החזקה (שלב 1.3) למשך 20 דקות, ולוודא שבעלי החיים מורדמים עמוקות ואינם מגיבים לגירויי מישוש.
2. הוציאו את האקסולוטל מההרדמה והניחו אותו על גבי צלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה טישו מנייר טבול במים המכילים הרדמה. כיוון את האיבר בניצב לציר הגוף ומקם את הצלחת מתחת לסטריאוסקופ להדמיה טובה יותר.
   הערה: סטריאוסקופ עם מנורת צוואר אווז קומפקטית שימש כאן.
3. כרתו את הגפה בעזרת אזמל סטרילי חד שמיד דיסטלי לאזור המסויד של אזור הזאוגופודיאלי (רדיוס/אולנה) (איור 1A).
   הערה: בהתאם לעקרון רווחת בעלי החיים 3R, מומלץ להשתמש בגפיים שהוסרו בתחילה על ידי הקטיעה כבקרות שלמות.
4. השאירו את בעל החיים על הצלחת וכסו אותו בנייר טישו לח ספוג במים המכילים בנזוקאין למשך 15 דקות כדי לאפשר קרישת דם וסגירת פצעים להתרחש.
5. יש להחזיר בעלי חיים למיכל המכיל מים מתוקים עם משככי כאבים (טרטרט בוטורפנול, 0.5 מ"ג/ליטר, משלב 1.5).
6. העבירו את בעלי החיים למיכל המקורי שלהם המכיל מים טריים 24 שעות לאחר טיפול משככי כאבים לאחר הניתוח.
7. אפשרו לבעלי חיים להתחדש עד לשלב העניין הרצוי.
   הערה: הגפיים שנותחו נאספו ביום הקטיעה לשלב השלם ו-5 ימים לאחר הקטיעה (dpa) לשלב ההיסטוליזה בבעלי חיים בני 5 חודשים. שלב עיבוי הסחוס נמדד ב 21 dpa בבעלי חיים בני 7 חודשים.

