Ce protocole décrit comment la combinaison de l’infection EcoHIV avec des souris Tmem119-EGFP offre un système biologique précieux pour l’étude des altérations microgliales et des réservoirs viraux dans des modèles de rongeurs de troubles neurocognitifs associés au VIH. La thérapie antirétrovirale combinée a considérablement amélioré la qualité de vie des personnes vivant avec le VIH. Pour comprendre l’impact du VIH sur le système nerveux central, il est nécessaire de disposer d’un modèle fiable et réalisable du VIH.
Auparavant, un nouveau système biologique utilisant le VIH chimérique, EcoHIV in the colation, a été développé dans un modèle de rat pour étudier les troubles neurocognitifs et le dysfonctionnement synaptique. Il reste un défi important à relever pour clarifier la distribution neuroanatomique d’EcoHIV, en particulier son expression différentielle dans divers types de cellules du cerveau. Dans la présente étude, EcoHIV avec marquage par fluorescence mScarlet a été modifié et injecté rétro-orbitalement chez des souris knock-in Tmem119-EGFP pour déterminer si la microglie est le principal type de cellule responsable de l’expression virale et le réservoir de VIH dans le cerveau.
Pour commencer, transférez les cellules cérébrales dissociées du rat fœtal dans une plaque pré-enduite de poly-L-lysine à 12 puits avec des inserts en verre contenant un millilitre de DMEM-F12 plus 10 % FBS. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu par un milieu neurobasal complété par de la vitamine B27 et continuez à cultiver des cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone pendant trois semaines.
Ajoutez ensuite 60 microlitres d’EcoHIV-mScarlet dans la culture de cellules cérébrales et incubez pendant six jours. Après l’incubation, fixez les cellules avec 4 % de paraformaldéhyde. Effectuez un immunomarquage sur des cellules cérébrales infectées à l’aide d’anticorps primaires spécifiques et imagez-les au microscope confocal sous un objectif 40x.
La microglie a été identifiée comme le principal type de cellule infectée dans les cultures de cellules cérébrales de rat, comme en témoigne la colocalisation de mScarlet avec les marqueurs CD11b/c et Iba1. Pour commencer, ouvrez le cuir chevelu d’une souris adulte décapitée et transférez le tissu cérébral dans une autre boîte de Pétri contenant cinq millilitres de HBSS stérilisé. Décollez les méninges et transférez le cortex frontal dans deux millilitres de HBSS.
Ensuite, ajoutez 20 microlitres de 0,25 % de trypsine-EDTA dans le mélange. Incuber pendant 15 minutes à température ambiante, en faisant tourner le tube toutes les quelques minutes. Transférez les cellules dissociées dans un flacon de 75 centimètres carrés pré-enduit de poly-L-lysine contenant 10 millilitres de milieu DMEM-F12 et 10 % FBS.
Cultivez des cellules dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 90 %. Ensuite, digérez les cellules cérébrales avec deux millilitres de 0,25 % de trypsine-EDTA. Sous-cultivez les cellules cérébrales digérées dans une boîte à fond de verre de 35 millimètres contenant cinq millilitres de milieu de croissance DMEM-F12 jusqu’à ce qu’elles atteignent 80 % de confluence.
Ajoutez ensuite huit microlitres d’EcoHIV-mScarlet dans les cellules gliales de souris et incubez pendant deux jours. Des cellules gliales primaires de souris adultes ont été infectées avec succès par EcoHIV-mScarlet après deux jours de traitement. Pour commencer, fixez la souris Tmem119-EGFP anesthésiée en position latérale.
Décongelez l’EcoHIV-mScarlet sur de la glace. Versez la solution virale dans une seringue d’injection intraoculaire à l’aide d’une aiguille émoussée de calibre 33. Placez la souris dans le décubitus latéral droit, la tête tournée vers la gauche.
Identifiez la zone d’injection autour de la région de l’œil. Insérez lentement et doucement l’aiguille dans le canthus médial de l’œil. Ensuite, avancez l’aiguille dans les vaisseaux situés derrière le globe oculaire.
Injectez 6,5 microlitres d’EcoHIV-mScarlet dans le sinus rétro-orbitaire. Après l’injection, retirez délicatement l’aiguille. Placez la souris anesthésiée en position couchée à l’intérieur d’une hotte chimique.
Ouvrez la peau le long de la ligne médiane thoracique. Séparez ensuite le diaphragme et ouvrez la poitrine avec des ciseaux. Insérez maintenant une aiguille d’un calibre 22 et demi dans le ventricule gauche.
Ouvrez l’oreillette droite avec des ciseaux. Perfuser l’oreillette droite avec 50 millilitres de PBS 100 millimolaires pré-refroidi, puis perfuser avec 100 millilitres de paraformaldéhyde pré-refroidi à 4 %. Retirez tout le cerveau de la souris.
Après avoir fixé le cerveau dans du paraformaldéhyde à 4 %, fixez le tissu cérébral à l’aide d’un adhésif tissulaire sur la plate-forme métallique du Vibratome. Coupez des sections coronales de 50 micromètres d’épaisseur avec des lames en acier au carbone. Ensuite, placez les tranches de cerveau sur des lames de verre à l’aide d’un pinceau.
Ajoutez immédiatement 0,1 millilitre de support de montage anti-décoloration à chaque section. Placez une gaine de 22 x 50 millimètres sur les sections cérébrales et faites sécher les lames Superfrost dans l’obscurité pendant une journée. Le lendemain, utilisez un microscope confocal de 488 nanomètres et 594 nanomètres de longueurs d’onde pour acquérir des images multicanaux de la région cérébrale d’intérêt.
Les signaux EcoHIV-mScarlet ont été principalement observés dans les cellules microgliales marquées avec EGFP dans le cerveau de souris Tmem119-EGFP. Aucune infection neuronale significative n’a été détectée dans les cellules cérébrales de rat en culture traitées avec EcoHIV-mScarlet.