4. הרכבה ועיבוד רקמות למדידות

1. חממו את צינורות ה-1.5 מ"ל המכילים 2.5% או 3% (w/v) lmp-agarose (משלב 1.9) על תרמובלוק בטמפרטורה של 70°C עד שהאגרוז נמס במלואו. החליפו את הצינורות לתרמובלוק אחר ב-37°C ואפשרו לטמפרטורה להתאזן לפני השימוש.
   הערה: כאן, 2.5% lmp-agarose שימש למדידת רקמות התחדשות ו -3% עבור רקמות שלמות.
2. כסו צד אחד של הגלילים באורך 1 ס"מ (משלב 1.13) באחד מחלקי הפרפילם (שלב 1.14) כך שיהיו אטומים לחלוטין בתחתיתם.
3. שיווי משקל של 15 מ"ל aliquots של מדיום תרבות ל- RT (משלב 1.8)
4. הרדימו את בעלי החיים על ידי טבילתם במים המכילים הרדמה (0.01% (w/v) בנזוקאין מדולל במי מיכל החזקה) למשך 20 דקות לפחות.
5. דמיינו את הגפיים תחת סטריאוסקופ עם תוכנה המאפשרת מדידות כמותיות. למדוד את אורך מבנה הריבית ולחשב כמה רקמה צריך להסיר מהקצה הדיסטלי של האיבר עד שמגיעים לחלק הריבית.
6. לחידוש הגפיים, אספו אותם על ידי חיתוך עם אזמל ו / או מספריים כירורגיים בגובה המרפק וניתוח רקמה עודפת מתוך הגפה. השאר את הרקמה בתמיסת APBS בעת הכנת השלב הבא. ודא שהחיתוך רוחבי (90°) לציר הזרוע התחתון כדי ליצור משטח אחיד. עבור הגפיים השלמות, להסיר את היד על ידי חיתוך דרך האזור הקרפלי.
7. הרדימו את בעלי החיים על ידי חשיפתם למנה קטלנית של הרדמה (0.1% בנזוקאין) למשך 20 דקות לפחות. לשם כך, הוסף את הנפח הנדרש של תמיסת בנזוקאין 10% (w/v) כדי להגיע לריכוז של 0.1% (w/v).
   1. אם בעלי חיים הורדמו ב-100 מ"ל של 0.01% (w/v) תמיסת בנזוקאין, יש להוסיף 900 μL של תמיסת הבנזוקאין 10% (w/v).
8. יש לשטוף גפיים על ידי טבילתן בתמיסת APBS.
9. ודא כי פיפטות פסטר ואת thermoblock (מיוצב ב 37 ° C עם aliquots agarose) קרובים לתחנת העבודה. הוציאו את הבלוק הקר מהמקפיא בטמפרטורה של -20°C והניחו עליו את הגליל כשהקצה מכוסה הפרפילם פונה כלפי מטה.
10. תפוס את האיבר המנותח והסר בעדינות את עודפי הנוזל עם נייר טישו. הניחו את האיבר על צלחת נקייה, הוסיפו את האגרוז המומס מלמעלה, והזיזו לזמן קצר את האיבר באגרוז כדי לעקור את כל הנגמ"שים שנותרו מפני העור.
11. עבודה מהירה, הניחו את האיבר בתוך הצילינדר, וודאו שהוא מכוון אנכית, כאשר אזור העניין פונה כלפי מעלה.
12. תוך כדי אחיזה עדינה של האיבר במלקחיים, מוסיפים למפג-אגרוז בתוך הגליל עד שהרקמה מכוסה במלואה. מסירים בעדינות את המלקחיים לפני שהאגרוז מתמצק.
13. מוציאים את הצילינדר מהבלוק הקר ונותנים לאגרוז להתמצק לחלוטין ב-RT למשך כ-30 שניות.
14. קח את בלוק האגרוז המכיל רקמות מיד לחדר הוויברטום, יחד עם אליציטוטים בינוניים של תרבית סטרילית ו- APBS, ב- RT.
15. מוציאים את הפרפילם מתחתית הגליל ומחברים את האגרוז המכיל את הרקמה לשלב הוויברטומה בעזרת דבק ציאנואקרילט. ודא כי הן agarose ומדגם מודבקים על הבמה.
16. השקיעו את הבמה ב-APBS לצורך חלוקת חלקים.
    הערה: רקמות שלמות כוללות את העצם/סחוס הנוקשים יותר, בעוד שרקמות מתחדשות רכות יותר. לכן, יש להתאים את פרמטרי הוויברטומה בהתאם. מחקר זה השתמש בפרמטרים הבאים: רקמות שלמות (משרעת 1.2 מ"מ ומהירות 0.1 מ"מ לשנייה) ורקמות מתחדשות (משרעת 0.9 מ"מ ומהירות 0.4 מ"מ לשנייה).
17. התחילו לחתוך את האגרוז בצעדים קצרים (למשל, בצעדים של 100 מיקרומטר) עד שמגיעים לקצה הרקמה. לאחר מכן, חתך את בלוק הרקמה עד להסרת החלק הדיסטלי של הרקמה (המחושב בשלב 4.5). בדרך זו, חתך רוחבי של תחום העניין יהיה נגיש.
    הערה: מקטע הרקמה שהוסר יכיל את המשטח הסמוך לזה שנבדק עם AFM ויכול לשמש כנקודת התייחסות למבנה הרקמה. לכן, הוא יכול לשמש לניתוח משלים ישיר או קבוע עבור צביעה לאחר מכן (ראה סעיף 6).
18. בזהירות להסיר את הבלוק המכיל רקמות משלב vibratome עם סכין גילוח ולהסיר את כל עקבות הדבק. הדביקו מיד את הבלוק על צלחת פטרי פלסטיק 35 מ"מ עם דבק דבק רקמות כירורגי והוסיפו כ -2 מ"ל של מדיום תרבית ב- RT כדי להבטיח שהרקמה מכוסה במלואה.
    הערה: משטח הרקמה החשוף בגוש האגרוז הוא המשטח שיש לחקור.

5. מדידות עם AFM

1. לפחות יום אחד לפני המדידות, הכינו את המזנון למדידות.
   הערה: עבור עבודה זו, מיכלי סיליקון ללא קצה היו פונקציונליים עם חרוזי פוליסטירן (קוטר 20 מיקרומטר), ואת הקשר חרוז חרוז נשאר לחזק לפחות 1 יום לפני ששימש למדידות הזחה.
   1. מצמידים חרוזים למכלים באמצעות דבק אפוקסי עם זמן עיבוד של 5 דקות.
   2. הורידו במהירות את המזנון במגע מינימלי על מגלשת זכוכית מצופה דבק כך שתיווצר טיפת דבק קטנה בקצהו, והביאו אותו מיד לאחר מכן למגע עם חרוז מתאים.
   3. החזיקו את מגע החרוז במשך ~10 דקות לפני שאתם מרימים את הקנטיליבר עם חרוז קשור מעל פני השטח.
2. כייל את המזנון לפני המדידות.
   הערה: המזנון שהשתנה כויל לפני כל סדרת ניסויים בשיטת הרעש התרמי תוך שימוש בפרוצדורות מובנות של תוכנת AFM.
3. הכניסו את צלחת הפטרי עם בלוק הרקמה (משלב 4.18) ומדיום התרבית למחזיק צלחת הפטרי של AFM וקבלו תמונת סקירה במיקרוסקופ שדה בהיר (איור 1B).
   הערה: לבדיקות הזחה, נעשה שימוש במערך המצויד בבמת מנוע על גבי מיקרוסקופ אור זקוף. הרכיבו את ראש ה-AFM ומקמו את הקנטיליבר מעל הרקמה והביאו את הקנטיליבר קרוב לפני השטח.
4. בחרו את אזור העניין הספציפי ותיעדו מערך של עקומות מרחק כוח (איור 2A).
   הערה: נקודות כוח יחסיות של 2-25 nN שימשו כדי להגיע לעומקי כניסה דומים של ~1-4 מיקרומטר עבור רקמות בעלות קשיחות שונה, עם מהירות גישה ונסיגה של 7.5 מיקרומטר לשנייה, אורך z של 50 מיקרומטר, גודל רשת 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר עם 3 x 3 נקודות.
5. עבור כל אזור שנבדק, רכשו תמונה במיקרוסקופ שדה בהיר כדי לשייך את הערכים המתקבלים לכל אזור מסוים באזור הגפיים.
6. עבור כל הדגימות, בדוק לפחות 3 אזורים שונים לכל סוג רקמה.
   הערה: בכל המקרים, מחקר זה מדד 4 אזורים במרכז הסחוס ו -3 אזורים בשולי אזור הסחוס ושמר את הרקמה מתחת למיקרוסקופ למשך שעה לכל היותר.
7. לאחר סיום מדידות ההזחה, השליכו או תקנו את הרקמה לניתוח נוסף.
   הערה: הדגימות תוקנו לאחר סיום המדידות על ידי הצבתן בצינורות 2 מ"ל המכילים תמיסת MEMFa ותוקנו במשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס. נעשה שימוש ב- MEMFa (שלב 1.17), אך ניתן להשתמש גם בתמיסת פורמלדהיד 4% (w/v) ב- PBS.

6. עיבוד (אופציונלי) של מקטעי רקמות סמוכים

1. אם חלקי הרקמה הסמוכים משמשים לצביעה הבאה, הניחו אותם מיד לאחר החתך בצינור קטן של 2 מ"ל המכיל קיבוע וקבעו לילה ב -4 מעלות צלזיוס.
   1. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה באמצעות תיוג של אקטין ציטו-שלד וגרעינים, שטפו 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות כל אחת כדי להסיר את הקיבוע והכתם בתמיסה המכילה פלואידין מצומד Alexa Fluor 488 (1:250) ו-Hoechst 33258 (1:10000) ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT על משטח נדנדה.
   2. לאחר מכן, יש לשתק את הדגימות המוכתמות על גבי כלים בעלי תחתית זכוכית באמצעות 1% (w/v) lmp-agarose ב-APBS המיוצב ב-37°C (משלב 1.9). ודא כי פני השטח של עניין פונה אל הזכוכית. לאחר שהאגרוז מתמצק, כסו את הדגימות ב-PBS כדי למנוע התייבשות.
      הערה: הדגימות השלמות וההיסטוליזה מצולמות במיקרוסקופ קונפוקלי הפוך (הגדלה של פי 10 וחתכים אופטיים של 8 מיקרומטר). תמונות באיור 1C הן הקרנות מקסימליות של 8 מקטעים אופטיים.
2. אם מקטע הרקמה הסמוך משמש לניתוח מיידי במורד הזרם הדורש רקמה טרייה (כמו מיצוי RNA, דגירה עם צבעים חיים וכו '), הקפד לעבוד במהירות ולהשתמש בתווך תרבית תאים (משלב 1.8) כדי להבטיח את שלמות הרקמה הגבוהה ביותר האפשרית.

7. ניתוח והצגת נתונים

1. כדי לחשב את המודולוס של יאנג לכאורה, נתח את עקומות מרחק הכוח באמצעות מודל הרץ/סנדון (Eq.1) עבור אינדנטר כדורי באמצעות תוכנת עיבוד הנתונים JPK/Bruker, בהנחה שיחס פואסון הוא 0.5.
   (Eq.1)
   כאשר R: רדיוס indenter, E: מודולוס אלסטי, ν: יחס פואסון, a: רדיוס אזור המגע המעגלי בין הנכנס לדגימה, δ: עומק הזחה.
2. לניתוח ויסקו-אלסטי, נתח את חלקי הגישה של עקומות כניסת הכוח ב- PyJibe 0.15.0 עם הסיומת "מודל הרץ מתוקן עבור צמיגות באמצעות Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)" (נכתב על ידי פול מולר, https://github.com/AFM-analysis/PyJibe)²⁵. פונקציית ההתאמה מבוססת על מודל שתואר על ידי Abuhattum et ^al.26, המשלב אלמנטים של מודל Kelvin-Voigt-Maxwell.
   1. עבד מראש את עקומות כניסת הכוח כדי להעריך את נקודת המגע באמצעות התאמה חתיכתית עם קו (קו בסיס) ופונקציית התאמה פולינומית עבור חלק הגישה.
   2. התאימו את עקומות כניסת הכוח ל"מודל הרץ מתוקן לצמיגות באמצעות מודל Kelvin-Voigt-Maxwell (KVM)". מההתאמה, השיגו את המודולוס של יאנג הלא רגוע, את המודולוס של יאנג לכאורה ואת הצמיגות הנראית לעין. המודל גם נותן למקסוול זמני הרפיה והזחה.
      הערה: במספר עקומות הזחת כוח שנותחו (במיוחד הרקמה השלמה), זמני ההרפיה של מקסוול היו גדולים או קטנים משמעותית מזמן ההזחה, מה שמצביע על התנהגות אלסטית למדי או התנהגות מכנית קלווין-ווייט, בהתאמה.
3. יצא את כל המדידות לגיליון אלקטרוני וחשב את המודולים החציוניים הנראים של יאנג לכל סוג רקמה ודגימה.
4. התווה ונתח סטטיסטית את הנתונים באמצעות תוכנה מתאימה.
   הערה: מנסרת GraphPad משמשת כאן, וכאשר מתארים את התוצאות, המחקר מתייחס לממוצע ± SD של המודולים החציוניים הנראים של יאנג לכל מדגם (מוצג באיור 2D-F).
5. הצג פרוסות אופטיות מתמונות קונפוקליות על-ידי הקרנתן עם פונקציית ההקרנה המרבית של פיג'י. התאם את הבהירות והניגודיות של כל ערוץ בנפרד להדמיה מיטבית של כתמים פלואורסצנטיים.
6. צור לוח איור עם התוכנה המתאימה.
   הערה: Affinity Designer משמש ליצירת החלוניות, והמודל באיור 1A משורטט באמצעות Affinity Designer.

באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל, מדדנו את המודולוס לכאורה של יאנג של רקמות גפיים אקסולוטליות סחוניות בתנאים הומיאוסטטיים ("שלמים"), במהלך היסטוליזה מוקדמת של הסחוס, ובשלבי עיבוי סחוס מאוחרים יותר (איור 1A). חקרנו גם את התכונות המכניות של רכיבי השלד באזורים שונים, כולל המרכז והפריפריה שלהם, כפי שניתן לראות בתמונות המתארות את מיקום השלד (איור 1B). כדי להציג את ארכיטקטורת הרקמה ולקשר אותה למדידות קשיחות, מקטעי רקמה רוחביים או גוש הרקמה שבו בוצעו המדידות תוקנו ונצבעו עבור חוטי אקטין וגרעינים עם Alexa Fluor 488 מצומד Phalloidin ו-Hoechst, בהתאמה (איור 1C). בגפיים שלמות, הרדיוס בבירור גדול יותר מהאולנה, אך לשני יסודות השלד הסחוסי יש מורפולוגיה דומה, עם גרעינים עגולים מפוזרים באופן שווה במרכז, מוקפים בטבעת של גרעינים שטוחים המתאימים לפריכונדריה²⁴. בשלב ההיסטוליזה התגלו שינויים דרמטיים בארכיטקטורת הרקמות, עם גרעינים לא מאורגנים ופחות צפופים בתוך יסודות השלד. בשלב עיבוי הסחוס המאוחר יותר, הגרעינים מתארגנים שוב, עם תיחום ברור בין הסחוס החדש שנוצר לבין הרקמות המתחדשות שמסביב. עם זאת, בשלב זה רוב הגרעינים שטוחים, ואין הבדלים מורפולוגיים ברורים בין המרכז לפריפריה.

כאשר נמדדו חתכים רוחביים של שני יסודות השלד הקיימים באזור הזאוגופודיאלי (רדיוס ואולנה), זוהו מודולי יאנג בלתי ניתנים להבחנה בגפיים שלמות, עם ערכים חציוניים של 10.95 ± 11.69 kPa ו-15.71 ±-6.49 kPa, בהתאמה (איור 2D, משמאל), מה שתואם את הדמיון האנטומי ביניהם (איור 1C). באופן מעניין, ניתוח של מרכז סחוס לעומת פריפריה הראה כי בתנאים שלמים, המודולים של יאנג במרכז היו גבוהים יותר מאשר בפריפריה, עם ערכים חציוניים של 16.48 ± 6.86 kPa לעומת 7.53 ± 4.63 kPa, בהתאמה (איור 2E, משמאל). ביום ה-5 לאחר הקטיעה, המקביל לשלב ההיסטוליזה, המודולים של יאנג ברדיוס ובאולנה ירדו במידה ניכרת (0.03 ±-0.02 kPa ו-0.13 ±-0.09 kPa, בהתאמה, איור 2D, מימין), אך גם ההבדלים בין המרכז לפריפריה נעלמו, כאשר המודולים החציוניים של יאנג היו 0.11 ±-0.07 kPa ו-0.27 ±-0.34 kPa, בהתאמה (איור 2Eמימין)., כאשר מנתחים את תכונות הסחוס בשלב התחדשות מאוחר יותר, בזמן שהסחוס מתחיל להתעבות, זוהתה עלייה משמעותית במודולים הנראים לעין של יאנג, שהגיעו לערכי ביניים בין הפאזה השלמה לשלב ההיסטוליטי (0.77 ± 0.29 kPa, איור 2F).

כפי שניתן לראות בעקומות לדוגמה שסופקו (איור 2B), היסטרזה התרחשה בין רוב זוגות עקומות הגישה והנסיגה, מה שמצביע על תגובה ויסקו-אלסטית של הרקמה תחת כוח. בהמשך יצאנו לנתח את התכונות הויסקו-אלסטיות של הרקמות השונות בפירוט רב יותר. מכיוון שמדידות תנודות על פני תדרים מרובים הן גוזלות זמן וקריטיות במידת מה בכל הנוגע לשמירה על שלמות הרקמה, במיוחד בעת מיפוי אזורי רקמה מרובים, השתמשנו בשיטה שפורסמה בעבר על ידי Abuhattum et al. המאפשרת להתאים את חלק הגישה של עקומות מרחק הכוח לפני נסיגה מיידית של הקנטיל²⁶. המודל מבוסס על אלמנטים מודל Kelvin-Voigt Maxwell ויושם בעבר לניתוח התכונות הויסקו-אלסטיות של תאים והידרוג'לים²⁶, כמו גם רקמת הלבלב²⁷. מודולי חציון לא רגוע (שלם: 23.05 kPa, היסטוליזה: 0.20 kPa וסחוס עיבוי: 1.60 kPa) ומודולי יאנג לכאורה (שלם: 17.54 kPa, היסטוליזה: 0.07 kPa וסחוס עיבוי: 1.54 kPa) שמקורם ברקמות בשלבים השונים של התחדשות גילו הבדלים משמעותיים (איור 2G-H). באופן כללי, תגובה אלסטית בעיקר של הרקמות לעיוות נצפתה בקצב העיוות שנבחר, כפי שמשתקף על ידי הדמיון הרב בין מודולי אלסטי לא רגוע ונראה לעין (איור 2G,H). ערכי צמיגות חציונית נראית נמוכים משמעותית התקבלו עבור השלב ההיסטוליטי (0.72 Pa·s) בהשוואה לשלב הסחוס השלם (2.06 Pa·s) והעיבוי (2.32 Pa·s) (איור 2I). כצפוי, המודולים לכאורה של יאנג בניתוח PyJjibe (איור 2H) היו תואמים מאוד לערכים שהתקבלו על-ידי תוכנת עיבוד הנתונים JPK (איור 2F).

לסיכום, האפיון המכני משקף ארגון מחדש דינמי של רקמות בתהליך ההתחדשות. מדידות אלה הן בהתאם לתצפיות האנטומיות, שבהן קשיחות הרקמה פוחתת יחד עם השינויים הנצפים בארכיטקטורת הרקמה (איור 1C) וחוזרת בהדרגה במהלך ההתחדשות.

איור 1: מדידות הזחה של סחוס הגפיים האקסולוטליות במהלך רגנרציה. (A) ייצוג סכמטי של שלבי התחדשות. הקו המקווקו מציין את האתר המשוער של החתך הרוחבי שנוצר על ידי ויברטומה שבו בוצעו מדידות. (B) תמונות מייצגות של מדידות מרכז (למעלה) ופריפריה (למטה) בסחוס הגפיים. הקצה השחור הוא הקנטילבר. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C) ארכיטקטורת רקמות בגפיים שלמות (משמאל), רקמה העוברת היסטוליזה (באמצע) וסחוס מעובה (מימין). ירוק: גרעינים (Hoechst), מגנטה: חוטי אקטין (Phalloidin). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. C' אזור מוגדל מסומן בחלונית. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. רשתות הכניסה בגודל 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר מסומנות בריבועים מנוקדים לבנים (במרכז) וצהובים (פריפריה). בלוחות B ו-C, האותיות R ו-U מציינות את הרדיוס ואת אולנה, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מדידת קשיחות סחוס במהלך התחדשות גפיים אקסולוטליות באמצעות AFM. (A) סכמות של ניסוי הזחת AFM המוצגות ככוח כפונקציה של זמן (למעלה) וכוח כפונקציה של המרחק בין האינדנדר לדגימה (להלן). עקומות הגישה והפסילה מוצגות בכחול ובאדום, בהתאמה. נקודת המגע מוצגת על-ידי קו מקווקו אנכי שחור. עקומות הזחת הכוח הותאמו לחלק הגישה של העקומה, באמצעות מודל הרץ/סנדון (תוכנת עיבוד נתונים JPK ופיג'יבה) או הרחבת מודל KVM ויסקו-אלסטי בפיג'יבה. (B) עקומות כוח מייצגות ממדידות AFM בגפיים שלמות ומתחדשות במהלך שלבי ההיסטוליזה ועיבוי הסחוס. אחוז העקומות הניתנות לניתוח (כלומר, ללא תוצרים) מצוין בפינה הימנית העליונה של כל עקומה. (C) דוגמאות לממצאים אופייניים בעקומות כניסת כוח, למשל עקב מגע לא תקין של הנכנס עם המשטח. דוגמאות המוצגות מתאימות לגפיים שלמות, אך סוגים מקבילים של ממצאים נצפו בכל התנאים. עבור B-C: עקומות כוח מייצגות הותאמו והוצגו באמצעות פיג'יבה. עקומת הכחול הבהיר מתארת את חלק הגישה של העקומה, והעקומה האדומה בהירה היא חלק הנסיגה. הקו הכחול הכהה יותר הוא ההתאמה של הרץ/סנדון לאינדנטור כדורי. השאריות המתאימות מההתאמה מוצגות להלן עבור עקומות מרחק הכוח התחתונות. השאריות המשורטטות מייצגות את ההבדל בין ערכי ההתאמה לערכי הכוח בפועל. (D) מודולי הרדיוס ומרכזי האולנה של יאנג הנמדדים בגפיים שלמות ועוברים היסטוליזה. (E) מודולי יאנג לכאורה של מרכז סחוס לעומת פריפריה (פרי) בגפיים שלמות ובמהלך היסטוליזה. (F) מודולי יאנג לכאורה שנמדדו עבור מרכז הסחוס בשלבים מנותחים של רגנרציה. עבור D-F: כל נקודה נגזרת מעקומת מרחק כוח אחת שנותחה בהצלחה, ונקודות גדולות יותר מתאימות לערכי החציון לדגימה. המודולים של יאנג הושגו באמצעות התאמת מודל הרץ/סנדון של תוכנת JPK Bruker. (ז-י) מודולוס לא רגוע (G), מודולוס נראה של יאנג (H) וצמיגות נראית (I) מחושב באמצעות PyJibe (הרחבת KVM) ממדידות מרכז הסחוס בשלבי התחדשות מנותחים. כל נקודה נגזרת מעקומת מרחק כוח אחת שנותחה בהצלחה. הקווים תואמים לערכים החציוניים של כל המדידות לכל תנאי. עבור D-I: Kruskal-Wallis עם מבחן ההשוואות המרובות של דאן. אותיות שונות מייצגות תנאים שונים סטטיסטית זה מזה (עמ' < 0.05). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כאן, אנו מדגימים טכניקה למדידת קשיחות סחוס בגפיים אקסולוטליות עם AFM. עם זאת, שיטה זו עשויה להיות מורחבת עבור חיטוט סוגי רקמות אחרים גם כן. שלב מפתח למדידות AFM מוצלחות הוא הכנת דגימות, שהתגלתה כמאתגרת במיוחד עם דגימות אקסולוטל. מצאנו כי חיטוט פני הרקמה שעדיין היו מוטמעים בגוש האגרוז היה הדרך הטובה ביותר לשמור על שלמות הרקמה. הסיבה לכך היא שהעור האקסולוטלי מפריש רמות גבוהות של ריר על פני השטח של האפידרמיס, מה שמונע הטבעה יציבה של קטע הרקמה החתוך באגרוז.

דגימות מסוימות עשויות להביא אתגרים נוספים, כגון הדבקה גבוהה. חווינו בעיה זו, במיוחד בדגימות בשלב ההיסטוליזה, שהיו יחסית תואמות ודביקות. בדגימות האלה ראינו גם עקומות מרובות של מרחק כוח שבהן לחלק ההזחה היה מראה "משונן", מה שמצביע על כך שהחרוז עיוות את משטח הדגימה באופן לא רציף (איור 2C), למשל בגלל שהמשטח נכנע תחת לחץ. עקומות כוח-מרחק כאלה היו צריכות להימחק מכיוון שלא ניתן היה להתאים אותן למודל הרץ-סנדון. כדי להפחית הידבקות, פסיבציה של האינדנטר יכולה להועיל²⁸, כלומר, על ידי ציפוי חרוז האינדנטר בחומרים המפחיתים את דביקותו, כגון פוליאתילן גליקול (PEG) או אלבומין בסרום בקר. כמו כן, ניתן להשתמש במודלים חלופיים להתאמת עקומות מרחק כוח, למשל, JKR (Johnson-Kendall-Roberts) מודל²⁹. מכיוון שהרקמות שנותחו כאן הראו שינויים גדולים יחסית במודולים אלסטיים של יותר מסדר גודל אחד עבור אזורי רקמות סמוכים והתנאים השונים שנבדקו, זה הפך את הבחירה של קנטילבר/אינדנטר אידיאלי יחיד (קבוע קפיץ / גודל indenter) למאתגרת. השינויים הגדולים למדי בנוקשות הרקמה דרשו גם התאמה של כוח המגע המופעל על מנת לשמור על עומק כניסה דומה ובטווח מתאים (כ-5%-25% מקוטר הכניסה).

פרמטר קריטי נוסף לשימור התכונות המכניות של הרקמה מבחינה פיזיולוגית ככל האפשר הוא שמירה על שלמות מקסימלית של הרקמה. זה הובטח על ידי מדידת דגימות טריות שעובדו מיד לאחר האיסוף ונשמרו בטמפרטורה מתאימה תחת מדיום תרבית תאים מיוצב pH.

לאחרונה, קבוצות אחרות ביצעו מדידות מיקרו-הזחה באלמנטים שלדיים אקסולוטליים באמצעות דרכים חלופיות לעיבוד דגימה³⁰. עם זאת, בניסויים אלה, הרקמה הוקפאה מראש וחלקי השלד המתחדשים נותחו ידנית מהרקמות הסובבות אותם כדי למדוד אותם באתרם. עד שלא יוכח אמפירית, לא ברור אם למניפולציות אלה יש השפעה על שלמות רקמת הסחוס ותכונותיו המכניות. ניתוחים של שרירי סלמנדרה ובלסטמות דווחו גם כן^31,32. במקרים אלה, עם זאת, העור הוסר, והדגימות לא חולקו; לפיכך, רק מידע מפני השטח מיד מתחת אפיתל שהוסר התקבל. למרות שסוג זה של כימות הוא מדויק, הוא מספק מידע על פני השטח הרוחביים של השריר, ובכך מתעלם ממידע מכני משכבות השריר הפנימיות. השתמשנו באינדנטר של 20 מיקרומטר, כלומר המדידות לא היו בתפזורת כפי שדווח על מדידות מיקרו-הזחה 30,31,32, אלא בקנה מידה תאי וחוץ-תאי. לכן, אנו מקבלים רזולוציה שמשקפת את הרמזים המכניים שאליהם התאים נחשפים למעשה, כמו גם חושפת הטרוגניות של רקמות (איור 2D-I).

במדידות התגלו ערכי מודולי יאנג נמוכים יותר בפריפריה של יסודות שלד שלמים, מה שמרמז על כך שהפריכונדריה האקסולוטית תואמת יותר מהסחוס. עם זאת, איננו יכולים לשלול כי רקמות הסמוכות ליסודות השלד נבדקו גם בשל הגדרת הרשת 70 מיקרומטר x 70 מיקרומטר. במהלך השלב ההיסטוליטי, הבדלים כאלה לא נצפו, דבר המצביע על כך שהיסטוליזה בגפיים המתחדשות אקסולוטל עשויה להתקדם באופן שווה בסחוס, בפריכונדריה הסובבת אותו וברקמות שכנות. רדיוס ואולנה חולקים מבנה דומה אך יש הבדלים אנטומיים משמעותיים, כגון רדיוס בקוטר גדול יותר והאולנה ארוכה יותר²⁴. עם זאת, ניתוח השוואתי של נוקשותם לא דווח עד כה, למעט תגובתם לעומס מכני למטרות רפואיות³³. במאמר זה אנו מתארים מדידות הזחה בחתכים של שני יסודות שלד אלה בגפיים שלמות ומתחדשות. אנו מראים כי לא קיימים הבדלים משמעותיים בנוקשות בין רדיוסים לאולנות בגפיים אקסולוטליות, דבר התואם את צפיפות מינרלי העצם המקבילה שזוהו אצל מקבילים אנושיים³⁴. עם זאת, נצפתה נטייה של מודולי יאנג נמוך יותר ברדיוס הרדיוס, במיוחד במהלך היסטוליזה. כדי לקבוע אם תצפית זו משמעותית מבחינה ביולוגית, יש להעדיף מספר גבוה יותר של דגימות. בהתבסס על הנתונים שהתקבלו במחקר זה, אנו מציעים מינימום של 5 דגימות לכל מצב. במהלך שלב ההיסטוליזה, שני רכיבי השלד הופכים תואמים יותר, אשר עולה בקנה אחד עם שיפוץ ECM המתואר להתרחש בשלב זה⁹. לבסוף, המדידות שהתקבלו במחקר זה מרמזות כי קשיחות הסחוס עולה בהדרגה בשלב עיבוי הסחוס המאוחר יותר. תצפיות אלה תואמות את מדידות ההזחה שדווחו לאחרונה בעצמות שלמות וסחוס מעובה²⁹, כמו גם עם הערכת in vivo של תכונות מכניות סחוס עם מיקרוסקופ קונפוקלי ברילואין³⁵.

בסך הכל, עבודה זו מרחיבה את הפוטנציאל של AFM ככלי רב ערך לחקר התכונות המכניות של גפיים אקסולוטליות. באמצעות טכניקה זו, אנו שואפים להשלים את הידע שלנו על ביטוי גנים ומסלולי התמיינות תאים^16,13 על מנת להבין טוב יותר כיצד מכניקת הרקמות מעצבת ומשפיעה על תהליך ההתחדשות.

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים

אנו מודים לכל חברי מעבדת סנדובל-גוזמן על התמיכה והחברות המתמשכות במהלך פיתוח עבודה זו. אנו אסירי תודה גם לאניה וגנר, ביאטה גרוהל וג'ודית קוננץ על מסירותן לטיפול האקסולוטלי. אנו מודים גם לפול מולר על אספקת קודים לניתוח נתוני AFM. עבודה זו נתמכה על ידי מתקן מיקרוסקופיה קלה של פלטפורמת הטכנולוגיה CMCB ב TU דרזדן. AT הוא עמית במרכז הקריירה המוקדמת של מילדרד של דרזדן P2 הממומן על ידי הסיוע הגרמני לסרטן (Deutsche Krebshilfe). RA ממומן על ידי עמדת PI זמנית (Eigene Stelle) מ- Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - AI 214/1-1.